ERAUNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMÓN

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1 ERAUNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMÓN FACULTAD DE BIOQUIMICA Y FARMACIA POSGRADO-BIOQUÍMICA DETERMINACIÓN DE LA FRECUENCIA DE ANTÍGENOS DEL SISTEMA Rh, APLICANDO EL MÉTODO DE HEMAGLUTINACIÓN EN MICROPLACA EN DONANTES EFECTIVOS DEL BANCO DE SANGRE DE REFERENCIA COCHABAMBA DE OCTUBRE A NOVIEMBRE DEL AÑO TRABAJO DE GRADO PRESENTADO POR: MARIA LUISA HERRERA RIVERA PARA OPTAR AL TÍTULO PROFESIONAL DE MAGISTER EN HEMATOLOGIA LABORATORIAL, INMUNOHEMATOLOGÍA Y MEDICINA TRANSFUSIONAL TUTOR DRA. MÓNICA FERNANDEZFERNANDEZ Febrero 2011 Cochabamba - Bolivia

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3 UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMÓN FACULTAD DE BIOQUIMICA Y FARMACIA POSGRADO-BIOQUÍMICA DETERMINACIÓN DE LA FRECUENCIA DE ANTÍGENOS DEL SISTEMA Rh, APLICANDO EL MÉTODO DE HEMAGLUTINACIÓN EN MICROPLACA EN DONANTES EFECTIVOS DEL BANCO DE SANGRE DE REFERENCIA COCHABAMBA DE OCTUBRE A NOVIEMBRE DEL AÑO TRABAJO DE GRADO PRESENTADO POR: MARIA LUISA HERRERA RIVERA PARA OPTAR AL TÍTULO PROFESIONAL DE MAGISTER EN HEMATOLOGIA LABORATORIAL, INMUNOHEMATOLOGÍA Y MEDICINA TRANSFUSIONAL TUTOR DRA. MÓNICA FERNANDEZFERNANDEZ Febrero 2011 Cochabamba - Bolivia

4 Composición de Tribunal Dr. Javier Salinas E. Dra. Adela Panoso Dr. Luis Fernando Amaya Tutor Dra. Mónica Fernández (Bolivia)

5 DEDICATORIA DEDICO ESTE TRABJO, A GONZALO, POR ESTAR CONMIGO EN AQUELLOS MOMENTOS EN QUE EL ESTUDIO Y EL TRABAJO OCUPARON MI TIEMPO Y ESFUERZO. GRACIAS POR TODA SU AYUDA. A MIS PADRES Y HERMANA, POR SU APOYO INCONDICIONAL QUE ME DAN A LO LARGO DE TODA MI VIDA A DIOS POR SER MI LUZ Y GUÍA

6 AGRADECIMIENTOS Deseo expresar mi profundo agradecimiento a la Dra. Mónica Fernández quien es mi profesor guía de la presente investigación. Mi reconocimiento y profundo agradecimiento al Lic. René Leaño por su colaboración e incondicional apoyo para la elaboración de la presente Tesis. De igual forma mis agradecimientos al SEDES y todo el personal del Banco de Sangre de Referencia Departamental.

7 TABLA DE CONTENIDOS TÍTULO... 1 RESUMEN... 2 I.- INTRODUCCIÓN... 6 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA... 7 JUSTIFICACION... 8 HIPÓTESIS DE LA INVESTIGACIÓN OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS ESPECIFICOS II.- MARCO METODOLÓGICO TIPO DE INVESTIGACIÓN POBLACIÓN EN ESTUDIO INSTRUMENTOS PARA LA RECOLECCIÓN DE INFORMACIÓN TAMAÑO DE LA MUESTRA RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES MATERIAL Y MÉTODO MUESTRA CONTROL DE CALIDAD DE LOS ANTISUEROS TITULACIÓN DE ANTISUEROS MATERIAL Y EQUIPOS EQUIPO, MATERIAL, REACTIVOS INTERPRETACIÓN TIPIFICACION ABO EN MICROPLACA EQUIPO, MATERIAL, REACTIVOS INTERPRETACIÓN III. MARCO TEORICO SISTEMA DE GRUPO SANGUÍNEO GRUPO SANGUÍNEO ANTIGENOS ERITROCITARIOS i

8 3.4 SISTEMA Rh DESCUBRIMIENTO DE LOS ANTIGENOS SISTEMA Rh CONCIDERACIONES GENÉTICAS Y BIOQUÍMICAS NOMENCLATURA OTROS ANTIGENOS Rh O LLAMADOS ANTÍGENOS COMPUESTOS EXPRESION DE LOS ANTIGENOS D ANTICUERPOS DEL SISTEMA Rh DESCUBRIMIENTO DE LOS ANTIGENOS DEL SISTEMA ABO SISTEMA ABO IV. RESULTADOS V. DISCUSIÓN VI.CONCLUSION VII. RECOMENDACIONES CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES BIBLIOGRAFÍA ANEXOS ii

9 TÍTULO DETERMINACIÓN DE LA FRECUENCIA DE ANTÍGENOS DEL SISTEMA Rh, APLICANDO EL MÉTODO DE HEMAGLUTINACIÓN EN MICROPLACA EN DONANTES EFECTIVOS DEL BANCO DE SANGRE DE REFERENCIA COCHABAMBA DE OCTUBRE A NOVIEMBRE DEL AÑO

10 RESUMEN El estudio de los grupos sanguíneos tiene gran importancia para conocimiento de la genética humana, la fisiopatología de determinadas anemias Hemolíticas, el estudio sobre el origen étnico, en el campo de la terapéutica Transfusional. Los objetivos de este trabajo son determinar la frecuencia fenotípica de los antígenos eritrocitarios del sistema Rh en donantes del Banco de Sangre de Referencia Departamental Cochabamba, a través de la técnica de Hemaglutinación en microplaca. Adicionalmente se ha testado la frecuencia del sistema ABO, para conocer la frecuencia de los antígenos del sistema Rh en relación al sistema ABO. Se ha realizado la comparación de los resultados obtenidos de la frecuenciafenotípicacon otras poblaciones de Bolivia (Caja Petrolera La Paz Bolivia) y otros Países como México, Chile, Brasil. Se realizó la investigación en toda la población entre Varones y Mujeres que realizan su donación efectiva en el mes de Octubre del 15 al 29 de Noviembre del Las muestras son tomadas dentro el marco del manual de Ética para Bancos de Sangre que en su artículo 78 menciona que, funcionarios de los Bancos de sangre procedan a investigaciones que fueren de utilidad para la mejora continua. El tamaño de la muestra es de 850 personas de las cuáles 481 personas son del sexo masculino y 369 del sexo Femenino. 2

11 El presente estudio permite establecer de acuerdo al análisis estadístico de la distribución de frecuencias fenotípicas, que en la población de donantes del Banco de Sangre de Referencia Cochabamba,la prevalencia de los antígenos más importantes del sistema Rh, en la que se observa la siguiente relación: 17.41% de la población estudiada expresan los cinco antígenos, tanto en el sexo femenino 19.51%, como en el sexo masculino 15.81%, presenta una mayor frecuencia el fenotipo EDc 30.59% con un 27.10% en el sexo femenino y un 33,6% en el sexo masculino. Los fenotipos edc con 29.06%de frecuencia junto a edcc con 1.65%,de frecuencia, edc con 0.94% de frecuencia, presentan riesgo de sensibilizarse ante una transfusión o embarazos que vehiculicen eritrocitos con antígenos c y E ya que esta población carece de alguno de estos antígenos considerados más inmunógenos del sistema Rh. El fenotipo O del sistema ABO es el más frecuente en la población donante en estudio, se tiene un 79.29%, distribuyéndose de acuerdo al sexo en un 76.15% para el sexo femenino y 81.70% en el sexo masculino los demás fenotipos presentan una menor frecuencia. De acuerdo a procedencia el 86.45% de los donantes son provenientes del altiplano y presentan el grupo O con el factor Rh positivo en un 86.45%, siendo un 6.25% pertenecientes al grupo O Rh Negativo cuya población es procedente de diferentes países. 3

12 ABSTRACT The study of blood groups has been very important for the knowledge of human genetic, physiopathology of certain kind of hemolytic anemia but is has a special meaning in the field of transfusional therapeutic also it takes importance with studies about ethnics origin. The objective of this work paper has been to know the distribution phenotype frequencies of the erythrocyte antigen groupsabo and Rh. at Banco de Sangre de ReferenciaDepartamental Cochabamba s doners. A comparison of the obtained results with genetic frequency of these genetic molecular markers has been made in other populations of Bolivia (CajaPetrolera La Paz) and other countries such as Mexico, Chile, and Brazil. The donor selection has not been realized, the investigation has been realized with men and women that donated on October 15th to November 29th The samples are taken according the Ethic Manual for Blood banks that in the 78 th article indicates that the Blood banks employees will proceed with investigations for the continued improvement. The sample s size was 850 people, 481 were male and 369 were female. This study allows establishing according to the estadisticanalysis of the phenotype frequencies distribution, that in the donor s population from Banco de Sangre de Referencia Cochabamba the existence of the most antigenssignificantof the Rh. system. In wich can be observed that nextconexion: 17.41% of studied population the five antigens, as in female 19.51% as in male 15.81% presents a more frequency of EDc phenotype 30.59% with 27.10% female and 33.6% male. 4

13 The edc phenotypes29.06%,the edcc 1.90%, the edc 0.94%, present the risk of been sensitized with a transfusion or a pregnancy that attach erythrocyte with c and E antigens. The O phenotype of ABO system is the strongest of the studied donors population, it has a 79.29%, distributed according the sex in 76.15% female and 81.70% male, the rest of the phenotypes present less frequency. According to Etnia the 86.45% of the donors are from the altiplano (high land of Bolivia) and they present O group with RH factor positive and 6.25% present O factor with Rh. factor negative, which populationis foreign. 5

