Proyecto de investigación Concurso de profesor agregado, enero Química Analítica del DNA cuádruple - Analytical Chemistry of Quadruplex DNA

Transcripción

1 1. Título de la línea de investigación Química Analítica del DNA cuádruple - Analytical Chemistry of Quadruplex DNA 2. Resumen de la línea de investigación La línea de investigación que se presenta se sitúa en la intersección de las áreas de conocimiento de la Química Analítica y de la Biofísica, lo que se podría denominar "Biofísica analítica. Bajo este título se combinan las dos características más destacables de la línea de investigación propuesta: la aplicación de la metodología propia ("know-how") del trabajo experimental en Química Analítica al estudio de procesos que, tradicionalmente, se han considerado objeto de investigación de la Biofísica. En concreto, se pretende estudiar desde una óptica analítica: la estabilidad de las estructuras complejas de ADN cuádruple frente a cambios en el ph, temperatura, fuerza iónica y naturaleza de los iones metálicos, y la influencia que determinados compuestos con potencial interés biomédico pudieran tener sobre dichas estructuras. 3. Introducción: antecedentes y estado actual 3.1. Estructuras de ADN formadoras de hélices triples y cuádruples En los últimos años, la Biología Molecular y la Genética han experimentado avances sorprendentes, fruto del creciente conocimiento de las biomoléculas relacionadas con la información genética. La mayoría de los aspectos relacionados con esta información tiene su origen en los vehículos portadores de ésta que son los ácidos nucleicos. Así, los ácidos ribonucleicos (ARN) y los ácidos desoxirribonucleicos (ADN) tienen un papel determinante en la duplicación celular (como vehículo de transmisión de la información genética) y en la síntesis de proteínas. La mayor parte del ADN presente en el genoma humano está en forma de hélice o cadena doble (Figura 1), que es la estructura más conocida y la primera que se caracterizó en la década de los cincuenta. Además de esta estructura, existen otras más complejas que pueden existir únicamente in vitro o también en una cantidad minoritaria in vivo. A menudo, no se conoce su papel biológico pero, aún así, la investigación en este campo es muy activa, como se puede deducir en el número y calidad de los trabajos recientemente publicados (como ejemplo, los trabajos de Ourliac-Garnier, 2005; Kankia, 2005; o Granotier, 2005). Las helices tríples y cuádruples se encuentran en este grupo de estructuras complejas. 1

2 Figura 1. Estructura típica del ADN de cadena doble mostrando las cuatro bases nitrogenadas presentes en el ADN: adenina y guanina (bases purínicas) y timina y citosina (bases pirimidínicas). Los pares de bases que estabilizan la estructura de hélice doble se denominan de Watson-Crick y corresponden a los pares de bases adenina timina y guanina citosina. Las estructuras de hélice triple ya se describieron por vez primera al final de la década de los cincuenta en experimentos con homopolínucleótidos sintéticos (polinucleótidos que contienen un único tipo de base nitrogenada), pero no es hasta el final de la década de los ochenta que se comienzan a estudiar en profundidad. En la actualidad, se conoce que la s hélices triples se pueden formar sobre tramos de ADN de cadena doble que muestran una secuencia específica de bases nitrogenadas (Figura 2). Estos tramos pueden representar hasta un 1% del genoma total y están presentes en la secuencia de numerosos genes. En las hélices triples, un oligonucleótido (secuencia corta de ADN que contiene menos de veinte bases, aproximadamente) se une a la región del ADN de cadena doble, en la que una de las cadenas es ricas en bases purínicas y la otra en bases pirimidínicas, de manera paralela o antiparalela. En ambos casos, esta unión puede dificultar o incluso inhibir la expresión del gen contenido en el tramo de ADN de cadena doble. De esta manera, los oligonucleótidos formadores de hélices triples (Triplex Forming Oligonucleotides, T FO) constituyen uno de los pocos ejemplos de compuestos capaces del reconocimiento específico de ADN de cadena doble con capacidad de una posible utilización para la inhibición específica de genes. La utilización de los oligonucleótidos formadores de hélices triples en la regulación de la expresión génica se ha convenido en llamar estrategia "antigen" o terapia antigénica para diferenciarla de la utilización de oligonucleótidos para bloquear el RNA mensajero que se ha denominado estrategia "antisentido" [Praseuth, 1999; Frank-Kamenetskii, 1995; Sun, 1996]. Las cadenas de ADN que forman estructuras tipo hélice cuádruple presentan, como en el caso de las hélices tríples, caracteristicas que las hacen especiales. En este caso, las estructuras de hélice cuádruple se forman cuando una secuencia de ADN es rica en bases nitrogenadas del tipo guanina o bien rica en bases nitrogenadas del tipo citosina. Una secuencia rica en guaninas puede originar estructuras de hélices cuádruples conocidas como G-quadruplex (Figura 3). Una secuencia rica en 2

