ES A1. Número de publicación: PATENTES Y MARCAS. Número de solicitud: Int. Cl. 7 : A61K 7/28

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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 k Número de publicación: k Número de solicitud: k Int. Cl. 7 : A61K 7/28 k 12 SOLICITUD DE PATENTE A1 k 22 Fecha de presentación: k 71 Solicitante/s: UNIVERSITAT DE LES ILLES BALEARS Campus Universitario, Cr. Valldemosa, Km. 7,5 Edif. Son Lledó Palma de Mallorca, Baleares, ES LABORATORIOS KIN, S.A. k 43 Fecha de publicación de la solicitud: k 72 Inventor/es: Pons Biescas, Antonio; Tur Mari, Josep Antoni; Riutord Sbert, Pere; Tauler Riera, Pedro; Gimeno Franco, Isabel; Balasch Risueño, Ignacio y Sancho Riera, Enriqueta k 43 Fecha de publicación del folleto de la solicitud: k 74 Agente: Curell Suñol, Marcelino k 54 Título: Producto para el blanqueamiento dental. ES A1 k 57 Resumen: Producto para el blanqueamiento dental. Junto a otros componentes accesorios comprende un compuesto blanqueante de dientes y peroxidasa como producto de combinación para una utilización simultánea, separada o escalonada en el tiempo. En una realización preferida, el compuesto blanqueante es peróxido de hidrógeno o un precursor de peróxido de hidrógeno. El producto es útil para la decoloración de dientes, pudiéndose aplicar en forma de dentífricos, colutorios o tratamientos dentales. Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 ES A1 2 DESCRIPCION Producto para el blanqueamiento dental. Campo técnico de la invención La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de los dentífricos y colutorios y, en especial, se refiere a dentífricos y colutorios capaces de producir blanqueamiento dental. Algunos de los dentífricos y colutorios que se utilizan para el blanqueamiento dental se fundamentan en la acción del peróxido de hidrógeno o de un precursor de peróxido de hidrógeno como agente blanqueante inespecífico. En algunas ocasiones, además del propio agente blanqueante se utilizan temperaturas relativamente elevadas o incluso la luz para acelerar el proceso. Hasta el momento, no se ha descrito la utilización de enzimas para acelerar el proceso de decoloración. La presente invención se refiere a la utilización de enzimas como catalizadores de la reacción de decoloración y puede encontrar aplicación en el campo del blanqueamiento dental. Las enzimas que se pueden utilizar son aquellas que utilizan peróxido de hidrógeno como uno de sus substratos, para el cual son específicas, siendo inespecíficas para su otro substrato. Esta invención es aplicable a la formulación de pastas dentífricas, colutorios y preparaciones similares utilizables en las consultas de dentista o en forma ambulatoria o como base para la higiene diaria de los dientes y que tengan por objeto producir un blanqueamiento de los dientes. Estado de la técnica anterior a la invención El blanqueamiento dental es una técnica que en la actualidad va adquiriendo una gran demanda como consecuencia del culto a la estética que impera en nuestros días. Sin embargo, las primeras publicaciones en las que se explica algún procedimiento para producir blanqueamiento dental datan del siglo pasado. En el año 1877 se publicó por primera vez la utilización de ácido oxálico como agente blanqueante (Zaragoza, V.M.T. Bleaching of vital teeth:technique. Estomodeo. 1984, 9, 7-30). En 1884 es cuando por primera vez se describe la utilización del peróxido de hidrógeno como agente blanqueante de dientes (Freinman, R., Goldstein, R., Garber, D. Bleaching teeth. Quintessence Int. 1987, 1, 10). Garretson utiliza en 1895 la clorina como agente blanqueante de dientes no vitales (Garretson, J.E. A system of oral surgery. 6 th Ed. Philadelphia: JB Lippincott, 1985) y Walter Kaine utiliza el ácido muriático (ClH 18 %). En 1918 Abbot redescubre la utilización del peróxido de hidrógeno como agente blanqueante, utiliza una concentración elevada (35 %) y además una fuente de luz (Zaragoza, ver referencia más arriba-). A lo largo del siglo XX se ha venido utilizando en consulta de dentista el peróxido de hidrógeno concentrado para el blanqueamiento dental, incluso para el blanqueamiento de dientes coloreados con tetraciclinas (Cohen, S., Parkins, F.M. Bleaching tetracycline-stained vital teeth. Oral Surg. 1970, 29, ). En la actualidad se ha venido imponiendo el tratamiento domiciliario con peróxido de hidrógeno o con preparados a partir de éste, en concentraciones más diluidas que no implican la necesidad