14 I.-INTRODUCCIÓN Losgrupossanguíneos permiten la clasificación sanguínea de acuerdo con las características presentes o no en la superficie de los glóbulos rojos, organizadas a su vez en sistemas. Las dos clasificaciones más importantes para describir grupos sanguíneos en humanos son los antígenos del sistema ABO y antígenos D del sistema Rh. Lossistemassonunconjuntodeantígenosdelamembranaeritrocitariacomún único cromosoma asignado, cuya expresión es controlada por un único gen polimórfico o por genes contiguos homólogos. Comparten la misma estructura bioquímica y presentan distribución variada entre individuos de la misma especie. El sistema Rh tiene una importante trascendencia clínica, debido al elevado poder inmunogénico de sus antígenos (especialmente el "D"), jugando un papel preponderante en la Enfermedad Hemolítica Feto neonatal (E.H.F.N), en las Reacciones Hemolíticas Transfusionales (R.H.T) y transfusiones ineficaces. Es uno de los sistemas de grupos sanguíneos de mayor polimorfismo, está formado por aproximadamente 44 antígenos, definidos por métodos serológicos, que se encuentran en una lista numerados del RH1 al RH51; 7 de los cuales fueron declarados obsoletos por la ISBT. Actualmente se conocen29sistemas de grupos sanguíneos, 42 genes, 932 alelos y 270 antígenos 1 ; los que adquieren mayor interés en su tipificacióndebido a que juegan un importante papel en la obstetriciaylamedicinatransfusional son el Sistema ABO y Rh. 6

15 Pero no sólo en este marco adquieren importancia los grupos sanguíneos, la identificacióndelconjuntodeantígenosdetectadosenloseritrocitosconstituye el fenotipo el cuál expresa el genotipo más probable del individuo según las frecuencias génicas de la población, de ésta manera su determinación es importante en caso de estudios sobre el origen étnico 11. Entre las técnicas para la determinación de los antígenos expresados en la superficie de los eritrocitos, como método convencional se tiene al método en tubo y como método automatizado el de las tarjetas (gel). En éste trabajo se introduce la técnica de microplaca útil sobre todo en Bancos de Sangre,ya que adquiere importancia debido a las ventajas que presenta frente a los métodos convencionales, siendo una muy buena alternativa para procesar gran número de muestras sin el costo que supone la automatización. La microplaca suplanta a 96 tubos de ensayo. Una ventaja importante es el ahorro de reactivo debido alas pequeñas cantidades que se utilizan por la dilución que se realiza de los antisueros en 8 a 16 veces su volumen,lo que reducecostos. Otra ventaja es la igual o mayor sensibilidad por la equivalencia de antígenos presentes con relación al antisuero, evitando el efecto Prozona. La necesidad de equipamiento especial es escasa y la estandarización es fácil permitiéndonos cumplir con la exigencia y especial cuidado de los detalles técnicos. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 7

16 Debido al interés clínico que presenta el sistema Rh y conociendo que sus antígenos son sumamente inmunogénicos, se formula como problema la investigación de la frecuencia del fenotipo del sistema Rh, que presentan en donantes de sangre efectivos del banco de Sangre de referencia Cochabamba (población representativa) considerandoque podría ser una de las causas de aloinmunización al momento de transfundir a un receptor esas unidades extraídas. JUSTIFICACION 8

17 El sistema Rh sigue en importancia por su significado clínico al sistema ABO siendo éste el más complejo y polimórfico de la membrana del glóbulo rojo. Cada individuo posee un conjunto diferente de antígenos eritrocitarios. Existen al día de hoy cerca de 29 sistemas antigénicos conocidos, más algunos antígenos diferenciados que aún no han sido atribuidos a ningún sistema específico. Es difícil (si no imposible) encontrar dos individuos con la misma composición antigénica. De ahí la posibilidad de la presencia, en el suero, de anticuerpos específicos (dirigidos contra los antígenos que cada individuo no posee), lo que condicionan a produciruna aglutinación o hemólisis cuando ocurre una transfusión incompatible. Los diferentes sistemas inducen la formación de anticuerpos según su mayor o menor antigenicidad, por lo que algunos son más comunes y otros, más raros. El gran interés clínico de este sistema, esdebido a que sus antígenos son sumamente inmunogénicos especialmente los cinco más importantes (E,e,D,C,c), existen cuarenta y ocho antígenos de los cuales el de mayor poder sensibilizante es el D, le siguen en importancia el c y el E, los cuales pueden causar reacciones hemolíticas post-transfusionales, originar la enfermedad hemolítica del recién nacido y aumentar el riesgo de rechazo en trasplante de órganos en personas poli transfundidas debido a la sensibilización. Los antígenos C, c, D, e y E pueden en determinadas circunstancias estimular la formación del correspondiente anticuerpo, por lo que es necesario conocer la presencia de estos antígenos en nuestra población. 9

18 El presente trabajo permitirá conocer datos sobre la frecuencia de distribución de los cinco antígenos más importantes del Sistema Rh en nuestra población donante que asiste al Banco de Sangre de Referencia Cochabamba. No se cuenta con estudios publicados sobre el mismo tema en nuestro departamento, solo se cuenta con un trabajo realizado en la ciudad de La Paz la que se toma como referencia, a su vez se convierte este trabajo en un estudio de línea para futuras investigaciones con el propósito de conocer la distribución característica de nuestra región. HIPÓTESIS DE LA INVESTIGACIÓN La tipificación o determinación del fenotipo del sistema Rh, antes de realizar la transfusión de un hemocomponente reduce la posibilidad de aloinmunización en los receptores y principalmente en mujeres en edad fértil. La no determinación dela expresión de sus principales antígenos inmunógenos del sistema Rh, aumenta las posibilidades de aloinmunización, pudiendo ser una de las causas de RHFN, o reacciones Hemolíticas en politransfundidos. OBJETIVOS 10

19 OBJETIVO GENERAL Investigar la frecuencia del fenotipo del sistema sanguíneo Rh, aplicando el método de aglutinación en Microplaca en donantes efectivos que acuden al Banco de Sangre Regional de Referencia Cochabamba, en el periodo de Octubre a Noviembre del año OBJETIVOS ESPECÍFICOS Conocer la frecuencia real de los cinco antígenos más inmunógenos, según género, en la población que asiste a donar al Banco de Sangre de Referencia Cochabamba. Determinar la frecuencia de los antígenos del Sistema Rh investigados con relación a los fenotipos del Sistema ABO. Demostrar la validez de la técnica de Hemaglutinación en microplaca para el estudio de fenotipo Rh. II.-MARCO METODOLÓGICO 11

20 2.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN La investigación fue de tipo descriptivo cuantitativa, no experimental, para determinar la LA FRECUENCIA DE ANTÍGENOS DEL SISTEMA RH, APLICANDO EL MÉTODO DE HEMAGLUTINACIÓN EN MICROPLACA EN DONANTES EFECTIVOS DEL BANCO DE SANGRE DE REFERENCIA COCHABAMBA. El presente se trata de un estudio de tema definido, es de carácter descriptivo ya que describe los fenómenos, y características del grupo en estudio, no se pretende modificar ningún factor que interviene en el proceso, es de corte transversal, esto porque el estudio mide una sola vez la o las variables, además se considera un estudio prospectivo ya que toda la información se recogerá para los fines específicos de la investigación. 2.2 POBLACIÓN EN ESTUDIO La población está constituida por el 100% dedonantes efectivos varones y mujeres, que acudieron al Puesto fijo y Unidad Móvil del Banco de Sangre de ReferenciaDepartamental en el periodo del 20 de Octubre al 20 de Noviembre El universo ó la población de estudio estuvo constituida por 850 Donantes que corresponden a un grupo etario de 18 a 60 años de edad, 481 fueron del sexo masculino y 369 del sexo femenino. Por tratarse de un estudio poblacional donde se pretende conocer la frecuencia del antígeno Rh de la población donante, no se aplicó la teoría del muestreo, se realizó la investigación en todo el universo, de acuerdo a criterios por conveniencia del investigador. 12

21 Criterios de Inclusión Para el presente trabajo de investigación se incluyó todas las muestras de sangre de todos los donantes voluntarios que acudieron a los servicios de puesto Fijo y unidad móvil del Banco de Sangre de Referencia Cochabamba en los meses de 15 de Octubre al 23 de Noviembre del Criterios de Exclusión No se excluye ninguna muestra de sangre de los donantes ya que en caso de presentar hemólisis la muestra tomada en tubo o cualquier accidente que se pudo presentar, se procedió a la toma de muestra de un segmento (tubuladura) de las unidades de sangre procesadas como concentrado de Glóbulos Rojos (CGR), de la misma forma se tipificaron aquellas muestras quefueron fenotipados por el método en tubo, como contra prueba de control, es el caso de muestras de donantes negativos. 2.3 INSTRUMENTOS PARA LA RECOLECCIÓN DE INFORMACIÓN Para la recolección de información se utilizó un formulario el cuál fue llenado con los datos personales del donante en el momento de realizar el tamizaje Laboratorial tomando en cuenta la confidencialidad para lo que se usó solamente código de donante e iníciales,verificando la veracidad a través del código de barras, posteriormente se llenó el registro con los resultados del análisis Laboratorial. El mencionado instrumento se encuentra en el Anexo. 13

22 2.4 TAMAÑO DE LA MUESTRA El tamaño de la muestra se calculó con la aplicación de la fórmula para variables cualitativos y población infinita, para lo cual se ha considerado un error aceptable del 5% un nivel de confianza del 95%. Se utilizó la metodología de muestreo descrita a continuación: n = S 2 V 2 S2 = p (1- p) Donde p es la proporción de la población que cuenta con el atributo en estudio. V2 = Error Standard fijados por nosotros, nivel de confiabilidad, ajustando n con: n = n 1+n/N Cálculo: N= (Población Banco de Sangre de Referencia CBBA) P= 0.1 (Probabilidad de ocurrencia de Antígenos presentes en la membrana del eritrocito) V= 0.5 (Error Standard de la muestra) Hallar el tamaño de la muestra: 14

23 n = S (1 0.5) 0.25 = = V x n = 625 n = = 599 Usando éstos datos se tuvo que el número de donantes necesario para realizar una inferencia con error máximo de 5% fue de 599. La elección del elemento muestral de la población de estudio fue sistemático tomando las muestras de todos los donantes que hicieron efectiva su donación sin importar los resultados inmunoserológicos, se continuó así sucesivamente hasta completar el tamaño de muestra propuesto. 2.5 RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN La información se recolectó de la sangre extraída de 850 donantes del Banco de Sangre de Referencia Departamental Cochabamba. 2.6 OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES Variables Definición Clasificación de Dimensión o Instrumento Tipo de 15