3 bases citosinas, por su parte, puede dar lugar a estructuras de hélices cuádruple conocidas como i-motif [Phan, 2000]. Figura 2. Ejemplo de estructura tipo hélice triple. La cadena de color naranja representa la tercera hebra, localizada en la hendidura mayor del ADN (entre las hebras amarilla y azul). Éstas dos hebras son ricas en bases purínicas (guanina, adenina) y pirimidínicas (citosina, timina), respectivamente. Las estructuras i-motif precisan de la protonación de una parte de las bases nitrogenadas citosinas, por lo que su presencia a ph neutro es minoritaria. Por ello, se ha investigado mucho más el posible papel biológico de los G-quadruplex que sí se forman a ph neutro [Simonsson, 2000; Phan, 2002; Canalia, 2005]. Figura 3. Estructuras tipo hélice cuádruple [Phan, 2000]: A) disposición de cuatro bases guanina (tetrada) que da lugar a la estructura G-quadruplex mostrada a la derecha. Esta estructura está formada por tres tetradas superpuestas, donde las bases guanina se han representado como rectángulos. B) disposición de dos bases citosina (una de ellas protonada) que da lugar a la estructura i-motif mostrada a la derecha. Esta estructura está formada por seis pares intercalados de bases citosina, representadas por triángulos. 3

4 Las hélices cuádruples tipo G-cuadruplex e i-motif se pueden encontrar in vivo en los telómeros y en ciertos oncogenes (genes que se sabe o sospecha están relacionados con determinados cánceres), como bcl-2, c-myc, c-kit,... [Ambrus, 2005; Dai, 2006; Dexheimer, 2006; Xu, 2006]. El caso de los telómeros es el que más se ha estudiado hasta la fecha ya que la relación existente entre la longitud de los telómeros y la capacidad que tiene la célula para dividirse tiene un gran interés en la terapia del cáncer [Ambrus, 2006; Luu, 2006]. Se sabe que es necesario el desenrollamiento de los telómeros del ADN celular como paso previo a la replicación de éste. Una vez ésta se ha producido los telómeros vuelven a enrollarse pero, durante el proceso, se ha producido un acortamiento de su sec uencia, perdiéndose una parte pequeña de las bases guanina necesarias para la formación del telómero. Después de un cierto número de replicaciones celulares, la longitud del telómero es lo suficientemente corta como para que ya no se pueda formar la estructura G-quadruplex, y es entonces cuando se considera que la celula muere. Curiosamente, en las células de tejidos cancerosos no se da esta circunstancia, y la longitud de los telómeros permanece prácticamente inalterada después de muchos ciclos de división celular, lo que hace que las células cancerosas tengan una gran facilidad de reproducción. Es por este papel tan importante en la replicación celular que hay un gran interés biomédico en conocer los factores que afectan a la estabilidad de esta estructura, así como el desarrollo de compuestos que puedan modificar su estabilidad. Hasta la fecha, un número considerable de grupos de investigación ha trabajado en el desarrollo de compuestos capaces de estabilizar o desestabilizar las estructuras G-quadruplex [Reed, 2006; Wei, 2006]. El compuesto que ha mostrado un mayor poder de estabilización de esta estructura es el 5,10,15,20-tetrakis(N-metil-piridinium-4-il)-21H, 23H-porfirina (Figura 4). La naturaleza de su interacción con las estructuras G-quadruplex aún es motivo de discusión ya que, mientras algunos investigadores defienden un mecanismo de intercalación entre las tetradas, otros defienden una interacción con los bucles de los extremos de la estructura G-quadruplex. Figura 4. Estructura molecular del compuesto TmPyP El papel de la Química Analítica La investigación experimental de la estabilida d de las estructuras complejas de las biomoléculas y de su interacción con otros compuestos (lo que entraría dentro del campo de la Biofísica) se suele realizar 4

5 combinando estudios de carácter estructural con otros de enfoque termodinámico. Los primeros tienen como objetivo la elucidación de la estructura espacial de las biomoléculas así como de los procesos que llevan a la formación de estas estructuras. Por su parte, los estudios de carácter termodinámico tienen como objetivo final la especiación del sistema, entendida ésta como la determinación de las especies químicas o conformaciones presentes en unas condiciones experimentales especificas y su concentración relativa. Ésta es, probablemente, la intersección más evidente de las áreas de investigación que, tradicionalmente, se han identificado con la Biofísica y con la Química Analítica. Así, los estudios de las propiedades ácido-base, de complejación con iones metálicos o con complejos de éstos, o incluso los cambios de conformación de una molécula, se pueden incluir dentro de la categoría de estudios termodinámicos que pueden ser realizados desde un punto de vista analítico. La línea de investigación propuesta plantea la aplicación de la metodología analítica, entre la que destaca la aplicación de métodos quimiométricos de análisis de datos espectroscópicos, a estudios de carácter termodinámico en la investigación biofísica de estructuras complejas de ADN La Quimiometría en la investigación biofísica En la actualidad, los avances en informática y electrónica hacen posible el registro de grandes conjuntos de datos en cortos períodos de tiempo. En el caso de la espectroscopía, este hecho se observa en la disponibilidad de detectores rápidos y fiables que permiten el seguimiento de procesos bioquímicos o biofísicos midiendo espectros completos en cada punto del proceso. Hace escasos años, esta clase de procesos podía ser únicamente seguida midiendo la señal espectroscópica a una o, como mucho, unas pocas longitudes de onda. Los datos obtenidos con un único canal de medida se conocen como univariantes. Un ejemplo de datos univariantes sería las medidas de absorbancia realizadas durante un experimento de desnaturalización de un ácido nucleico a una única longitud de onda. Por otra parte, los datos multivariantes son aquellos que son resultado de medidas utilizando varios canales. En algunos casos, los datos univariantes son suficientes para seguir satisfactoriamente un proceso, habiéndose desarrollado métodos de análisis que proporcionan resultados fiables [Breslauer, 1995]. Así, parámetros termodinámicos como la entropía o la entalpía asociados a la desnaturalización de un ADN se han calculado tradicionalmente a partir del análisis de datos univariantes registrados a lo largo de su desnaturalización. Otros ejemplos del análisis de datos univariantes son el cálculo de las estequiometrías y de constantes de equilibrio mediante la aplicación de los métodos de Job o de razones molares [Huang, 1982]. Sin embargo, en algunos casos, el seguimiento de un proceso a una única longitud de onda no es suficiente y ciertas ambigueda des relacionadas con la determinación del número de especies químicas (o conformaciones) presentes o con su rango de existencia (temperatura, ph) no se resuelven satisfactoriamente. En estos casos, la disponibilidad de datos multivariantes y su posterior análisis proporciona una posible vía para 5