de una aplicación por especialista (Hay wood, V.B., Heymann, H.O.Nightguard vital bleaching. Quintessence Int. 1989, 20, ). El peróxido de hidrogeno es un agente oxidante relativamente estable en ausencia de metales de transición. Así, en ausencia de metales de transición,elperóxido de hidrógeno reacciona con algunos compuestos orgánicos, dando lugar a reacciones de epoxidación y de hidroxilación de alquenos, a reacciones de oxigenación de aminas y sulfidas, y a la formación de peroxiácidos y de hidroperoxiácidos a partir de ácidos carboxílicos y de otros compuestos orgánicos; sin embargo el peróxido de hidrógeno no reacciona con otras moléculas orgánicas como por ejemplo los alcanos. La reactividad del peróxido de hidrógeno se encuentra grandemente incrementada por la presencia de metales de transición. En presencia de metales de transición como el hierro o el cobre o bien de complejos de transición obtenidos a partir de éstos, como por ejemplo el grupo hemo o hemina o los citocromos, el peróxido de hidrógeno produce el radical hidroxilo, especie extremadamente reactiva que puede oxigenar cualquier compuesto orgánico. El incremento en la reactividad del peróxido de hidrógeno producido por estos catalizadores va acompañado además por una mayor selectividad de la reacción. Por ejemplo, la reacción del peróxido de hidrogeno con olefinas en presencia del citocromo P-450, una monooxigenasa que contiene un hierro hemínico, resulta en la formación exclusiva de un epóxido. Los productos de la peroxidación con agua oxigenada no son estables y en muchos casos pueden seguir reaccionado, dando lugar a roturas de cadena y a la producción de compuestos incoloros. Esta es la base de la decoloración con peróxido de hidrogeno. De hecho el peróxido de hidrógeno puede ser considerado como un agente iniciador de procesos de autooxidación siguiendo un esquema de reacción en cadena. La autooxidación de aldehidos y de compuestos poliinsaturados como los ácidos grasos es un proceso frecuente que modifica las características organolépticas y nutricionales de los alimentos y que se encuentra en la base del desarrollo de patologías de alta incidencia en la población de nuestros días como es el caso de la aterosclerosis, cataratas, algunos cánceres, etc. La utilización de concentraciones altas de peróxido de hidrógeno (por ejemplo una concentración de peróxido de carbamida del 10 %) para producir blanqueamiento dental no afecta a la textura del esmalte, aunque en general conlleva una serie de efectos secundarios, que si bien no son graves ni suficientes para ser excluyentes de su aplicación, sí que generan molestias en los usuarios. Los tratamientos blanqueantes producen una mayor sensibilidad temporal a los cambios de temperatura por efecto de la acción de los radicales libres que suele desaparecer a los pocos días. También suelen provocar una disminución de la adhesión de los composites y un blanqueamiento de partes que no están directamente en contacto con la disolución blanquedora. El agente blanqueante genera irritación gingival, lengua vellosa, garganta irritada y, como consecuencia de su ingestión involuntaria, también ge-

3 3 ES A1 4 nera estómago irritado. Una causa importante de estos efectos secundarios es precisamente la necesidad de utilizar concentraciones elevadas del agente blanqueante. La disminución de la concentración del agente blanqueante, manteniendo los efectos blanqueantes, sería una buena innovación en el campo del blanqueamiento dental. Las enzimas son catalizadores de naturaleza proteica que producen una disminución de la energía de activación necesaria para que los substratos den lugar a los productos de la reacción. Las enzimas presentan un elevado poder catalítico, mucho más elevado que cualquier catalizador químico. Por otro lado, las enzimas presentan generalmente un elevado grado de selectividad de reacción y de substrato, que les capacita para poder dirigir la transformación selectiva de las substancias hacia determinados productos aún en presencia de mezclas de substancias de estructura muy similar. Dicha especificidad de acción y de substrato puede matizarse en el sentido de que algunas enzimas admiten en su centro catalítico la entrada y la posterior transformación de diferentes substratos que presenten unas determinadas características similares. Este es el caso de las proteasas, enzimas que catalizan específicamente la hidrólisis de enlaces peptídicos pero que pueden tener como substrato diferentes