24 Fenotipo Rh Fenotipo ABO Género Efecto observable de los genes heredados traducido como presencia o ausencia de los Ag D, C, c, e, E. Efecto observable de los genes heredados traducido como presencia o ausencia de los Ag A y/o B Carácter distintivo basado en el tipo de Gametos producidos por las gónadas. la Variable Indicadores Escala Cualitativa Cualitativa Cualitativo Positivo Negativo Positivo Negativo Varón Mujer Método de aglutinación en Microplaca Método de aglutinación en Microplaca Registro Nominal Nominal Nominal MATERIAL Y MÉTODO El presente estudio fue realizado en el laboratorio de Inmunohematología del Banco de sangre de referencia Departamental Cochabamba, en todos los donantes efectivos que asistieron a donar en puesto fijo y unidad móvil, sin exclusión de aquellos que ya fueron fenotipados por el método en tubo. Se usaron antisueros comerciales Monoclonales específicos de la firma comercial DiaMedy antisueros ABO de la firma comercial DiaLab. Se usó la técnica en microplaca, en 16

25 todos los casos se siguieron las instrucciones del fabricante (ver Anexo 2). El estudio se llevó a cabo durante un periodo de dos meses. Para lograr los objetivos del estudio, se realizó previamente el control de calidad a los lotes de reactivos a ser utilizados (anti-sueros comerciales) con el uso de células conocidas (células selectoras I,II y III) como también controles de factor Rh conocido tanto positivo como negativo y células A y B comerciales. (Ver anexo 3Técnica) MUESTRA El material utilizado fue una muestra de sangre anticuoagulada obtenida con EDTA, de cada persona que hizo efectiva su donación, se preparó una suspensión de eritrocitos del 2 al 4% de acuerdo a protocolos estandarizados. Para la realización de la prueba inversa del sistema ABO se requiere de suero de donante. Participaron en total 850 donantes. 2.7 CONTROL DE CALIDAD DE LOS ANTISUEROS Los anti-sueros usados en la investigación, fueron sometidos previamente a un control de la calidad de acuerdo a normas establecidas, donde se determinóla apariencia, reactividad, especificidad, título, potencia, escore, la intensidad y la avidez de los antisueros. El título, tiene especial importancia para el procedimiento de estandarización de la presente técnica en microplaca, serefiere a la inversa de la última dilución con resultado positivo (Aglutinación macroscópica), la aglutinación se mide en cruces. 17

26 VALORACIÓN DE LA AGLUTINACIÓN AGLUTINACIÓN EN CRUCES DESCRIPCIÓN 4+ Aglutinado único compacto 3+ Aglutinado grande con otros pequeños 2+ Varios aglutinados de regular tamaño 1+ +/- Muchos aglutinados pequeños con fondo claro Muchos aglutinados pequeños con fondo rojo (Hematíes Libres) 0 Ausencia de aglutinado Fuente: Control de calidad de Dra. Elena Franco *Ref. Calidad de los análisis Inmunohematológicos Para realizar lasdiluciones de los anti-sueros en la presente investigación se usó micro pipetas calibradasdisminuyendo el error aleatorio. El Escorese refiere a la sumatoria del valor numérico de cada dilución, este control permitió determinar la calidad de los antisueros a ser utilizados, los valores asignados de acuerdo a cruces de aglutinación son los siguientes: VALORACIÓN NUMÉRICA DE LA AGLUTINACIÓN ESCORE CRUCES AGLUTINACIÓN Aglutinación completa de todas las células en un fondo claro 18

27 /- Aglutinación de la mayoría de las células en un fondo claro Aglutinados pequeños, de igual tamaño en fondo rojo. Aglutinados muy pequeños, pero definidos en un fondo rojo Positividad débil a simple vista, puede dar resultados dudosos 0 0 Ausencia de aglutinación Fuente: Control de calidad de Dra. Elena Franco Ref. Calidad de los análisis Inmunohematológicos TITULACIÓN DE ANTISUEROS Las técnicas en microplaca muestran mayor sensibilidad que pruebas en tubo 20, es por ello que es posible realizar diluciones de los antisueros o llamados sueros reactivos. En la presente investigación el diluyente empleado fue albúmina bovina al 3%, determinando el grado de dilución después de titulaciones frente a hematíes con antígenos conocidos MATERIAL Y EQUIPOS Los materiales y equipo que se utilizó en éste método son: 19

28 Centrífuga de microplaca desmontable (tubos), marca HETICH Estufa incubadora de 37ºC, Marca Memmert. Micropipetas de 50, 100 ul, 1000 ul marca HUMAN. Tubos de Hemólisis de vidrio. Gradilla para tubos Rehesuscopio (visor) Marcador Guantes de Látex Tips o puntas descartables Piseta REACTIVOS Los reactivos utilizados para la titulación de los antisueros se presentan en la tabla (2). 20

29 Tabla. 2. REACTIVOS EMPLEADOS Y CONDICIONES DE TRABAJO Cantidad Utilizada Frascos 1 X 10 ml 1 X 10 ml 1 X 10 ml Antisueros Origen Nº de lote DiaClon anti-c monoclonal DiaClon anti-c monoclonal DiaClon anti-e monoclonal DiaMed / Suiza DiaMed / Suiza DiaMed / Suiza Medio, Temperatura y concentración de eritrocitos Salino a 37ºC 4% Salino a 37ºC 4% Salino a 37ºC 4% Técnica Tubo Tubo Tubo 1 X 10 ml 1 X 10 ml 1 X 10 ml 1 X 10 ml 1 X 10 ml 3x1000 ml DiaClon anti-e monoclonal Plasmatec Anti-D Plasmatec Anti-A Plasmatec Anti-B Plasmatec Anti-AB Suero fisiológico isotónico 0.9% DiaMed / Suiza USA USA USA USA Nacional (La Paz) Salino a18 ºC y Tubo 37ºC 4% Salino a 37ºC 4% Tubo Salino a 18ºC 4% Tubo Salino a 18ºC 4% Tubo Salino a 18ºC 4% Tubo AZ - - Fuente: Elaboración propia PRINCIPIO DEL MÉTODO Titular significa medir la cantidad de un determinado anticuerpo existente en un suero (Método semicuantitativas) por lo que se define como la concentración de un Ac específico en 21

30 el suero para un Ag en particular, se calcula determinando cuántas diluciones seriadas del suero se pueden realizar antes de que se dejen de observar uniones. FIGURA 1 Fuente: Técnica de microplaca de Elena Franco 22 Se llevó a cabo, realizando diluciones, del antisuero en estudio y enfrentando cada dilución con glóbulos rojos portadores del antígeno correspondiente. (Ver anexo 4 Procedimiento) INTERPRETACIÓN El resultado de la titulación nos determinó, cual es la dilución de los antisueros, para la tipificar los antígenos D, C, c, E, e, en microplaca. Por tanto se utiliza el título mayor cuya dilución permite observar una aglutinación de cuatro cruces (4+) y se realiza la dilución de los antisueros a ése título. 2.8 DETERMINACIÓN DE FENOTIPO Rh EN MICROPLACA Este es un proceder que permite la tipificación de los antígenos del sistema Rh con pequeños volúmenes de reactivos por lo que se convierte en un proceder económico, rápido y 22

31 sensible. La distribución de los antígenos detectada en los eritrocitos de una persona constituye el fenotipo Rh de ésta persona. Se realizara la tipificación de todas las muestras para demostrar la presencia de los cinco antígenos principales, antígenos específicos del sistema Rh, de esa manera se determina la frecuencia de los mismos. (Ver anexo 5 Procedimiento) EQUIPO, MATERIAL, REACTIVOS Estufa incubadora de 37ºC. Centrifuga de mesa para tubos Pipetas automáticas de 50, 100 ul, Tubos de hemólisis de vidrio Gradilla para tubos Marcador Guantes de látex Microplaca de poliestireno con fondo U Antisuero anti-c monoclonal (DiaClon anti-c monoclonal DiaMed / Suiza ) Antisuero anti-c monoclonal (DiaClon anti-c monoclonal DiaMed / Suiza ) Antisuero anti-d monoclonal (Plasmatec Anti-D USA ) Antisuero anti-e monoclonal (DiaClon anti-e monoclonal DiaMed / Suiza ) 23

32 Antisuero anti-e monoclonal (DiaClon anti-e monoclonal DiaMed / Suiza ) Solución Salina 0.9 % Suspensión de eritrocitos al 2-5 % de las muestras en estudio Control de células antígeno-positivas y antígenas negativo. Albúmina PRINCIPIO DEL MÉTODO El Principio se basa en la acción del anti suero, que causa directa aglutinación con el correspondiente antígeno de los globulos rojos haciendo evidente la unión antígenoanticuerpo. La no aglutinación indica generalmente ausencia del antígeno investigadon( antígenos C,c,E,e y D). (Ver anexo 5 Procedimiento) INTERPRETACIÓN Se debe observar las características de los glóbulos rojos resuspendidos o se debe analizar el flujo de las células cuando se inclina la placa a 60ºC. La reacción negativa provoca un descenso de los hematíes de manera uniforme (forma de lágrima) al resbalar por el pocillo. La reacción positiva da una imagen de un aglutinado puntiforme en el fondo del pocillo. 24

33 El aglutinado se puede representar por cruces de 4+ a 1+ dando un patrón de positividad ligeramente distinto, pero en cualquier caso totalmente diferenciado a la imagen de lágrima del resultado negativo. FIGURA 2 PROTOCOLO DE TRABAJO EN MICROPLACA PARA DETERMINACIÓN DE FENOTIPO Rh Fuente: Técnica de microplaca de Elena Franco Figura Nº2 Se ha seguido el mismo sistema de identificación En las columnas de 1 al 12 se depositan las muestras de eritrocitos lavados En las filas D al H se depositan los anti-sueros comerciales diluidos al título estandarizado (1/8 estandarizado en caso antisueros monoclonales C,c,E,e, en caso de 25