6 superar estas dificultades. Absorbancia Temperatura (oc) Long. de onda (nm) Figura 5. Ejemplo de datos multivariantes obtenidos en el seguimiento mediante espectros copía de absorción molecular de la desnaturalización de un ADN inducida por un incremento de temperatura. Los datos se han registrado en 101 canales de medida (n =101) y a 30 condiciones experimentales diferentes (m =30). A temperaturas bajas predomina la estructura de hélice doble del ADN, en tanto que a temperaturas altas predomina una estructura de ovillo aleatorio (random coil) Los métodos matemáticos empleados en Química Analítica para el análisis de datos espectroscópicos (como los mostrados en la figura anterior) se denominan métodos de resolución multivariante. El objetivo de estos métodos es la descomposición (resolución) de la matriz de datos original en las contribuciones cuantitativas (concentración) y cualitativas (características espectrales) de todos los factores (que suelen relacionarse directamente con especies químicas o estructuras) ópticamente activos siguiendo un modelo bilineal (Figura 6). n N C n n S NC D = C + E m m m Figura 6. Descomposición de la matri z de datos multivariantes mostrados en la figura anterior en sus contribuciones cuantitativas (concentraciones, matri z C) y cualitativas (espectros, matri z S). m y n son el número de espectros y el número de canales de medida, respectivamente. NC es el número de factores ópticamente activos. E es la matri z de residuales, es decir, datos de absorbancia no explicados por la multiplicación de C S T. Un grupo de métodos de resolución multivariante incluye aquéllos basados en la aplicación de modelos explícitos postulados a priori. Éstos son básicamente la extensión de los métodos univariantes ya utilizados, y se les suele denominar como métodos de modelado rígido o hard- 6

7 modeling. Así, por ejemplo, para estudios sobre equilibrio químico, el modelo que se postula consiste en las estequiometrías de todas las especies químicas presentes en el sistema y en un conjunto de valores aproximados de las constantes de equilibrio [Beltrán, 1993; Toptygin, 1995; Gans, 1996]. El método de modelado rígido utiliza este modelo inicial para calcular los valores de las constantes de equilibrio que mejor explican los datos experimentales. Los métodos de modelado rígido proporcionan excelentes resultados siempre que su aplicación sea factible. Sin embargo, a menudo, ésta no es posible debido a las dificultades halladas en la postulación de un modelo explícito de especies, bien sea porque no se conoce la estequiometría de las especies o bien porque el modelo de constantes de equilibrio fijas no es válido. Éste es el caso de las macromoléculas tipo ADN en las que no es posible a menudo postular un único y constante valor del pka para todas las unidades monómeras que forman la molécula. Otro caso son los cambios de conformación no acompañados de cambios en la composición química. Algunas de estas dificultades pueden ser superadas mediante la utilización de métodos de modelado suave, también conocidos como soft- o self-modeling, que no precisan de un modelo explícito a priori. [Gampp, 1985; de Juan, 2003; Windig, 1992; Zimanyi, 1999]. De hecho, el objetivo final de estos métodos sería la postulación de un modelo a posteriori. En la práctica, sin embargo, es difícil recuperar perfectamente el modelo químico que está detrás de los datos experimentales debido a la presencia de una serie de ambigüe dades inherentes al análisis de factores. En el campo de la Química Analítica se ha experimentado un gran desarrollo de estos métodos, entre los que se encuentra el método de Resolución Multivariante de Curvas basado en optimización de mínimos cuadrados alternados (Multivariate Curve Resolution based on Alternating Least Squares optimization, MCR- ALS), desarrollado en el grupo de Equilibrios en solución y Quimiometría de la Universidad de Barcelona [T auler, 1995]. MCR-ALS se ha empleado satisfactóriamente en el estudio de los equilibrios en solución de los ácidos nucleicos [Jaumot, 2003] y de las proteínas [Navea, 2003]. Los métodos de resolución rígidos son los más utilizados en los estudios biofísicos, especialmente en el modelado de reacciones (estudios cinéticos). Al igual que en el campo de la Química Analítica, los métodos de modelado suave han ido ganado terreno en aquellas aplicaciones donde la aplicación de métodos rígidos era difícil. El método de modelado suave más utilizado es Singular Value Decomposition (SVD) [Henry, 1992; Henry, 1997]. Es de destacar la utilización de éste método como paso previo al modelado de datos experimentales mediante métodos rígidos, con el fin de reducir el tamaño de la matriz de datos que se pretende analizar. Varios trabajos han revisado las principales aplicaciones de los métodos de resolución multivariante en estudios biofísicos [Goldbeck, 1993, Jaumot 2004; Vandegriff, 1994]. 7