proteínas. Así por ejemplo, la papaína agregada a un dentífrico blanqueante puede hidrolizar un número elevado de proteínas diferentes que puedan encontrarse adheridas al diente. Otras enzimas que presentan unas características de especificidad no excluyente son las peroxidasas. El término peroxidasas comprende un grupo de enzimas específicas (NAD-peroxidasa, ácido graso-peroxidasa, citocromo-peroxidasa, glutatión - peroxidasa, etc.) asícomoaungrupodeenzimas no específicas, conocidas simplemente como peroxidasas (EC ). Las peroxidasas catalizan la deshidrogenación de un número elevado de compuestos orgánicos aromáticos como fenoles, hidroquinonas y aminas hidroquinoides. Las peroxidasas son hemoproteínas que catalizan la transferencia de hidrógeno o electrones desde un donador hasta un aceptor, generalmente peróxido de hidrógeno. La especificidad de las peroxidasas por el donador es muy baja, en cambio es alta para el aceptor, que tan sólo puede ser peróxido de hidrógeno, o en algunos casos hidropropóxido de acetilo, metilo o etilo. Las peroxidasas pueden extraerse de diferentes fuentes animales, vegetales o de microorganismos como por ejemplo, de rábano, piña, patata, legumbres, tabaco, levaduras y bacterias. Existen por tanto diferentes isoformas enzimáticas de las peroxidasas. Las características de las reacciones catalizadas por las peroxidasas las facultan para ser utilizadas como blanqueantes de diferentes tipos de productos. Así se introducen o se aprovecha la presencia de las peroxidasas en los procedimientos de blanqueamiento de pinturas, blanqueamiento de alimentos, detergentes, etc. Descripción detallada de la invención La presente invención se refiere a la utilización de peroxidasa como biocatalizador de los procesos de blanqueamiento de los dientes en los que se utilice peróxido de hidrógeno o un precursor de peróxido de hidrógeno como agente blanqueante. La presente invención se refiere también a la formulación de dentífricos, colutorios y tratamientos blanqueantes dentales en los que se utilice la peroxidasa como enzima de la reacción de decoloración que se produzca. La idea de utilizar peroxidasa en los tratamientos de blanqueamiento dental tiene gran interés porque permite disminuir el tiempo necesario de contacto del agente blanqueante con el diente así como utilizar concentraciones más diluidas de agente blanqueante. La decoloración del diente se produce cuando entran en contacto el agente blanqueante con la substancia causante del color indeseado del diente. Como consecuencia se produce una reacción en la que los substratos con color se transforman en productos incoloros. En presencia de peroxidasa la reacción de decoloración se encuentra acelerada, generándose los productos incoloros en un tiempo menor. La inespecificidad de la peroxidasa la capacita para poder catalizar la reacción de un mismo agente blanqueante o aceptor con una diversidad de substancias coloreadas donadoras, entre ellas las tetraciclinas, una de las principales causas de coloración dental de difícil eliminación. La presente invención se refiere también a un procedimiento para el blanqueamiento de dientes mediante la aplicación de un producto que comprende un compuesto blanqueante de dientes y peroxidasa. Sin embargo en todos los casos el momento en que el agente blanqueante entre en contacto con la enzima debe ser el mismo momento en que ambos entren en contacto con el diente. Para ello deben mantenerse separados la enzima y el agente blanqueante y mezclarse inmediatamente antes de utilizarse para el blanqueamiento dental. También es posible aplicar primeramente el agente blanqueante en boca y, acto seguido introducir en boca la peroxidasa o viceversa. En una realización preferida de la presente invención, dicho procedimiento comprende las siguientes etapas: (a) Mantener por separado dicho compuesto blanqueante y dicha enzima hasta el momento de aplicación del producto; (b) Mezclar dicho compuesto blanqueante y dicha peroxidasa inmediatamente antes de aplicar el producto; y (c) Aplicar la mezcla de dicho compuesto blanqueante y dicha peroxidasa en los dientes. En otra realización preferida de la presente invención, dicho procedimiento comprende las siguientes etapas: (a) Mantener por separado dicho compuesto blanqueante y dicha enzima hasta el momento de aplicación del producto; (b) Aplicar en primer lugar dicho compuesto blanqueante en los dientes; y (c) Aplicar acto seguido dicha peroxidasa. 3