34 antisuero D se titula a 1/4 por tener menor potencia, por ser estas la última dilución en la que presenta aglutinación 4+) En las filas A ybse depositan los controles provenientes de panel comercial que lleva los cinco antígenos En la fila C se deposita el control negativo que es albúmina al 3% FUENTE: Elaboración Elena Franco FIGURA Nº3Resultados de la determinación de fenotipo Rh (prueba hemática en Microplaca) 2.9 TIPIFICACION ABO EN MICROPLACA 26

35 Se procederá a la tipificación de todas las muestras para determinar los grupos sanguíneos ABO en Microplaca por los siguientes métodos: 1. Método Directo o eritrocitario 2. Método Inverso o serológico EQUIPO, MATERIAL, REACTIVOS Estufa incubadora de 37ºC Pipetas automáticas de 10, 100 ul. Tubos de hemólisis de vidrio Gradilla para tubos Marcador Guantes de látex Microplaca con fondo U. Tips o puntas descartables Piseta. Muestras de suero en estudio Solución Salina al 0.9% Antisuero anti-a monoclonal USA Lote Antisuero anti-b monoclonal USA Lote Antisuero anti-ab monoclonal USA Lote Suspensión de pool de eritrocitos al 2-4% de grupo A, B y O Suspensión de eritrocitos al 2-4 % de las muestras en estudio 27

36 Células control con antígenos positivos y negativos PRINCIPIO DEL MÉTODO Las pruebas de rutina para la tipificación de ABO consiste en el análisis de glóbulos rojos con antisueros anti-a y anti-b (pruebas directas o eritrocitarias) y a su vez el análisis de plasma o suero con glóbulos rojos A y B (pruebas inversas o serológicas) ambas técnicas son utilizadas como control al momento de la tipificación(ver anexo 6 Procedimiento). Método Directo o eritrocitario Los antígenos del sistema ABO, presentes en los eritrocitos se unen al anti-suero específico haciéndose evidente la unión antígeno anticuerpo, visualizándose a través de la aglutinación. Método inverso o serológico Al ser una prueba inversa los anticuerpos Anti-A o Anti-B presentes en el suero, al ponerse en contacto con eritrocitos conocidos, que presentan en su superficie antígenos A o B, hacen evidente la unión antígeno-anticuerpo por la visualización de una aglutinación o hemólisis. Se hace uso un pool de eritrocitos O (Ausente de antígenos) como control. 28

37 INTERPRETACIÓN Se debe observar las características de los glóbulos rojos resuspendidos y se analiza el flujo de las células cuando se inclina la placa a 60ºC. o 90ºC. La formación de aglutinación (reacción antígeno anticuerpo) en el fondo de la micro cubeta constituye un resultado positivo, puede ser categorizada la aglutinación como 4+ a 1+ La reacción negativa da una imagen de manto uniforme en el fondo del pocillo. Se compara los resultados con controles positivos y negativos como muestra la tabla Nº 1 EJEMPLO DE RESULTADOS Tabla Nº1 BANCO DE SANGRE DE REFERENCIA COCHABAMBA CODIGO Anti Anti- Anti- Anti- Rhesus Hemat. Hemat. Hemat. A B AB D cont. A B O GRUPO A O AB B O A O- FUENTE: Elaboración Propia 29

38 La técnica permite realizar en la misma placa ambas pruebas, tanto la directa o Eritrocitaria como la Serológica o indirecta PROTOCOLO DE TRABAJO EN MICROPLACA PARA DETERMINACIÓN DE FENOTIPO Rh FUENTE: Elaboración Técnicas en Microplaca Dra. Elena Franco Figura 4 Columnas 1 a 12: muestras. Filas A, B, C, D, E: suspensiones de hematíes. Filas F,G, H. suero o plasma. 30

39 En las columnas de 1 al 12 se depositan las muestras de eritrocitos lavados y suero o plasma en las cubetas F a H. se procede al análisis de 12 donantes por microplaca. En las filas A al E se depositan los anti-sueros comerciales diluidos al título estandarizado (1/16) para sistema ABO ya que tienen mayor potencia que los antisueros D, C, E, e y c En las filas F y G se depositan los sueros o plasma en estudio a la que se adhiere las células con antígenos conocidos. La fila H sirve de control la misma nos informa un valor negativo. 31

40 III. MARCO TEORICO 3.1 SISTEMA DE GRUPO SANGUÍNEO Se denomina sistema de grupos sanguíneos a un conjunto de antígenos que conservando su independencia se transmite como una unidad. Cada sistema lo forman varios antígenos que admiten combinaciones casi infinitas y hacen posible una clasificación de la sangre característica y prácticamente irrepetible en cada individuo. En medicina clínica tiene especial interés, tanto para la prevención como el tratamiento de las reacciones Transfusionales, así como en la enfermedad hemolítica del recién nacido. 3.2 GRUPO SANGUÍNEO Se puede definir a los grupos sanguíneos como características inmunológicas presentes o no en la membrana de los glóbulos Rojos o en las proteínas del plasma o suero de la sangre de algunos de los miembros de la especie y ausentes en otros. 32

41 Tipos de grupos sanguíneos (antígenos públicos) Fig. Extractada de Antonio Casas Moreno (1997) 3er Masson (2) Los antígenos de grupos sanguíneos ABO, H, P, I, Lewis se encuentran estrechamente relacionados con carbohidratos y reflejan la actividad de enzimas glucosiltransferasas genéticamente determinadas. Las moléculas de carbohidratos portan azucares que pueden determinar varios antígenos, y dan lugar a una oportunidad de interacción entre productos genéticos en varios sistema. Estas estructuras están bajo estricto control genético, heredándose de acuerdo a las leyes de Mendel. Los grupos sanguíneos son características permanentes de los individuos, se nace y se muere con ellos. 33

42 3.3 ANTIGENOS ERITROCITARIOS Son distribucionesinmunoquímicas presentes en la membrana de los glóbulos rojos pudiendo ser glucolípidos, proteínas y glucoproteínas. Estos antígenos eritrocitarios son el producto de un gen situado en la membrana del hematíe estas reúnen las características necesarias (tamaño, complejidad, accesibilidad, etc.) para que al ponerse en contacto con las células inmunocomponentes de un sistema inmunitario sea reconocido por un anticuerpo específico. La mayoría de los antígenos se hallan bien expresados en el recién nacido, otros son débiles y algunos prácticamente ausentes, esto es debido a que la membrana del eritrocito del lactante presenta escasa cantidad de cadenas de oligosacáridos los cuales se unen los azucares inmunodominantes, radicando la diferencia con el adulto en el número de ramificaciones presentes en la membrana celular a diferentes edades 1. Su distribución es variable; así los antígenos del sistema ABO están presentes en todas las células de la sangre, tejidos y células corporales; mientras que los pertenecientes a los Rh se localizan exclusivamente en el eritrocito. Los antígenos de otros sistemas sanguíneos Kell, Duffy y Kidd tienen además de su localización eritrocitaria, presencia en las otras líneas celulares sanguíneas y diversos tejidos. Así los anticuerpos formados para determinado antígeno correspondiente, inicia la destrucción de la célula portadora que se consigue por activación del complemento o por fagocitosis. El que predomine la activación del complemento o la fagocitosis depende principalmente del anticuerpo de tipo IgG, que se forma en mayor producción. 34

43 Antígenos y anticuerpos eritrocitarios de acuerdo a grupo sanguíneo Fuente Fig. Extractada de Antonio Casas Moreno (1997) 3er Masson (2) Aglutinación reacción Antígeno Anticuerpo de acuerdo a grupo sanguíneo Fuente Fig. Extractada de Antonio Casas Moreno (1997) 3er Masson (2) 35

44 3.4 SISTEMA Rh Es una agrupación de varios antígenos productos de dos genes adyacentes y homólogos del brazo corto del cromosoma 1, ubicados en la región p p34.3que codifican los poli péptidos no glucosilados, que expresan la actividad antigénica Rh, denominados RHD y RHCE.(AABB 14era. Ed. Pág. 328) El gen RHD determina la presencia de una proteína de membrana que confiere actividad D a los glóbulos rojos, el otro gen RHCE determina los antígenos C,c,E y e; sus alelos son RHCe, RHCE, RhcE y Rhce. Los productos de estos genes son proteínas que contienen 417aminoácidosintegrada a la bicapa de la membrana del eritrocito, estas proteínas atraviesan la membrana eritrocitariadoce veces y solo exhiben ramas aminoacídicascortas en el exterior (rulos externos), en la cual se expresan los respectivos antígenos(fig.4), estospolipéptidosson ácidos grasos acetiladosynocontienen carbohidratos. Esquema de genes y proteínas RHCE, RHD y RHAG Fuente Fig. AsociacióndeHemoterapiaeInmunología,AmericanAssociationofBloods Bank.Manualtécnico.13ºedición, ArgentinaPág.305 (5) 36

45 Se desconoce el papel biológico de las proteínas Rh, se cree que actuarían como transportadores de cationes. Pero tienen una importancia fundamental en la estructura de la membrana del hematíe ya que se comprobó que, su ausencia (en los muy raros casos Rh null ) compromete a la morfología eritrocitaria de tal manera que produce verdaderos esferocitos, con una viabilidad globular obviamente disminuida. La presencia o ausencia de gen RHD en el ADN humano determina las bases moleculares del polimorfismo RhD positivos y RhDnegativos 2. Los individuos RhD positivos poseen los dos genes RH, mientras que el fenotipo RhD negativos resulta de la ausencia del gen RHD, estos genes son heredados por los progenitores como carácter mendeliano; y se expresan a partir de la sexta semana de vida intrauterina DESCUBRIMIENTO DE LOS ANTÍGENOS SISTEMA Rh Se identificó por primera vez anticuerpos humanos contra el antígeno D, en 1939 por Levine y Stetson, después de haber encontrado el anticuerpo en el suero de una mujer que acababa de dar a luz a su segundo hijo, el cual tuvo una enfermedad hemolítica del recién nacido; esa misma mujer recibió una transfusión de sangre de su marido que inmediatamente dio lugar a una reacción hemolítica, se trataba de un anticuerpo diferente y potente capaz de destruir los eritrocitos del padre aunque presentaban compatibilidad del Sistema ABO. Posteriormente en 1940 Landsteiner y Wiener continúa investigando y descubren después de una inmunización con eritrocitos de mono Rhesus a cobayos y conejos provocando una aglutinación en los glóbulos rojos del 85% de las personas evaluadas con el anticuerpo 37