8 4. Objetivos de la línea de investigación 4.1. Antecedentes y resultados previos Los antecedentes de proyecto de investigación que aquí se describe son los estudios del papel que sobre los equilibrios ácido-base y de complejación juegan los efectos secundarios relacionados con la estructura de los polímeros. Estos estudios se iniciaron con la T esis de Licenciatura (1993) en el marco de la investigación realizada en el grupo de Equilibrios en solución y Quimiometría. Estos efectos secundarios, que se clasifican en efectos polifuncionales, polielectrolíticos y conformacionales, se comenzaron a estudiar en polinucleótidos sintéticos, como los ácidos poliuridílico (poli(u)) y poliinosínico (poli(i)). Estos estudios consistían en el seguimiento mediante potenciometría de la protonación y de la complejación con el ion metálico cobre(ii) de estos polímeros. Posteriormente, se pasó al estudio de estos mismos equilibrios seguidos mediante técnicas espectroscópicas. En estos estudios, los datos espectroscópicos obtenidos a largo de valoraciones ácido-base se analizaron con las primeras versiones de MCR-ALS para obtener los perfiles de concentración y los espectros puros de cada una de las especies consideradas. A partir de estos perfiles, se calculaba una estimación de las constantes de equilibrio y se caracterizaba el comportamiento polielectrolítico de cada sistema estudiado. A partir de estos estudios iniciales, se pasó a estudiar polinucleótidos sintéticos de cadena doble, del tipo ácido poliinosínico-policitidílico (poli(i) poli(c). Por otra parte, se pasó de estudiar la complejación con cobre(ii) a estudiar la interacción de compuestos de platino y de agentes intercaladores, como el bromuro de etidio, con polinucleótidos de cadena doble. El diseño experimental aplicado en estos últimos trabajos fue la extensión multivariante de métodos analíticos conocidos, como los de razones molares o de variaciones continuas. Además, la interacción fue seguida no únicamente con espectroscopía de absorción molecular, sino también con DC y fluorescencia molecular, simultáneamente. El análisis global de los tres conjuntos de datos permitió una completa especiación de los sistemas estudiados, así como el cálculo de los espectros puros de absorción, DC y fluorescencia de los complejos de intercalación. En cuanto al estudio de los equilibrios en solución de los ácidos nucleicos, el paso natural siguiente es el estudio de las hélices triples y cuádruples. Por otra parte, en los últimos años se ha trabajado intensamente en la mejora de los algoritmos de MCR-ALS con el objetivo de mejorar la fiabilidad de los resultados obtenidos. Así, se pasó del análisis de una única matriz de datos espectroscópicos al análisis simultáneo de varias matrices correspondientes a diferentes experimentos y/o datos obtenidos con diferentes técnicas espectroscópicas. En los últimos años se ha trabajado en la incorporación de modelos físico-químicos en el cálculo, en lo que se ha denominado aproximación rígido-suave (hard-soft). Esto se ha conseguido de manera satisfactoria en el caso de los equilibrios ácido-base y de los estudios cinéticos. Sin embargo, aún no se ha incorporado un modelo físico-químico para el caso de los procesos de 8

9 desnaturalización térmica (Figura 5) con el fin de calcular, además de los perfiles de concentración y de los espectros, valores de magnitudes termodinámicas como la entalpía, entropía o energía libre. Además, el hecho de forzar a los resultados a cumplir un modelo permite una resolución libre, o prácticamente libre, de algunas de las ambigüedade s relacionadas con los métodos de modelado suave Objetivos El plan que se pretende desarrollar plantea el estudio desde una óptica multidisciplinar de los equilibrios en solución de estructuras complejas de ácidos nucleicos y de su interacción con compuestos de posible interés biomédico. Los objetivos concretos del plan propuesto son: 1. Especiación de los sistemas químicos en los que intervienen secuencias de ADN formadoras de hélices triples y cuádruples. Como ya se ha comentado, el término especiación implica la caracterización exacta de las propiedades ácido-base y de los cambios conformacionales inducidos por la temperatura, fuerza iónica y la presencia de algunos iones metálicos. 2. Especiación de los sistemas químicos en los que, a demás de las secuencias formadoras de hélices triples y cuádruples, intervienen determinados compuestos capaces de interaccionar con estas estructuras (actinomicina D, altromicina H, mitoxantrona, quelatos de platino o europio, TmPyP4). Se pretende determinar las condiciones óptimas para la interacción y el efecto de ésta sobre la estructura inicial del ADN. Se estudiaría también la influencia que sobre la estabilidad de la estructura tiene la mutación de algunas bases nitrogenadas en la secuencia. En concreto, se estudiaría la mutación de las bases adenina o guanina por las bases 2- o 8-aminopurina, respectivamente. 3. Desarrollo y validación de métodos de resolución multivariante basados en el modelado suave y rígido-suave para el análisis de datos espectroscópicos obtenidos a lo largo de los estudios de desnaturalización de biomoléculas. 5. Metodología y plan de trabajo Para conseguir el primer y el segundo objetivos descritos anteriormente se utilizará la siguiente metodología: a) Síntesis de las sec uencias de ADN capaces de formar estructuras tipo hélice triple y cuádruple. Esta síntesis se realizará en colaboración con el Grupo de Química de ácidos nucleicos, del Instituto de Biología Molecular de Barcelona (CSIC), utilizando la tecnología de la síntesis en fase 9