4 5 ES A1 6 En otra realización preferida de la presente invención, dicho procedimiento comprende las siguientes etapas: (a) Mantener por separado dicho compuesto blanqueante y dicha enzima hasta el momento de aplicación del producto; (b) Aplicar en primer lugar dicha peroxidasa en los dientes; y (c) Aplicar acto seguido dicho compuesto blanqueante. Las condiciones más adecuadas para poder efectuarse el blanqueamiento dental de acuerdo con un procedimiento según la invención, se describen a continuación: Tampón: Es conveniente que el ph de la reacción esté tamponado a un valor comprendido entre 4 y 9, preferentemente a un valor de 6,5. El ph más adecuado en cada caso concreto dependerá dela forma isoenzimática de peroxidasa que se utilice y del tipo de coloración que presente el diente. Pueden emplearse diferentes substancias tamponantes, preferentemente tampón fosfato. Dicha substancia tamponante debe estar permitida para utilización en boca. En principio, cualquier substancia tamponante permitida para uso en boca puede utilizarse dentro del alcance de la presente invención, puesto que no se han descrito efectos inhibidores de este tipo de substratos. Agente blanqueante: el agente blanqueante es uno de los substratos de la enzima, siendo el otro substrato la sustancia colorante del diente. Como agente blanqueante puede utilizarse directamente peróxido de hidrógeno o un precursor de peróxido de hidrógeno, es decir, un compuesto que por reacción genera peróxido de hidrógeno. Preferentemente se utiliza como agente blanqueante peróxido de carbamida, un adhucto de urea y peróxido de hidrogeno que libera gradualmente el peróxido de hidrogeno, verdadero substrato de la enzima. Dentro del grupo de precursores de peróxido de hidrógeno se incluye toda una serie de reacciones catalizadas por enzimas que producen como producto principal o secundario el peróxido de hidrogeno. Entre estas reacciones se encuentran las catalizadas por enzimas como la glucosa oxidasa (EC ), xantina-hipoxantina oxidasa (EC ), ascorbato oxidasa (EC ) y otras oxidasas. En estos casos las concentraciones de substrato, enzima y tampón pueden ajustarse de forma que la generación del peróxido de hidrogeno se acople a su utilización por parte de la peroxidasa, produciéndose así el blanqueamiento dentario de manera óptima. La concentración de peróxido de hidrogeno efectiva debe ajustarse con relaciónalacantidad de enzima presente. Hemos comprobado que una alta concentración de peróxido de hidrógeno produce la desactivación de la enzima. De esta forma es preciso ajustar la concentración de enzima presente en función de la concentración de peróxido de hidrógeno utilizada o al revés. A modo de ilustración de la afirmación anterior, sin que las cantidades que a continuación se detallan sean limitantes del alcance de la presente invención, para una concentración de peróxido de carbamida de 0,09 Mlaadición de peroxidasa a una concentración final de 40 unidades pirogallol/ml produce un aumento de la velocidad de decoloración de una disolución de tetracilina (0,015M) de aproximadamente 2,5 veces. En cambio, la utilización de una concentración de peróxido de carbamida 0,17M con una adición de 20unidades de pirogallol/ml de peroxidasa tan solo produce un aumento de la velocidad de decoloración de una disolución de tetraciclina 0,015M de aproximadamente 1,3 veces. Peroxidasa: la peroxidasa que puede utilizarse para producir el blanqueamiento dental puede obtenerse tras un proceso de purificación o bien directamente después de su extracción de la fuente que lo genera. Esta enzima presenta una gran distribución en la naturaleza, pudiéndose encontrar tantodefuentevegetal,animaloapartirdemicroorganismos. Dentro del alcance de la presente invención, puede utilizarse cualquier isoforma de la peroxidasa, proviniendo dicha peroxidasa de cualquier fuente vegetal, animal o de microorganismo, siendo preferentemente la peroxidasa de rábano. A modo ilustrativo no limitativo de la presente invención, utilizando peroxidasa de rábano (20 unidades pirogallol/ml), ph 6,5 tamponado con fosfatos y una concentración de peróxido de carbamida 1,5 % se ha conseguido aumentar el valor de luminosidad de un diente desde un valor del 64 % antes del tratamiento a un valor del 74 % después de tratamiento; mientras que si la peroxidasa no está presente el mismo tipo de tratamiento en el mismo tiempo no modifica la luminosidad del 64 % del diente. La concentración de peroxidasa que se utiliza en la presente