46 obtenido y lo denominan factor Rh al determinante correspondiente. En el mismo año Wiener y Petersinforma la presencia de anticuerpos anti-rh en individuos carentes del antígeno pero que habían recibido trasfusión ABO compatibles en el pasado, es por todo ello que se determina la importancia clínica. Las personas cuyos eritrocitos aglutinaban con el suero anti-rhesus fueron denominadosrh positivos ylosquenoaglutinabanrhnegativos. En el año 1961se establecióquelosantígenos detectados porlossueros anti- Rhesusanimalesy anti-dhumanos noeranidénticos,pero para entonces ya el Sistema Rh era conocido con ese nombre. El primer antígeno descubierto del Sistema Rh, fue el D; a mediados de los años40 también se identificó los cuatro antígenos adicionales (C, c, e, y E) que forman parte del polimorfismo del Sistema Rh. Hallazgos ulteriores elevaron el número de antígenos relacionados al Sistema Rh, muchos de los cuales exhiben variaciones cualitativas y cuantitativas, pero en la mayoría de los casos los cinco antígenos principales D, C, c, E, e y sus respectivos anticuerpos son responsables de más del 99% de los eventos clínicos que involucran al Sistema Rh. 38

47 3.4.2 CONSIDERACIONES GENÉTICAS Y BIOQUÍMICAS Se tuvo muchos intentos para explicar el control genético de las expresiones del antígeno Rh, fue Wiener en 1950 quien expone sobre la presencia de un solo locus con múltiples alelos en la que comprendían numerosos antígenos o llamados también aglutinógenos, quienes daban lugar a la formación de anticuerpos o aglutininas específicas. Ficher y Racededucen en la presencia de alelos equitativos en tres locis individuales pero ligados estrechamente en el cromosoma 1. Elmodelogenéticomásrecienteeseldescritoen1986porTippet,quiensostenía la existencia dedoslociestructurales estrechamenteligadosdelcromosomaquienes determinanla producción de los antígenos del sistema Rh. En1990Colinycolaboradoresdemostraronmediante elanálisis deldnaqueel locusrhdelosindividuosrhpositivos estácompuesto pordosgenesdiferentesyenlosindividuos Rhnegativosunodeestosgenes sehallaausente,coneste hallazgoseconfirma la teoríapropuestaportippet. 39

48 3.4.3 NOMENCLATURA Se planteó tres sistemas de nomenclatura antesdelosavancesque son recientes enelconocimientodelagenéticadelsistemarh. Wiener Menciona una nomenclatura en la que se tiene un terminología Rh-Hr ya que tenía la convicción de que el producto del gen era un aglutinógeno y este se caracterizaba por numerosas especificidades serológicas a las que denomina factores y divideendossubclases,los que están con el factor Rhesus (RHD) se llaman factores Rhson los que codifican D y se los designo como R, los otros factoresrelacionados conlosfactoresrhesus(rhce) sedenominan hr son los que no codifican D y se los designa como r. LateoríadeFisheryRacepropone que losnombresdelosantígenosdelsistemarh sean iguales a sus correspondientes genes, son ellos los que postulan la terminología CDE esta propuesta no explica por completoalgunosperfilesantigénicosrh,peroesmássencilla parainformar losantígenos Rh que son codificados por los genes RHD yrhceen la que consideran tres conjuntos de genes estrechamente vinculados (C y c, D y d, E y e), a la ausencia del D aceptan nominar como d. Lanomenclatura derosenfieldnotieneencuentalaestructuragenética ysolo tratade construirunsistemaprácticoquefacilitelaclasificacióndelosantígenos quesedeterminan.cadaantígenoseexpresaporunnúmerodeterminado(1,2, 3,etc.)ysuausencia,porelmismonúmeroperoprecedidoporelsignomenos(-1,-2, etc.). 40

49 ParafinesdecomprensiónseutilizalanomenclaturadeFisheryRace,aunquela SociedadInternacionaldetransfusiónsanguíneaagrególaterminaciónnumérica para los antígenos Rh, basándose en la nomenclatura descritaporrosenfield. Patricia Tippet en 1986 enuncia una teoría que parece ser más exacta que las tres antes mencionadas en la que ella determina que son dos los genes responsables, un gen RHD que codifica al antígeno D y la ausencia de éste gen no producirá antígeno, un segundo gen que codifica a los antígenos C, c, E, y e. El cuadro Nº1 muestra la Nomenclatura de las tres mencionadas en párrafos anteriores, en la que se aplica la teoría de Wiener, Fisher, RaceyRosenfield. 41

50 CUADRO Nº 1 Fuente Fig.: Vives. Joan. Aguilar Josep. Manual de técnicas de Laboratorio en Hematología. Barcelona P.342. (6) 42

51 3.5 OTROS ANTÍGENOS Rh O LLAMADOS ANTÍGENOS COMPUESTOS Se asignaron 52 números a los antígenos Rh, algunos fueron anulados o reasignados, pero de los 48 actuales, solo los D, c, E, e, Cy sus anticuerpos correspondientes son responsables de más del 99% de los eventos clínicos que involucran al sistema Rh. Es una característica más del sistema Rh Hr que algunos de los efectos de posición en la estructura sea éste cis o transdeterminen la producción de compuestos antigénicos, debido a que contienen los mismos antígenos Rhesus, pero dispuestos en posiciones diferentes. Cuando dos genes se encuentran en el mismo cromosoma se denomina posición cisentonces se encuentran codificados por el mismo Haplotipo, y cuando se encuentran en distintos cromosomas se denomina posición trans. Race y Col demostraron que cuando los antígenos C y E se encuentran en posición cis el antígeno C está inhibido y cuando se encuentra en posición trans el antígeno E se inhibe. El antígeno compuesto Ce se presenta cuando el gen C y e se encuentran en posición cis, este antígeno estará ausente cuando C y e sean codificados por diferentes haplotipos, como ocurre en genotipos Cde/cde y en CDe/Cde, estos genes se encuentran en posición tras entonces dicho compuesto antigénico no se produce. El anticuerpo correspondiente al antígeno Ce es el anti-ce que no se comporta como una mezcla de C mas e, no es capaz de aglutinar a los eritrocitos que contengan estos antígenos, sino solo aquellos eritrocitos que contengan C y e enposicióncis. 43

52 El antígeno compuesto f que actualmente se lo denomina Antígeno ce está formado por los genes c y e que se encuentran en posición cis; esto se presenta en genotipos cde, cde y Cd u e (siendo éste un D débil), este antígeno puede dar lugar a la formación de unanticuerpo muy potente que en algunos casos ha sido responsable de la Enfermedad hemolítica del recién nacido. En la membrana del eritrocito se encuentran también los llamados Antígenos asociados, estos se expresan cuando en la dotación genética de la persona hay determinados genes en posición cis. El antígeno G se descubrió en 1958 en una persona que dono sangre cuyo grupo era Rh negativo, pero se evidenció que sus eritrocitos eran aglutinados con casi todos los sueros Anti- CD, esto se explicó postulando la existencia de un nuevo antígeno que se lo denomino antígeno G, que normalmente este antígeno estaba presente en los eritrocitos que poseen los antígenos D o C existiendo una estrecha relación. Para hablar sobre el anticuerpo G se debe mencionar que se pudo aislar el anticuerpo anti-g sensibilizando los eritrocitos de esta donadora con sueros anti-cd, se observó que todos los complejos génicos comunes excepto cde y cde originan G. El descubrimiento del antígeno G permitió explicar porque algunas personas cde desarrollaban un anticuerpo anti CD después de una estimulación feto materna o por una transfusión, en realidad estos anticuerpos son anti-d más G o es anti-cmás G. 44

53 El antígeno compuesto CE o c E están determinados por el mismo Haplotipo, y se expresan cuando están en posición cis, los anticuerpos contra los productos antigénicos cis son infrecuentes pero no excepcionales. 3.6 EXPRESIÓN DE LOS ANTÍGENOS D Se ha planteado diversas hipótesis en los últimos diez años a cerca de los mecanismos moleculares para poder explicar la ausencia del antígeno D, en aquellas personas Rh negativas, se ha determinado que la ausencia es debido a una deleción del RHD, es una condición homocigota con la ausencia del gen RHD o es debido a la presencia de un gen no funcional, siendo éste el mecanismo dominante en personas de raza blanca. La pérdida de la expresión de la proteína D, en las personas Rh negativo, ésta ausencia del gen RHD inactivo o parcial este mecanismo es común en personas de raza negra., es el mecanismo dominante en personas de raza blanca. Cuando se procede a la incubación con anti-d de manera prolongada de los eritrocitos D positivos a la que se añade un suero antiglobulinico se clasifica como Du o D débil este antígeno fue descubierto en el año 1946 donde se otorga esa denominación de Du débil por que posee un número menor de sitios antigénicos, y esto puede deberse a un gen que produce menor cantidad de antígeno o ser resultado del efecto supresor del Haplotipo Ce en posición trans, conocidos como Du de alto y bajo grado respectivamente. Como se trata de una diferencia cuantitativa en cuanto a los sitios antigénicos y no cualitativos de los mismos es que el término Du propuesto por Stratton en 1949 es reemplazado por el de D débil. 45

54 CUADRO Nº 2 GENOTIPO 1 GENOTIPO 2 D C e/d c e D c e/dc e Ce en posición CIS Con respecto al D Ce en posición TRANS Con respecto al D Fuente.: Lo que debe saber sobre el Rh de Thel Daniel S. Gargiulo 2006 Se descubrieron algunos casos en las que individuos fueron fenotipados como Rh positivos, es decir eran portadores del antígeno D pero de la misma forma se sensibilizaban y producían anticuerpos anti-d al ser estimulados con glóbulos rojos portadores de dicho antígeno ya sea por transfusión o embarazos. Estudios demostraron que existen eritrocitos que carecen de una o más partes del complejo antigénico Dnormal, y se los denomina D parciales 15. Las personas que presentan este tipo deantígeno que le falta alguna parte del complejo antigénico puede inmunizarsecontra la parte ausente; el anticuerpo producido reaccionara con los eritrocitos de las personas Rh positivas completas, dando la falsa impresión de un auto anticuerpo anti D en un sujeto Rh positivo. Los estudios moleculares dilucidaron el mecanismo causal de muchos fenotipos Dparciales y demostraron que en la mayoría de los casos los fenotipos resultan delintercambio de nucleótidos entre los genes RhCE y RhD 1. Se ha encontrado algunos tipos muy raros de sangre en las que falta una parte otodos los antígenos Rhesus conocidos. 46