10 sólida. Esta misma tecnología se utilizará en la síntesis de las secuencias que incluyan bases nitrogenadas modificadas. b) Estudio experimental de los equilibrios ácido-base de las secuencias de ADN. Se considera necesario este estudio como paso previo a los posteriores sobre interacción o cambios conformacionales, ya que es la mejor opción para conseguir una correcta especiación de los distintos sistemas estudiados en las condiciones fisiológicas de ph. La formación de las hélices triples y cuádruples en función del ph se visualizará mediante el seguimiento de sencillas valoraciones ácido-base mediante técnicas instrumentales apropiadas, como las espectroscopias de absorción molecular, de fluorescencia molecular (tanto su aplicación tradicional como la basada en la tecnología de las almenaras moleculares -molecular beacons-), de dicroísmo circular (DC) o de resonancia magnética nuclear (RMN). El resultado final será la obtención de conjuntos de datos similares a los descritos en la Figura 5. Para el análisis de los datos espectroscópicos se utilizarán tanto los métodos de resolución multivariante basados en el modelado rígido, como los basados en un modelado suave, así como la combinación de ambos. c) Estudio experimental de los cambios conformacionales inducidos por la temperatura o la fuerza iónica en las estructuras de hélice triple y cuádruple. Una vez definida la composición de cada sistema en las condiciones fisiológicas de ph, se procederá a estudiar la desnaturalización de las estructuras inducida por la temperatura y la estabilización, en general, de las mismas con la fuerza iónica. En este caso, el procedimiento experimental que se utilizará en el seguimiento de los cambios conformacionales y el análisis de los datos obtenidos será similar al descrito en el apartado anterior. Además, se utilizarán técnicas complementarias como la electroforesis en gel o la cromatografía de líquidos, entre otras. En este punto también se incluye el estudio de la competencia entre la formación de estructuras cuádruples y la formación de estructuras Watson- Crick, cuando en el mismo sistema coexisten secuencias complementarias formadoras de G- quadruplex e i-motif. d) Una vez conocida la composición de cada sistema en función del ph, temperatura y fuerza iónica, se procederá estudiar la interacción de las estructuras tipo hélice cuádruple con compuestos del tipo actinomicina D, altromicina H, mitoxantrona o T mpyp4. En este caso, el procedimiento experimental se basará en la extensión multivariante de los métodos de razones molares y variaciones continuas. Las técnicas instrumentales ópticas y los métodos utilizados en el análisis de datos serán similares a los descritos anteriormente. Además, se utilizarán técnicas complementarias como la diálisis competitiva o la electroforesis en gel, entre otras. El tercer objetivo de este plan es el desarrollo y validación de un programa informático, basado en la combinación de modelado rígido y suave, para el análisis de datos multivariantes registrados a lo largo de procesos de desnaturalización térmica. Estos procesos suelen ser seguidos mediante técnicas 10

11 espectroscópicas como la absorción molecular o DC utilizando para ello modernos espectrofotómetros que permiten la medida de la señal analítica (absorbancia o elipticidad) en un rango amplio de longitudes de onda. A menudo, la no disponibilidad de programas informáticos adecuados hace que el análisis de los datos experimentales se limite a la señal registrada a una longitud de onda, desaprovechando gran parte de los datos originales. Un ejemplo concreto es el ya comentado en la Figura 5. Aunque es posible medir el espectro en un rango amplio de longitudes de onda, el análisis de los datos se acostumbra a realizar únicamente a partir de la señal registrada a 260 y /o 295 nm, lo que frecuentemente hace difícil la detección de estructuras intermedias en este tipo de procesos. La herramienta informática que se pretende desarrollar y validar es un programa de acceso libre, con código abierto y disponible vía Internet. El programa servirá para analizar datos multivariantes obtenidos con cualquier técnica espectroscópica, haciendo especial énfasis en la espectroscopía de absorción molecular y en el DC, que son las más utilizadas en este tipo de estudios. El programa se basará en la combinación de modelado rígido y modelado suave. El primero servirá para modelar la contribución espectral de las especies asociadas a las biomoléculas y permitirá el cálculo fiable del valor de magnitudes termodinámicas como la entalpía, entropía o energía libre, y empíricas como la temperatura de fusión (T m ). El modelo físico-químico propuesto a priori estará definido por: a) el número de transiciones estructurales que se dan en el rango de temperaturas estudiado, y b) un conjunto inicial de valores (entalpía, entropía y T m ) para cada una de estas transiciones. Mediante un procedimiento iterativo, los valores de estas magnitudes se refinarán de tal manera que la magnitud de los residuales se minimice. Por otra parte, el modelado suave servirá para explicar la contribución espectral de aquellos factores no relacionados con especies o conformaciones de la biomolécula, como puede ser la deriva de la línea base. El programa se escribirá en el entorno de programación Matlab, con el que ya se ha trabajado anteriormente, ya que es la herramienta más común de programación de los investigadores que trabajan en Quimiometría. El programa incluirá una interfaz gráfica y será disponible vía Internet a través de la página web del Grupo de equilibrios en solución y Quimiometría. 6. Recursos necesarios para el desarrollo del plan 6.1. Espacio físico e instrumentación básica El proyecto de investigación propuesto se desarrollaría en el marco de la Facultad de Química de la UB; en concreto, en los laboratorios del Grupo de Equilibrios en solución y Quimiometría del Departamento de Química Analítica. Los laboratorios incorporan todas infraestructuras necesarias (vitrinas, extractores, climatización, etc.) para el desarrollo de la investigación que se ha descrito, así 11