invención es aquella que proporciona como mínimo una actividad de 10 unidades de pirogallol, preferentemente como mínimo 20 unidades de pirogallol(una unidad de pirogallol es la cantidad de enzima necesaria para transformar 1mg de pirogallol en purpurogallin en 20 segundos a ph 6,0 y a una temperatura de 20 C). La utilización de una peroxidasa en concreto implica la caracterización previa de la estabilidad, ph óptimo, concentración de substrato, concentración de enzima, presencia de activadores y exclusión de inhibidores o desactivadores. Vehículo de introducción: el vehículo de introducción del agente blanqueante, del medio tamponado y de la enzima depende del tipo de producto otécnica (dentífrico, colutorio, blanqueantes dentales de uso en consulta de dentista) que quiera utilizarse. El vehículo a utilizar no debe contener inhibidores o desactivadores de la enzima, en cambio debe contener todas aquellas sustancias que puedan ser activadoras de la enzima. La enzima puede estar disuelta en el vehículo o bien puede estar inmovilizada o microencapsulada para preservar su estabilidad. La inmovilización de la enzima puede llevarse a cabo mediante la técnica de atrapado en geles o en polímeros, o por entrecruzamiento con otras proteínas o otros materiales solubles o insolubles del vehículo, o por microencapsulación. La forma de introducción de la enzima en la boca tiene que armonizarse con el efecto que el

5 7 ES A1 8 vehículo concreto puede ejercer sobre la estabilidad de la enzima. En este último caso, el efecto desactivador o inhibitorio que puede ocasionar el vehículo o el tiempo de permanencia de la enzima dentro del vehículo tiene que compensarse con un aumento inicial de la cantidad de enzima a utilizar. Así, la forma de introducción de la peroxidasa y de los agentes blanqueantes debe ser tal que se asegure al menos una actividad peroxidasa como mínimo de 10 unidades de pirogallol, preferentemente como mínimo de 20 unidades de pirogallol. Breve descripción de las figuras Las figuras 1 y 2 son representaciones de la velocidad de decoloración de tetraciclinas en función de la concentración de peróxido de carbamida presente. La figura 1 corresponde a bajas concentraciones de peróxido de carbamida, mientras que la figura 2 corresponde a concentraciones elevadas de peróxido de carbamida. Las figuras 3 y 4 son representaciones de la velocidad de decoloración de tetraciclinas en función de la concentración de peroxidasa, en presencia de peróxido de carbamida a altas o bajas concentraciones, respectivamente. Las figuras 5 y 6 son representaciones comparativas del porcentaje de luminosidad del diente en función del tiempo, para dientes blanqueados en ausencia o presencia de enzima. La figura 5 contempla tiempos cortos, mientras que la figura 6 contempla tiempos largos. Modos de realización de la invención La presente invención se ilustra mejor mediante los siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitadores de su alcance, el cual viene definido única y exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. Así, por ejemplo las concentraciones concretas de enzima, tampón y agente blanqueante descritas en los ejemplos pueden extenderse a otras concentraciones. Donde se ha utilizado una determinada isoforma de peroxidasa, pueden utilizarse otras isoformas procedentes de cualquier fuente vegetal, animal o de microorganismo. Donde se ha utilizado un colutorio puede extenderse a cualquier dentífrico o producto blanqueante dental que utilice peroxidasa. Donde se ha utilizado un vehículo con una composición determinada puede utilizarse otro vehículo compatible con la peroxidasa. Donde se ha utilizado una técnica odontológica determinada para el blanqueamiento dental en el que se utilice peroxidasa puede utilizarse otra técnica diferente basada también en el uso de la peroxidasa. Ejemplo 1 Este ejemplo ilustra la acción de un colutorio diseñado en base a la utilización de peroxidasa para decolorar una disolución de tetraciclina. Así mismo ejemplifica la existencia de limitaciones en la concentración de peróxido de carbamida eficaz para decolorar la tetraciclina. El colutorio consiste en una disolución de peróxido de carbamida 2,4 % en tampón fosfato 0,1M ph 6,5 y por otro lado una disolución de peroxidasa (120 unidades pirogallol/ml) en tampón fosfato 0,1M ph 6,5 que se introduce en el recipiente en el que tiene que producirse la reacción de decoloración inmediatamente después del colutorio La substancia a