55 En 1951 Race y colaboradores, descubrieron un tipo de sangre que carecía de losantígenos C, c, e y E, y solo poseía el antígeno D, estas personas que tienen elfenotipo D ya sea homo y heterocigoto tiene más D que las personas quepresentan todos los antígenos Rhesus., para su determinación se puede utilizaranti-d incompleto, porque D esta aumentado, estos individuos pueden producirá anticuerpos anti-c, anti-c, anti-e y anti-e. En 1961 Vos y colaboradores descubrieron que una mujer aborigen australiana carecía de los antígenos Rhesus, y el fenotipo dio / - - -y se lo denomino Rhnull (nulo), también se observó en los Estados Unidos este tipo de sangre, mediante estudios se determinó que es el resultado de un gen silencioso o amorfo en el locus Rh o que es causado por la acción de un gen regulador que no forma parte de.los genes Rhesus impidiendo la expresión de los antígenos. Los anticuerpos encontrados en los individuos Rhnull son de varios tipos y aparecen por inmunización. 3.7 ANTICUERPOS DEL SISTEMA Rh Los anticuerpos del sistema Rh son generalmente producto de una respuesta inmune siendo de ocurrencia natural en un 2%, se considera natural cuando aparece en el organismo independientemente al mecanismo de sensibilización (transfusión o embarazo) son de tipo completo o globulinas IgM, estas desaparecen rápidamente de la circulación para dar lugar a los de tipo incompleto, estas son globulinas IgG termoestables que atraviesan la placenta. El anticuerpo inmune más comúnmente encontrado es el anti-d, que es detectado en la fase de anti-globulina o a través del uso de potenciadores como los medios de baja fuerza 47

56 iónica, coloidales o enzimáticos, su presencia es debida a una sensibilización pos transfusional o el paso de eritrocitos D positivas del niño a la madre. Las IgG en su mayoría son del tipo IgG 1 e IgG 3 especialmente en individuos híperinmunizados, en las embarazadas son de un solo tipo, en ambos casos éstos no suelen provocar hemólisis intravascular, debido a que estas inmunoglobulinas son poco fijadoras de complemento y además los sitios de unión antigénicos están muy separados en la superficie eritrocitaria debido a su estructura quedando de esa manera muy distantes entre sí. También se forman anticuerpos anti-rh diferentes al anti-d siendo los más comunes el anti-c y el anti-e, el primero puede encontrarse solo o asociado al anti-d a diferencia del anti- E que siempre se encuentra asociado al anti-d al igual que el anti-c, de estos dos anticuerpos el más importante es el anti-c, ya que es considerado uno de los principales causantes de la EHFN o RHT y siempre es de origen inmune, a diferencia del anti-e cuyo origen inmune es raro, siendo éste más común que el anti-c y siempre este es de origen natural y no inmune, el anti-e es generalmente una IgM que puede producir reacción transfusional pero no EHFN. Anticuerpos concomitantes, por ejemplo las personas Dce/Dceque manifiestan anti-e inmunes, casi con certeza estuvieron expuestas a antígenos c y E. Los anti-c podrían coexistir con los anti-e aunque en forma más débil o indetectable cuando se identifican los anti-e y la transfusión de sangre al parecer E-c+ compatible, podría desencadenar una reacción hemolítica inmediata o algo más tardía. Algunos profesionales creen que estos receptores con anti-e detectables, constituyen casos especiales como en las personas inmunizadas cuyos eritrocitos son E y c negativos, los anti-c suelen acompañarse de anti-e, se prefiere transfundir 48

57 sangre del fenotipo Rh del paciente, aun cuando los anti-c son indetectables en los procedimientos de rutina. Los anti-e no siempre acompañan a los anti-c, ya que el paciente podría haber estado expuesto a antígenos c, pero no a E. 3.8 DESCUBRIMIENTO DE LOS ANTÍGENOS DEL SISTEMA ABO El sistema ABO fue descubierto en el año 1901 por Landsteiner, convirtiéndolo en el primer grupo sanguíneo; el nombre del sistema proviene de los tres tipos de grupo que se identifican: los de antígeno A, B, y O, es tanta la importancia principalmente en medicina transfusional que la transfusión de sangre incompatible produce hemólisis, anemia, fallo renal, shock y muerte. El interés biológico en los grupos sanguíneos aumentó al saberse que se trataba de caracteres heredados, en 1910 por Dungern y Hirszfeld probaron que la herencia de los grupos sanguíneos se heredaba por las Leyes de Mendel. El conocimiento de los grupos sanguíneos adquirió fue RubénOttenberg que correlaciono los trabajos de Landsteiner con las trasfusiones de sangre, fue el primero en1908 en enfrentar la sangre del receptor con la del dador antes de realizar latransfusión y sentó las bases de la hoy denominada regla de Ottenberg:Latransfusión es compatible cuando la sangre del receptor no aglutina los hematíesdel dador

58 3.8.1 SISTEMA ABO La membrana del eritrocito está compuesto por los aloantígenos A y B que corresponden al sistema ABO, también se pueden encontrar en otras células y secreciones, a excepción de las células nerviosas, tejido adiposo, y tejido conectivo de los músculos, el cuarto grupo AB fue descubierto posteriormente en el año 1902 por los colaboradores Castello y Sturli. La principal importancia de este sistema radica en el hecho de que es el único en el que los anticuerpos están siempre presentes cuando no se encuentra el antígeno correspondiente en los eritrocitos, siendo en ella que radica la importancia desde el punto de vista transfusional. Los antígenos de este sistema son dos A y B se encuentran en forma liposolubleempiezan a formarse en las primeras semanas del desarrollo fetal y su potencia aumenta hasta los tres años de edad que adquiere las características del adulto, esto es debido a que el número de estructuras ramificadas (moléculas de azucares) en la membrana del eritrocito a diferentes edades, al principio es lineal y va aumentando susramificaciones de oligosacaridos en la membrana del eritrocito. El grupo sanguíneo ABO lo determina un locus situado en el extremo del brazo largo del cromosoma 9, su localización de estos antígenos es extra membranosa y en su composición se puede diferenciar dos partes, una formada por oligosacaridos donde están presentes las variaciones antigénicas y la otra parte formada por glucoproteínas que llega ser el soporte. 50

59 Los antígenos proceden de sustancias precursoras muy similares, existen dos tipos de sustancia, Tipo I y Tipo II. La sustancia de tipo I da origen a los antígenos que se encuentran en secreciones, la sustancia de tipo II da origen a los antígenos eritrocitarios. Las sustancias precursoras expresan su acción mediante la síntesis de una proteína funcional, que tendrá la responsabilidad de formar el determinante antigénico, expresando su acción mediante la aparición del grupo sanguíneo. Esta proteína funcional es una enzima denominada en forma genérica como una transferasa los cuáles ensamblan una proteína estructural en la membrana del eritrocito, la cadena de monosacáridos responsable de las características antigénicas del grupo A o B o AB u O, las enzimas transferasas son controladas por genes que se ubican en el brazo largo del cromosoma 9, estos genes son heredados de los progenitores mediante las leyes mendelianas. El gen H controla la formación y acción de la enzima fucosiltransferasa dando lugara la unión de una fucosa a la galactosa final de la sustancia precursora Tipo II,formándose la sustancia H. El gen A controla la formación y acción de una N-acetilgalactosaminiltransferasa lacual incorpora una N acetilgalactosamina, la cual se une a la galactosa de lasustancia H en posición 1-3. El gen B controla la formación y acción de una galactosiltransferasa la cual incorpora una galactosa la cual se une a la galactosa de la sustancia H en posición

60 El gen O, es amorfo, no incorpora ningún glúcido sobre la sustancia H por lo que no tiene ninguna enzima transferasacontrola ninguna enzima transferasa por lo tanto, de esta manera la sustancia Hse mantiene intacta. Fuente Fig. Extractada de Antonio Casas Moreno (1997) 3er Masson (2) Los genes A y B son codominante y el gen O es recesivo. Si en la dotación genética no se encuentra los genes A y B por ser homocigoto,sobre el eritrocito no habrán los antígenos A ni B, por lo que se considera alindividuo del grupo O. 52

61 En la especie humana cuando no hay alteraciones genéticas, lassustancias precursoras y la sustancia H son isoantígenos, ya que poseen todoslos individuos de la especie, sin embrago, las sustancias A y B son aloantígenosporque no se encuentran en todos los individuos pertenecientes a dicha especie. Fuente Fig. Extractada de Antonio Casas Moreno (1997) 3er Masson (2) 53

62 IV. RESULTADOS 4.1 TITULACIÓN DE ANTISUEROS DETERMINACIÓN DE POTENCIA Y TÍTULO Sueros para determinación de fenotipos E, e, C, c, del sistema Rh Marca: DiaMed MUESTRA Control Cel. P Score Título Potencia Anti E Anti e Anti C Anti c Cel. II Cel. I Cel. I Cel. III Después de haber observado las diluciones que presentan 4+ y escore de 10, se estandariza la técnica con la que mejor permite la visualización de la aglutinación y esta es la dilución 1/8, potenciando la reacción con albúmina al 3% que es el solvente de la solución. 54

63 Las células control son provenientes de células de panel comercial que presentan el respectivo antígeno Sueros para tipificación de grupo sanguíneo ABO Marca: Plasmatec. MUESTRA Anti A Anti B Anti AB Control Cel. Eritrocitos Grupo A Eritrocitos Grupo B Eritrocitos Grupo AB P Score Título Potencia Anti D Cel. III Después de haber observado las diluciones que presentan 4+ y escore de 10, se estandariza la técnica con la que mejor permite la visualización de la aglutinación y esta es la dilución 1/32, a excepción del anti-d que se diluye ¼ por la baja potencia del reactivo, para potenciar la reacción se utilizó albúmina al 3%, siendo el solvente de la solución. 55