12 como el equipamiento básico de un laboratorio analítico (material volumétrico, potenciómetros, agitadores, pipetas, material informático, neveras, estufas, etc.), además de espectrofotómetros de absorción molecular y de fluorescencia molecular o equipos de cromatografía de líquidos Grandes equipos Los grandes equipos que se utilizarán en el desarrollo del proyecto son básicamente dos: espectrofotómetros de DC y espectrómetros de RMN. Los equipos de DC se encuentran situados físicamente en los laboratorios de los Servicios Científico- Técnicos de la Universidad de Barcelona, a cien metros del edificio de la Facultad de Química. Se dispondrá de ellos en régimen de autoservicio y con una tarifa especial para los usuarios de la Universidad de Barcelona. Los espectrómetros de RMN también se encuentran físicamente en los espacios de los Servicios Científico-Técnicos de la Universidad de Barcelona. Los equipos de campo bajo (hasta 400 MHz) se encuentran en el subterráneo de la propia Facultad de Química. Los equipos de campo alto (de 500 a 800 MHz) se encuentran en un edificio independiente, a 500 metros de la Facultad Recursos humanos El desarrollo del plan de investigación propuesto necesita de la participación de más personas para llevarlo a término. En este sentido, los recursos humanos que se e spera poder disponer para su realización son: Estudiantes de Química de la asignatura Experimentación Avanzada en Química Analítica B. Estos estudiantes tienen la posibilidad de realizar la asignatura en laboratorios del departamento de Química Analítica, trabajando en proyectos de investigación, durante, aproximadamente, un mes. Licenciados en Química que cursen el Máster en Química Experimental (mientras éste siga ofertándose), y que opten por un trabajo experimental de, aproximadamente, un año de duración en el marco de este proyecto de investigación. Estudiantes extranjeros de Química que realicen parte de sus estudios en la Universidad de Barcelona. A largo plazo, se intentará conseguir una beca predoctoral asociada a algún proyecto nacional financiado. 12

13 6.4. Recursos económicos La financiación, a corto y medio plazo, para llevar a cabo el proyecto de investigación propuesto se obtendrá a partir de los dos proyectos en curso en los que participo. Además, participo en el grupo de investigación consolidado SIBA-TEQ: Sistemes d'interès Biomèdic i Ambiental: Tècniques Experimentals i Quimiomètriques, reconocido por la Agencia de Gestión de ayudas universitarias y de investigación, de la Generalitat de Catalunya Colaboraciones científicas El plan de investigación se desarrollaría con la colaboración del Grupo de Química de ácidos nucleicos, del Instituto de Biología Molecular de Barcelona (CSIC), y el Grupo de Quimiometría Ambiental, del Instituto de Investigaciones Químicas y Ambientales de Barcelona (CSIC). Con el primer grupo se ha colaborado activamente desde el año 1999 y con el segundo desde su creación en 2003, tras la marcha del Dr. Romà Tauler, anterior miembro del grupo de Equilibrios en Solución y Quimiometría de la UB, al CSIC. El Grupo de Química de ácidos nucleicos está dirigido por el doctor Ramon Eritja Casadellà. El doctor Eritja es doctor en Química por la UB y ha estado tres años en el Beckman Research Institute of City of Hope de Los Angeles, California, un año en la Universidad de Colorado y cinco años en el Laboratorio Europeo de Biologia Molecular (EMBL) de Heidelberg, Alemania. Su investigación se centra en la síntesis y en el estudio de las propiedades de los oligonucleótidos [Williams, 2002; Aviñó, 2003; Aviñó, 2004; Nadal, 2005]. Con anterioridad al presente proyecto de investigación, se ha colaborado con el grupo del Dr. Eritja en el estudio de los equilibrios en solución de oligonucleótidos cuya secuencia incluían bases nitrogenadas anómalas del tipo zebularina o 2-aminopurina. La contribución del laboratorio del Dr. Eritja se materializó en la síntesis de las secuencias cuyos equilibrios en solución se estudiaron posteriormente. Por su parte, la colaboración con el grupo del Dr. Tauler se centraría en el desarrollo de programas de análisis de datos basados en métodos multivariantes. Esta colaboración seguiría en la línea ya establecida anteriormente. Finalmente, se ha de mencionar los contactos que se mantienen con otros investigadores, expertos en sus respectivas áreas científicas, como son: Dr. Carlos González, (Instituto de Química Física Rocasolano, CSIC) y Dr. Enrique Pedroso (departamento de Química Orgánica, Universidad de Barcelona), en el campo del análisis estructural mediante RMN bidimensional. Dr. Petr Taborsky (departamento de Química, Masaryk University, Brno, República Checa), en el estudio de la interacción de compuestos fluorescentes de europio. 13