decolorar es tetraciclina que se encuentra solubilizada en agua a una concentración de 0,015 M. Se ha elegido la longitud de onda del máximo de absorción de la tetraciclina para efectuar el seguimiento de la velocidad de decoloración. La velocidad de decoloración se determina utilizando un espectrofotómetro que permite el seguimiento de la absorción en continuo, estando la cubeta de reacción termostatizada a 37 C. A partir de las relaciones entre variación de absorbancia y el tiempo de reacción se han calculado las velocidades de reacción de decoloración y se han expresado en nkat. En la cubeta de reacción se introducen las cantidades necesarias de disolución de tetraciclina, colutorio y enzima (por este orden) para conseguir las combinaciones de parámetros con los que se pretende valorar la capacidad de blanqueamiento de la enzima. El colutorio por si sólo decolora una disolución de tetraciclina en ausencia de peroxidasa como se representa en la figura 1. La velocidad de decoloración de la disolución de tetracilina es directamente proporcional a la concentración de peróxido de carbamida presente. Esta relación sigue una ecuación de primer orden en la que la velocidad de decoloración se relaciona con la concentración de peróxido de carbamida mediante una recta de pendiente de 7,93 nkatxl/mol y una ordenada en el origen de -2,6 nkat (coeficiente de regresión lineal=0,9656). Sin embargo a concentraciones elevadas de peróxido de carbamida esta relación lineal se quiebra (Figura 2). La relación existente entre la velocidad de decoloración de la tetraciclina y la concentración de peróxido decarbamidaeslatípica de saturación a partir de una concentración de peróxido de carbamida de aproximadamente 0,70M. A partir de esta concentración no aumentamos la velocidad de decoloración de tetraciclina por mucho que aumentemos la concentración de peróxido de carbamida. La adición de peroxidasa al colutorio en el momento de entrada en contacto con la substancia colorante produce un aumento de la velocidad de decoloración que esta en función de la concentración de enzima y de peróxido de carbamida presente (Figuras 3 y 4). Cuando la concentración de peróxido de carbamida es 0,17M (Fig 3) se precisan cantidades de peroxidasa más altas que cuanto la concentración de peróxido de carbamida es 0,09M (Fig 4). La adición de peroxidasa hasta conseguir una actividad final de 4 unidades pirogallol/ml prácticamente no modifica la velocidad de decoloración de una disolución de tetraciclina 0,015M por el colutorio; sin embargo, con una actividad peroxidasa de 20 unidades pirogallol/ml la velocidad de decoloración de una disolución de tetraciclina (0,015M) por el colutorio (0,17M, concentración final de peróxido de carbamida) pasa de aproximadamente 70nKat a 95nKat debido a la presencia de la peroxidasa. Esta activación debido a la peroxidasa es incluso mayor cuando la concentración de colutorio es menor. Así, la adición de colutorio (0,09M de peróxido de carbamida, concentración final) a la disolución de tetraciclina (0,015M) produce una velocidad de decoloración de aproximadamente 40nkat; la adición de 20 unidades pirogallol/ml de peroxidasa aumenta 5

6 9 ES A1 10 esta velocidad de decoloración hasta aproximadamente 70nkat, y si la concentración de peroxidasa es de 40 unidades pirogallol/ml la velocidad de decoloración pasa a ser aproximadamente 110nkat, mucho mayor que en el caso de utilizar tan sólo el colutorio aún a concentraciones que doblan la utilizada en esta experiencia. Ejemplo 2 Este ejemplo ilustra la acción blanqueante de un colutorio diseñado en base a la utilización de peroxidasa para producir la decoloración de dientes. El tiempo de tratamiento es largo, equivalente a periodos de exposición de una noche o de un día entero. La composición del colutorio y de la disolución de peroxidasa son como la del ejemplo 1, en este caso se pusieron en contacto unos volúmenes de cada disolución de manera que la concentración final en contacto con el diente fue de 1,5 % de peróxido de carbamida y de 120unidades pirogallol/ml de peroxidasa. La aplicación del colutorio y de la enzima puede ser directamente sobre el diente fuera de la boca. Este ha sido el caso utilizado en este ejemplo, aunque también puede realizarse aplicando directamente el colutorio en boca, utilizando unas cubetas preformadas con contacto únicamente en la corona dentaria con lo que se garantiza que la acción blanqueante se produzca sobre el diente. La decoloración de los