64 4.2 RESULTADOS TIPIFICACIÓN DE FENOTIPO CUADRO Nº 3 ANTÍGENOS PRESENTES FENOTIPO Nº F (%) e E D c C EDc % edc % eedcc % EDC % EDcC % eedc % edcc % edc % eed % edc % eedc % TOTAL % Fuente: Elaboración Propia NOMENCLATURA: +Expresión del antígeno (aglutinación positiva) -Ausencia del antígeno en la membrana del eritrocito (Aglutinación Negativa) Nº Número de personas F% Frecuencia 56

65 El cuadro Nº3:Muestra la expresión antigénica (Fenotipos) en la población de donantes del BSRR-CBBA estudiados, estos datos se encuentran de manera decreciente logrando mostrar la distribución y la frecuencia de los mismos, se ve que el fenotipo más frecuente con un 30.59% es el que expresa los siguientes antígenos EDc, y los que menos se expresan son con 0.94% Eed, al igual que el edc que presenta el mismo porcentaje de expresión, presentes como también se ve disminuida la expresión con 0.71% el fenotipo eedc GRÁFICA Nº1 Frecuencia de los Fenotipos del Sistema Rh 35,00% 30,00% 29,06% 30,59% edc edc 25,00% EDcC eed 20,00% 17,41% eedc 15,00% 11,06% eedcc EDC 10,00% 5,00% 0,00% 1,65% 3,76% 2,24% 0,94% 1,65% 0,71% 0,94% edcc eedc edc EDc Frecuencia (%) Fuente: Elaboración Propia 57

66 De acuerdo a resultados la gráfica muestra que el más frecuente en la población en estudio con el 30.59% expresa solo tres antígenos EDc, expresan los cinco antígenos eedcc solo un 17.41% el resto de la población donante que va en un total de 52% expresan entre 3 a cuatro antígenos, se distribuyen en diferentes expresionesedc,edcc, eed, eedc, EDC, edcc, eedc, edc y el fenotipo que expresa los antígenos negativosedcsolo tiene una frecuencia de 1.65% siendo un porcentaje muy pequeño. GRÁFICA Nº 2 Sistema Rh de la Población de Estudio 98,35% 100,00% 90,00% 80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% 1,65% No expresa d (Rh -) Expresa D (Rh +) Fuente: Elaboración Propia De acuerdo a la gráfica se demuestra que el % de la población en estudio expresa el antígeno D, considerados como Rh (+), y solo 1,65 % de esta población no expresa el antígeno representada como d, considerados como Rh (-). 58

67 GRÁFICA Nº 3 Distribución de los Antigenos del Sistema Rh 90,00% 82,59% 80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 17,41% 20,00% 10,00% 0,00% Expresan los Cinco Antigenos No Expresan los Cinco Antigenos Fuente: Elaboración Propia De la misma forma la gráfica muestra la expresión de los cinco antígenos en la que se observa que solo es del 17,47% la expresan y un 82,57% no expresan los cinco antígenos, en este porcentaje se encuentran distribuidos todos los demás fenotipos en la que se muestra una expresión de tres antígenos o cuatro. 59

68 4.3 FRECUENCIA DE FENOTIPO POR SEXO EN DONANTES DEL BANCO DE SANGRE DE REFERENCIA COCHABAMBA, OCTUBRE A NOVIEMBRE DEL 2010 CUADRO Nº 4 ESTUDIO DE MASCULINO FEMENINO FENOTIPO N F (%) N F (%) edc 9 1,87% 5 1,36% edc ,69% ,54% EDcC 19 3,95% 13 3,52% eed 4 0,83% 4 1,08% eedc 10 2,08% 9 2,44% eedcc 76 15,80% 72 19,51% EDC 50 10,40% 44 11,92% edcc 7 1,46% 7 1,90% eedc 2 0,42% 4 1,08% edc 6 1,25% 2 0,54% EDc ,26% ,10% TOTAL Fuente: Elaboración Propia NOMENCLATURA: Nº Número de personas F% Frecuencia en porciento 60

69 Del estudio realizado, se observa que el fenotipo de mayor frecuencia en ambos sexos es el EDc, de los cuales en el varón tiene un porcentaje más elevado 33,26% y la mujer un 27,10%, el fenotipo que ocupa el segundo lugar es edc, conporcentajes similares en ambos sexos, siendo el tercer lugar para la expresión de los cinco antígenos eedcc con una mayor frecuencia en el varón 15,80% frente a un 19,51% del sexo femenino, el cuarto lugar es para el fenotipo EDCque presenta una frecuencia de 10,40% en el varón y 11,92% en la mujer mostrando una leve elevación en el sexo femenino, el quinto lugar ocupa el fenotipo EDcC, presentando un porcentaje pequeñodel total y se reporta un 3,95% en el varón y 3,52% en la mujer. Los siguientes fenotipos como, el eedcpresenta una frecuenciade 2,08%en el varón y 2,44% en la mujer, el fenotipo edcque presenta ausencia de los antígenos DCE que representan al factor Rh negativo presenta una frecuencia en la población donante un porcentaje de 1,87% en el varón y un 1, 36% en la mujer, el fenotipo edccpresenta una frecuenciade 1,46% en el varón y 1,90% en la mujer, el fenotipoedctiene un porcentaje de1,25%en el varón y 0,54% en la mujer, el fenotipo eedctieneuna frecuencia de 0,42% en el varón y 1,08%en la mujer el fenotipo de menor frecuencia es el eedcon un0,83% en el varón y un 1,08% en la mujer. 61

70 GRAFICA Nº 4 Frecuencia del Fenotipo del Sistema Rh de Acuerdo al Sexo 35,00% 30,00% 25,00% 20,00% 15,00% 10,00% 5,00% 0,00% 33,26% 29,54% 28,69% 27,10% 19,51% 15,80% 11,92% 10,40% 3,95% 1,25% 3,52% 1,87% 2,08% 1,46% 1,36% 2,44% 1,90% 1,08% 0,83% 0,42% 1,08% Masculino Femenino 0,54% edc edc EDcC eed eedc eedcc EDC edcc eedc edc EDc Fuente: Elaboración Propia 4.4 TIPIFICACIÓN DEL FENOTIPO ABO EN DONANTES DEL BANCO DE SANGRE DE REFERENCIA COCHABAMBA(OCTUBRE A NOVIEMBRE 2010) La distribución de los fenotipos del sistema sanguíneo ABO, que muestra el cuadro Nº 5 describe que el fenotipo que más se expresa en la población en estudio es el O con un porcentaje de 79,29%, el segundo fenotipo de mayor frecuencia es el A con un 16,71%, los menos frecuentes son los fenotipos B con 3,53% junto al AB con una frecuencia de 0,47%. 62

71 CUADRO Nº 5 SISTEMA ABO N FRECUENCIA (%) O ,29% A ,71% B 30 3,53% AB 4 0,47% TOTAL % Fuente: Elaboración Propia GRAFICA Nº 5 Distribucíon de los Fenotipos del Sistema ABO 79,29% 80,00% 60,00% 40,00% 20,00% 0,00% 16,71% 3,53% 0,47% A B AB O FRECUENCIA (%) Fuente: Elaboración Propia 63

72 4.5 FRECUENCIA DEL FENOTIPO DEL SISTEMA ABO DE ACUERDO AL SEXO EN DONANTES DEL BSRR DE OCTUBRE ANOVIEMBRE 2010 El cuadro Nº 6 nos muestra la frecuencia de expresión del sistema ABO de acuerdo al sexo, se observa que el fenotipo de mayor expresión es el O se presenta con mayor frecuencia en el sexo masculino con 81,70%, frente a un 76,15% en el sexo femenino del población en estudio, a diferencia del fenotipo A se expresa en un 14,76% en el sexo masculino, frente a 19,24% en el sexo femenino, se expresan con menor frecuencia el fenotipo B y AB en ambos sexos. CUADRO Nº 6 SEXO SISTEMA Masculino Femenino ABO Nº F (%) Nº F (%) O , ,15 A 71 14, ,24 B 14 2, ,34 AB 3 0,62 1 0,27 TOTAL Fuente: Elaboración Propia 64

73 GRAFICA Nº 6 Frecuencia del Fenotipo del Sistema ABO de Acuerdo al Sexo 90,00% 80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% 81,70% 19,24% 14,76% 2,91% 4,34% 0,62% 0,27% A B AB O 76,15% Masculino Femenino El presente estudio nos permite analizar la frecuencia de los fenotipos Rh que fueron encontrados en la población donante frente a los fenotipos del sistema ABO. 65

74 4.6 DISTRIBUCIÓN DE LOS FENOTIPOS Rh DE ACUERDO A GRUPOS SANGUÍNEOS DEL SISTEMA ABO CUADRO Nº 7 GRUPO SANGUINEO FENOTIPO A F% B F% AB F% O F% EDc 45 31,69% 10 33,33% 1 25,00% ,27% edc 40 28,17% 8 26,67% 2 50,00% ,23% eedcc 23 16,20% 4 13,33% 0 0,00% ,95% EDC 21 14,79% 2 6,67% 1 25,00% 70 10,39% edc 5 3,52% 2 6,67% 0 0,00% 7 1,04% edcc 2 1,41% 0 0,00% 0 0,00% 12 1,78% eed 2 1,41% 0 0,00% 0 0,00% 6 0,89% eedc 2 1,41% 0 0,00% 0 0,00% 4 0,59% EDcC 1 0,70% 1 3,33% 0 0,00% 30 4,45% edc 1 0,70% 1 3,33% 0 0,00% 6 0,89% eedc 0 0,00% 2 6,67% 0 0,00% 17 2,52% ,00% ,00% 4 100,00% ,00% TOTAL 850 Fuente: Elaboración Propia 66