14 Dr. Baldomero Oliva, (Departamento de Ciencias Experimentales y de la Salud, Universidad Pompeu Fabra), en el campo del modelado molecular de proteínas y ácidos nucleicos. 7. Beneficios del proyecto 7.1. Grado de innovación, interés y oportunidad Varios son los aspectos innovadores de este proyecto: La utilización de hélices triples para la captura de secuencias de interés de ADN ha sido propuesta por varios grupos investigadores. Sin embargo, existen algunos inconvenientes que dificultan su estudio y utilización. Uno de los inconvenientes principales que limita su estudio es la detección en el caso de las estructuras paralelas. Este inconveniente se podría solventar mediante la utilización de la metodología multivariante descrita. Por otra parte, un inconveniente en la utilización médica de las hélices triples es la poca estabilidad de éstas en medios neutros. Uno de los puntos innovadores de este proyecto es la utilización de bases modificadas, del tipo 2- y 8- aminopurina, que aumentan de forma considerable la estabilidad de las hélices triples incluso a ph neutros. El estudio de secuencias de ADN formadoras de estructuras cuádruples es muy reciente y hay en la actualidad un número creciente de investigadores trabajando en los estudios estructurales de las mismas. Sin embargo, la caracterización desde el punto de vista analítico no avanza al mismo ritmo, por lo que se detecta un cierto vacío en este campo. El proyecto propuesto será innovador en este aspecto por cuanto no se ha encontrado en la bibliografía científica ningún grupo que trabaje en un proyecto similar al descrito, y que complementará los estudios estructurales ya en marcha. En la actualidad, es absolutamente necesaria la disponibilidad de herramientas informáticas capaces de obtener información físico-química, fiable, a partir de las medidas instrumentales. Se ha demostrado que la combinación de los métodos de resolución multivariante basados en el modelado rígido-suave es una buena alternativa para conseguir esta fiabilidad. En este sentido, el proyecto propone el desarrollo de un programa basado en la aproximación hard-soft para el análisis de datos de desnaturalización que, actualmente, no existe (o bien no se ha publicado su desarrollo). Por ello, se considera un aspecto totalmente innovador de este proyecto Plan de difusión: publicaciones y congresos Publicación de trabajos de investigación en revistas ampliamente reconocidas en el Science Citation Index, especialmente en las que se consideran importantes en las áreas de aplicación del 14

15 proyecto (Analytical Chemistry, Analytica Chimica Acta, Analytical Biochemistry, Biophysical Journal, Nucleic Acids Research...). Presentación de la investigación en congresos nacionales e internacionales, dentro del campo de la Quimiometría (Chemometrics in Analytical Chemistry, Colloquium Chimiometricum Mediterraneum), la investigación de los ácidos nucleicos (Reunión de Ácidos nucleicos y nucleósidos, reuniones anuales de la Biophysical Society) y de la espectroscopía de biomoléculas (International Conference on Spectroscopy of Biological Molecules). Contribución a la actualización y mejora de los programas de libre acceso diseñados por el grupo de investigación, y que están disponibles via Internet (en la dirección Capacidad formativa La capacidad formativa del proyecto presentado viene respaldada por los resultados obtenidos en los últimos años, en los que se ha codirigido dos T esis Doctorales y tres tesinas de Licenciatura o Master Experimental en Química Analítica. Además, se ha dirigido el trabajo experimental de una decena de estudiantes nacionales y extranjeros, pre y post-grado. Además, en este período de tiempo se han generado alrededor de 50 publicaciones en revistas nacionales e internacionales de notable índice de impacto y numerosas comunicaciones en congresos nacionales e internacionales. Uno de los aspectos que se consideran más destacables son las colaboraciones que se han iniciado y mantenido con diversos grupos de investigación nacionales y extranjeros. En los últimos años se ha publicado los resultados de investigaciones realizadas en colaboración con una decena de grupos diferentes. 8. Bibliografía Ambrus, A.; Chen, D.; Dai, J.; Jones, R.A.; Yang, D. Solution structure of the biologically relevant G-quadruplex element in the human c-myc promoter. Implications for G-quadruplex stabilization. Biochemistry 2005, 44, Ambrus, A.; Chen, D.; Dai, J.; Bialis, T.; Jones, R.A.; Yang, D. Human telomeric sequence forms a hybric-type intramolecular G-quadruplex structure with mixed parallel/antiparallel strands in potassium solution. Nucleic Acids Research 2006, 34, Aviñó, A., Cubero, E., González, C., Eritja, R., Orozco, M. Antiparallel triple helices. Structural characteristics and stabilization by 8-amino derivatives. J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, Aviñó, A., Grimau, M.G., Frieden, M., Eritja, R. Synthesis and triple-helix stabilization properties of branched oligonucleotides carrying 8-aminoadenine moieties. Helv. Chim. Acta, 2004, 87,