dientes se ha seguido utilizando un colorímetro para sólidos (marca Minolta) con el que se han medido la luminosidad del diente en porcentaje, en una escala de 0 % a 100 % de oscuro a luminoso. El tiempo de contacto de los dientes con las disoluciones blanqueantes fue largo de manera que cada vez que se efectuaba una medida de la luminosidad del diente se renovaban las disoluciones blanqueantes. Los tiempos de medida de la luminosidad, además del momento inicial en los dientes sin tratar, fueron a las 8 horas, 24 horas, 48 horas y 72 horas desde el inicio de la experiencia. La decoloración del diente se produce primero cuando la enzima está presente que cuando está ausente (Fig 5). Utilizando como modelo dos dientes que presentaban inicialmente el mismo valor de luminosidad (64 %), un diente se trató sólo con colutorio y al otro diente se le añadió además la disolución de enzima. El diente que tan sólo tenia colutorio mantuvo el valor de luminosidad del 64 % a las 8, 24 y 48 horas, decoloreándose ligeramente a las 72 horas en que presentaba un valor de luminosidad de aproximadamente el 66 %. Sin embargo el diente que se trataba con colutorio y peroxidasa a las 8 horas de tratamiento ya se decoloraba y conseguía un valor de luminosidad de aproximadamente el 66 %, la decoloración continuaba a las 24 y 48 horas con valores de luminosidad de aproximadamente el 68 % y del 72 % respectivamente, valor máximo de blanqueamiento conseguido. Entre las 48 y las 72 horas no se produjo ninguna variación de la luminosidad del diente Ejemplo 3 Este ejemplo ilustra la acción de un colutorio diseñado en base a la utilización de peroxidasa para producir la decoloración de dientes. El tiempo de tratamiento es corto, de pocos minutos por lo que puede ser de aplicación en consulta de dentista o bien durante la higiene diaria de los dientes. La composición del colutorio y de la disolución de peroxidasa es la misma que en el ejemplo 1. Las concentraciones finales de peroxidasa y de peróxido de carbamida en contacto con el diente son las mismas que las del ejemplo 1 y ejemplo 2. Estas concentraciones finales se pueden obtener también a partir de otras concentraciones iniciales de colutorio y de disolución de enzima o, incluso a partir de un dentífrico cuya composición seaadecuadaparamantenerlaenzimaactivayde un colutorio con el peróxido de carbamida que se puede utilizar para enjuagar los dientes después de limpiarlos con el dentífrico con enzima. Así mismo, las condiciones finales de concentración de peroxidasas y de peróxido de carbamida se pueden obtener a partir de la elaboración de un gel que contenga la enzima activa y de otro gel que contenga el peróxido de carbamida. Antes de su aplicaciónsobreeldienteseprocederá a la mezcla de los dos geles en cantidades adecuadas a la concentración de sus principios activos a fin de conseguir las concentraciones ensayadas en este ejemplo. El tiempo de contacto de la peroxidasa y del peróxidodecarbamidaconeldienteesde5minutos. El tratamiento continuado de dientes durante periodos de 5 minutos con peróxido de carbamida y peroxidasa produce su blanqueamiento, mientras que si se utiliza tan sólo peróxido de carbamida el blanqueamiento se retrasa y no alcanza valores tan altos (Fig 6).Partiendo de cinco dientes con un valor inicial de luminosidad del 62 %, tratando 3 dientes de forma individual con el colutorio y la disolución de enzima y otros dos tan solo con el colutorio, el blanqueamiento empieza a observarse en los dientes tratados con peroxidasa al cabo de 4 periodos de cinco minutos de tratamiento (luminosidades de los dientes de 64 % y 67 %), mientras que en los que no tienen peroxidasa el blanqueamiento se hace evidente al cabo de 5 periodos de tratamiento (luminosidades de los dientes de 64 % y 65 %). En periodos sucesivos de tratamiento con peroxidasa la luminosidad de los dientes sigue aumentando hasta presentar el valor del 68 %-69 %, mientras que los que no están tratados con enzima el blanqueamiento se estabiliza en el 64 % o bien sube ligeramente hasta el 68 %. La variabilidad en las respuestas de los dientes frente a la acción blanqueante de la enzima puede deberse a la existencia de diferentes tipos de agentes colorantes en los dientes, aunque en todos los casos hemos conseguido una mayor eficacia blanqueante cuando está presentelape- roxidasa. 6

7 11 ES A1 12 REIVINDICACIONES 1. Producto que comprende un compuesto blanqueante de dientes y peroxidasa como producto de combinación para una utilización simultánea, separada o escalonada en el tiempo. 2. Producto según la reivindicación 1, que comprende además una substancia tamponante, preferentemente tampón fosfato. 3. Producto según la reivindicación 2, donde el ph de la reacción se encuentra tamponado entre un valor de 4 a 9, preferentemente 6,5. 4. Producto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además substancias activadoras de dicha peroxidasa. 5. Producto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el compuesto blanqueante de dientes es peróxido de hidrógeno. 6. Producto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el compuesto blanqueante de dientes es un precursor de peróxido de hidrógeno, preferentemente peróxido de carbamida. 7. Producto según la reivindicación 6, que comprende además una enzima para catalizar la liberación de peróxido de hidrógeno a partir de dicho precursor de peróxido de hidrógeno. 8. Producto según la reivindicación 7, donde dicha enzima es una oxidasa, preferentemente glucosa oxidasa (EC ), xantina-hipoxantina oxidasa (EC ) o ascorbato oxidasa (EC ). 9. Producto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la actividad peroxidasa es como mínimo de 10 unidades de pirogallol, preferentemente como mínimo de 20 unidades de pirogallol. 10. Producto según la reivindicación 1, donde dicha peroxidasa es cualquier isoforma enzimática de peroxidasa, procediendo dicha peroxidasa de una fuente vegetal, de una fuente animal o de un microorganismo, preferentemente de rábano. 11. Procedimiento para la aplicación del producto según la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas: (d) Mantener por separado dicho compuesto blanqueante y dicha enzima hasta el momento de aplicación del producto; (e) Mezclar dicho compuesto blanqueante y dicha peroxidasa inmediatamente antes de aplicar el producto; y (f) Aplicar la mezcla de dicho compuesto blanqueante y dicha peroxidasa en los dientes. 12. Procedimiento para la aplicación del producto según la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas: (d) Mantener por separado dicho compuesto blanqueante y dicha enzima hasta el momento de aplicación del producto; (e) Aplicar en primer lugar dicho compuesto blanqueante en los dientes; y (f) Aplicar acto seguido dicha peroxidasa. 13. Procedimiento para la aplicación del producto según la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas: (d) Mantener por separado dicho compuesto blanqueante y dicha enzima hasta el momento de aplicación del producto; (e) Aplicar en primer lugar dicha peroxidasa en los dientes; y (f) Aplicar acto seguido dicho compuesto blanqueante. 14. Formulación que comprende un producto según la reivindicación 1, donde la peroxidasa está disuelta o emulsionada en un vehículo. 15. Formulación que comprende un producto según la reivindicación 1, donde la peroxidasa está inmovilizada o microencapsulada en un vehículo. 16. Formulación según la reivindicación 13 ó 14, donde dicho vehículo es un colutorio, un dentífrico o un gel. 17. Utilización de un producto según la reivindicación 1 para la decoloración de dientes. 18. Utilización de peroxidasa como catalizador de las reacciones de decoloración de dientes en los que se utilice un agente blanqueante. 19. Utilización de peroxidasa según la reivindicación 18, donde el agente blanqueante es peróxido de hidrógeno. 20. Utilización de peroxidasa según la reivindicación 18, donde el agente blanqueante es un precursor de peróxido de hidrógeno

8 8 ES A1

9 ES A1 9

10 10 ES A1

11 ES A1 11

12 12 ES A1

13 ES A1 13

14 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA k 11 ES k 21 N. solicitud: k 22 Fecha de presentación de la solicitud: k 32 Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA k 51 Int. Cl. 7 : A61K 7/28 DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría Documentos citados Reivindicaciones afectadas X WO A1 (NOVONORDISK) , página 13, líneas 25-30; 1-5,8, reivindicaciones. 10,17-19 X US A (PELLICO, MICHAEL et al.) , 1,8 todo el documento, en particular ejemplo 4. X US A (PELLICO, MICHAEL et al.) , columna 3, 1,8 ejemplo II. A US A (HOOGENDOORN, HENDRIK et al.) , 8 todo el documento. A US A (HOOGENDOORN, HENDRIK et al.) , 8 todo el documento. A US A (PELLICO, MICHAEL et al.) , 8 todo el documento. Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado para todas las reivindicaciones para las reivindicaciones n : Fecha de realización del informe Examinador Página Fco. J. Haering Pérez 1/1