16 Beltran, J.L.; Codony, R.; Prat, M.D. Evaluation ofstability constants from multi-wavelength absorbance data: program STAR, Anal. Chim. Acta 1993, 276, Breslauer, K.J. Extracting thermodynamic data from equilibrium melting curves for oligonucleotide order-disorder transitions, Method. Enzymol. 1995, 259, Canalia, M.; Leroy, J.-L. Structure, internal motions and association-dissociation kinetics of the i-motif dimer of d(5mcctcactcc). Nucleic Acids Research 2005, 33, Dai,J.; Dexheimer, T.S.; Chen, D.; Carver, M.; Ambrus, A.; Jones, R. J. Yang, D. An Intramolecular G-Quadruplex Structure with Mixed Parallel/Antiparallel G-Strands Formed in the Human BCL-2 Promoter Region in Solution. Journal ofthe American Chemical Society 2006, 128, Dexheimer, T.S.; Sun, D.; Hurley, L.H. Deconvoluting the structural and drug-recognition complexity of the G- quadruplex-forming region upstream of the bcl-2 P1 promotor. Journal of the Americal Chemical Society 2006, 128, de Juan, A.; Tauler, R. Chemometrics applied to unravel multicomponent processes and mixtures. Revisiting latest trends in multivariate resolution, Anal. Chim. Acta 2003, 500, Frank-Kamenetskii,M.D., Mirkin,S.M. Triplex DNA Structures Annu. Rev. Biochem. 1995, 64, Gampp, H.; Maeder, M.; Meyer, C.J.; Zuberbuhler, A.D. Calculation of equilibrium constants from multiwavelength spectroscopic data. III. Model-free analysis ofspectrophotometric and ESR titrations, Talanta 1985, 32, Gans, P.; Sabatini, A.; Vacca, A. Investigation ofequilibriain solution: Determination ofequilibriumconstants with the HYPERQUAD suite ofprograms, Talanta, 1996,43, Granotier, C.; Pennarun, G.; Riou, L.; Hoffschir, F.; Gauthier, L.R.; De Cian, A.; Gomez, D.; Mandine, E.; Riou, J.F.; Mergny, J.L.; Mailliet, P.; Dutrillaux, B.; Boussin, F.D. Preferential binding of a G-quadruplex ligand to human chromosome ends, Nucleic Acids Res. 2005, 33, Goldbeck, R.A.; Kliger, D.S. Nanosecond time-resolved absorption and polarization dichroismspectroscopies, Methods Enzymol. 1993, 226, Henry, E.R. The use ofmatrix methods in the modeling ofspectroscopic datasets, Biophys. J. 1997, 72, Henry, E.R.; Hofrichter, J. Singular value decomposition: application to analysis of experimental data, Method. Enzymol. 1992, 210, Huang, C.Y. Determination of binding stoichiometry by the continuous variation method: the Job plot, Method. Enzymol. 1982, 87, Jaumot, J.; Aviñó, A.; Eritja, R.; Tauler, R.; Gargallo, R. Resolution of parallel and antiparallel oligonucleotide triple helices formation and melting processes by Multivariate Curve Resolution, J. Biomol. Struct. & Dyn. 2003, 21, Jaumot, J.; Vives, M.; Gargallo, R. Application of multivariate resolution methods to the study of Biochemical and Biophysical processes. Analytical Biochemistry 2004, 327, 1-13 Kankia, B.I.; Barany, G.; Musier-Forsyth. Unfolding of DNA quadruplexes induced by HIV-1 nucleocapsid protein, Nucleic Acids Res. 2005, 33, Luu, K.N.; Phan, A. T.; Kuryavyi, V.; Lacroix, L.; Patel, D.J. Structure of the human telomere in K + solution: an intramolecular (3+1) G-quadruplex scaffold. Journal ofthe American Chemical Society 2006, 128,

17 Nadal, A., Eritja, R., Esteve, T., Plà, M. Parallel- and antiparallel-tail-clamps hairpins increase the efficiency of triplex formation with structured DNA and RNA targets. ChemBioChem, 2005, 6, Navea, S.; de Juan, A.; Tauler, R. Modeling temperature-dependent protein structural transitions by combined Near-IR and Mid-IR spectroscopies and Multivariate Curve Resolution, Anal. Chem. 2003, 75, Ourliac-Garnier, I.; Elizondo-Riojas, M.A.; Redon, S.; Farrell, N.P.; Bombard, S., Cross-links of quadruplex structures from human telomeric DNA by dinuclear platinum complexes show the flexibility of both structures, Biochemistry 2005, 44, Phan, A.T.; Guéron, M.; Leroy, J.L., The solution structure and internal motions of a fragment of the cytidine-rich strand ofthe human telomere, J. Mol. Biol. 2000, 299, Phan, A.T.; Mergny, J-L. Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motifand Watson-Crick doublehelix. Nucleic Acids Research 2002, 30, Praseuth, D., Guieysse, A., Hèlene, C., Triple helix formation and the antigene strategy for sequence-specific control of gene expression, Biochim. Biophys. Acta 1999, 1489, Reed, J.E.; Arola Arnal, A.; Neidle, S.; Vilar, R. Stabilization of G-quadruplex DNA and inhibition of telomerase activity by square-planar nickel(ii) complexes. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, Simonsson, T.; Pribylova, M.; Vorlickova, M. A nuclease hypersensitive element in the human c-myc promoter adopts several distinct i-tetraplex structures. Biochemical and Biophysical Research Communications 2000, 278, Sun,J.S., Garestier, T., Hélène, C., Oligonucleotide directed triple helix formation, Curr. Opin. Struct. Biol. 1996, 6, Tauler, R., Smilde A., Kowalski, B.R. Selectivity, local rank, three-way data analysis and ambiguity in multivariate curve resolution, J. Chemo metrics 1995, 9, Toptygin, D.; Brand, L. Analysis of equilibrium binding data obtained by linear-response spectroscopic techniques, Anal. Biochem. 1995, 224, Vandegriff, K.D.; Shrager, R.I. Hemoglobon-oxygen equilibrium binding: rapid-scanning spectrophotometry and singular value decomposition, Methods in Enzymol. 1994, 232, Wei, C.; Jia, G.; Yuan, J.; Feng, Z, Li. C. A spectroscopic study on the interactions of porphyrin with G-quadruplex DNAs, Biochemistry 2006, 45, Williams, K.A., Veenhuizen,P.T.M., de la Torre, B.G., Eritja, R., Dekker, C. Carbon nanotubes with DNA recognition. Nature, 2002, 420, 761. Windig, W. Self-modeling mixture analysis of spectral data with continuous concentration profiles, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems 1992, 16, 1-16 Xu, Y.; Sugiyama, H. Formation ofthe G-quadruplex and i-motifstructures in retinoblastoma susceptibility genes (Rb). Nucleic Acids Research 2006, 34, Zimanyi, L.; Kulcsar, A.; Lanyi, J.K.; Sears, D.F.; Saltiel, J. Singular value decomposition with self-modeling applied to determine bacteriorhodopsin intermediate spectra: analysis of simulated data, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96,