75 El cuadro Nº 7 describe la frecuencia de los antígenos del sistema Rh relacionado con el sistema ABO, este cuadro nos permite observar la expresión de los antígenos más inmunógenos del sistema Rh (Antígeno D, c, y E) se reporta en la investigación: 97,19% de donantes que expresan el antígeno D, 44,56% de donantes expresan además los antígenos c y E 33,51% no expresan ni c, ni E 4.7. EXPRESIÓN DE ANTÍGENOS Rh EN DONANTES DEL GRUPO SANGUÍNEO O CUADRO Nº 8 ANTIGENO N (GRUPO O) F(GRUPO O) Antígeno D ,96% Antígenos c y E ,26% No expresa Antígeno E ,94% No expresa Antígeno c ,03% No expresa c y E ,74% 674 Fuente: Elaboración Propia 67

76 Se observa que el grupo sanguíneo O es el de mayor frecuencia (Ref. cuadro 5), en ésta población en estudio el cuadro Nº 7 describe la distribución de los fenotipos del Rh, expresándonos el cuadro 8 el siguiente resultado: 98% expresan el antígeno D y 53,26% además expresan los dos antígenos también altamente inmunógenos E y c; no expresan antígeno E 32,94% del total y No expresan el antígeno c un 43,03% y no expresan c ni E 46,74% del total de donantes del grupo sanguíneo O. GRAFICA Nº 7 1 Distribución de Antigenos Rh en Donantes del Grupo Sanguineo "O" 98,96% 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 53,26% 43,03% 46,74% 0,4 32,94% 0,3 0,2 0,1 0 Antigeno D Antigenos c y E No expresa Antigeno E No expresa Antigeno c No expresa c y E Fuente: Elaboración Propia 68

77 4.8. EXPRESIÓN DE ANTÍGENOS Rh EN DONANTES DEL GRUPO SANGUÍNEO A CUADRO Nº 9 ANTIGENO N (GRUPO A) F(GRUPO A) Antígeno D ,48% Antígenos c y E 71 50,00% No expresa Antígeno E 48 33,80% No expresa Antígeno c 63 44,37% No expresa c y E 71 50,00% 142 Fuente: Elaboración Propia En el cuadro Nº 7 se observa la distribución de los fenotipos del Rh en el grupo sanguíneo A, en ésta población en estudio un 96,48% expresan el antígeno D y 50% además expresan los dos antígenos también altamente inmunógenos E y c ; no expresan antígeno E 33,80% del total y No expresan el antígeno c un 44,37% y no expresan c ni E 50% del total de donantes del grupo sanguíneo A. 69

78 GRAFICA Nº 8 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Distribución de Antigenos Rh en Personas del Grupo Sanguineo A 96,48% Antigeno D 50,00% Antigenos c y E 33,80% No expresa Antigeno E 44,37% 50,00% No expresa Antigeno c No expresa c y E Fuente: Elaboración Propia 4.9. EXPRESIÓN DE ANTÍGENOS Rh EN DONANTES DEL GRUPO SANGUÍNEO B CUADRO Nº 10 ANTIGENO N (GRUPO B) F (GRUPO B) Antígeno D 28 93,33% Antígenos c y E 15 50,00% No expresa Antígeno E 11 36,67% No expresa Antígeno c 12 40,00% No expresa c y E 15 50,00% 30 Fuente: Elaboración Propia 70

79 El cuadro Nº 10, en función al cuadro Nº 7 nos permite observar la expresión de los fenotipos del Rh en el grupo sanguíneo B, en ésta población en estudio un 93,33% expresan el antígeno D y 50% además expresan los dos antígenos también altamente inmunógenos E y c ; no expresan antígeno E 36,67% del total y No expresan el antígeno c un 40% y no expresan c ni E 50% del total de donantes del grupo sanguíneo B GRAFICA Nº 9 Distribución de Antigenos Rh en Donantes del Grupo Sanguineo "B" 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 93,33% 50,00% 36,67% 40,00% 50,00% Antigeno D Antigenos c y E No expresa Antigeno E No expresa Antigeno c No expresa c y E Fuente: Elaboración Propia 71

80 4.10. EXPRESIÓN DE ANTÍGENOS Rh EN DONANTES DEL GRUPO SANGUÍNEO AB CUADRO Nº 11 ANTIGENO N (GRUPO AB) F (GRUPO AB) Antígeno D 4 100,00% Antígenos c y E 1 25,00% No expresa Antígeno E 2 50,00% No expresa Antígeno c 3 75,00% No expresa c y E 3 75,00% 4 Fuente: Elaboración Propia El cuadro Nº 11, siempre en función al cuadro Nº 7 nos permite observar la expresión de los fenotipos del Rh en el grupo sanguíneo AB, en ésta población un 100% expresan el antígeno D y 25% además expresan los dos antígenos también altamente inmunógenos E y c ; no expresan antígeno E 50% del total,no expresan el antígeno c un 75% y no expresan c y E 75% del total de donantes del grupo sanguíneo AB. 72

81 GRAFICA Nº ,8 0,6 0,4 0,2 0 Distribución de Antigenos Rh en Donantes del Grupo Sanguineo "AB" 100,00% Antigeno D 25,00% Antigenos c y E 50,00% No expresa Antigeno E 75,00% 75,00% No expresa Antigeno c No expresa c y E Fuente: Elaboración Propia V. DISCUSIÓN El estudio del Fenotipo del Rh al igual que el estudio de Grupo sanguíneo ABO es de suma importancia en medicina transfusional, ya que los antígenos de estos sistemas son altamente inmunógenos por lo que son de considerar en todas las actividades relacionadas con el empleo terapéutico de la sangre y sus componentes, por ejemplo en los pacientes a ser sometidos a transfusiones y trasplantes, y en particular en el estudio de anemias hemolíticas, como la anemia hemolítica autoinmune, y la enfermedad hemolítica del recién nacido, también en el ámbito antropológico porque son considerados marcadores de identidad poblacional y genética. A mediados de la década de 1940 se identificaron otros cuatro antígenos, C, E, c, y e, como perteneciente a lo que ahora se denomina sistema Rh. 73

82 La mayor parte de las situaciones de la medicina transfusional, los cinco principales antígenos (D, C, E, c, e) y sus correspondientes anticuerpos dan cuenta de más del 99% de los temas clínicos que implican al sistema Rh. La aportación que hace éste estudio de fenotipaje del sistema Rh, es muy importante, dado que forma parte del avance en medicina transfusional. La precisión de la técnica en microplaca, el bajo costo que significa su aplicación nos permite realizar ésta investigación, y a su vez nos permite evaluar la frecuencia de los principales antígenos del Sistema Rh, también se muestra como primer paso, ya que de acuerdo a estudios realizados en países como México, Costa Rica y otros, debe realizarse una genotificación por PCR en tiempo real, que nos permita comparar con la serología para realizar una estimación más exactade la expresión de los mismos y enfocar el estudio. El presente estudio dio información sobre la distribución de los antígenos más inmunogénicos del Sistema Rh, se observa que el 30.59% del total de la población donante en estudio, expresa solo tres antígenos E, D y c, siendo estos los más antigénicos,laexpresión se observa tanto en el sexo masculino como en el femenino, el 33,26% corresponde al sexo Masculino y el 27,10% al Femenino. En relación con el sistema ABO y el sistema Rh, la prevalencia del fenotipo EDc permanece; en el grupo sanguíneo O 30.27% (204 donantes), en el grupo sanguíneo A 31.69% (142 donantes), B 33.33% (30 donantes) y % en el grupo AB (4 donantes). 74

83 En Bolivia, la experiencia reportada se limita señalada por el grupo la tesina realizada en la Caja Petrolera de la ciudad de La Paz, no se encuentra el estudio de fenotipo en los otros departamentos, en dicho estudio la prevalencia de fenotipo Rh está en la expresión de los cinco antígenos con un 33% de 1200 muestras estudiadas, a diferencia del fenotipo EDc cuya frecuencia en la ciudad de La Paz es de 17% siendo el segundo fenotipo más frecuente, según el presente estudio el 17,41% es el porcentaje reportado encontrándose en tercer lugar de frecuencia en la población donante del Banco de sangre de Referencia Cochabamba, estos datos se muestran en el cuadro Nº 12. CUADRO Nº 12 Fenotipo Nomenclatura La Paz Cochabamba e E D c C FENOTIPO Nº % Nº % edcc eedcc edc eedc EDc edc eedc EDC edc eedc edcc * + + ed*cc * - + ed*c EDcC eed Total Fuente: Elaboración propia Perez-Chacon Barragán Ximena, Estudio retrospectivo de Rh (D) en población de la C.P.S

84 Datos de investigación propia. Estudios realizados en otros países la frecuencia del fenotipo EDc prevalente en la tesis, se expresa en un 5,6% en Costa Rica, 14.53% en Venezuela y en la Población Española un 11,8% (Cuadro 13), Comparando con lo que se refiere a la Bibliografía, la frecuencia en blancos es de 2.87%, 1.3% en negros 11, 4.06% en el Sur de México y 4.86% en el Sur de Chile 11 ; en nuestro país presenta un 23.1% de frecuencia y por los resultados encontrados en la presente tesis este fenotipo presenta mayor frecuencia en la población estudiada (Donantes de Sangre del BSRCBBA), que en las poblaciones descritas de otros países. El fenotipo edc presenta una frecuencia de 29,06% en la población investigada, es más frecuente en el sexo femenino con 29.54% de expresión que en el sexo masculino que cuenta con 28.69%, siendo mínima la diferencia entre ambos. De acuerdo al sistema ABO la expresión de éste fenotipo se ha demostrado que se expresa 50.00% en el sistema AB, del total de donantes observados la frecuencia del grupo AB es de 4 donantes del total de 850 (Cuadro 7) de la población, lo que demuestra que puede darse un dato errado, por lo expuesto se determina con mayor frecuencia la expresión en el grupo O 29.23%, en el grupo A se expresa en un 28,17% con relación al grupo con el antígeno B 26.67%. Al ser una expresión de importancia en Bolivia relacionando con el estudio anteriorse determina que la ciudad de La Paz presenta menos frecuencia del determinado fenotipo 16,33% con relación a Cochabamba 29,06%(Cuadro 12). 76

85 Comparado con estudios anteriores se observa que éste fenotipo se expresa con mayor frecuencia en la población Española 49%, en Venezuela se expresa en 20% y Costa Rica 19% Comparando con lo que se refiere a la Bibliografía, la frecuencia en nuestra población es menor que en mestizos de chiles que cuenta con 24.65% y México de 20.72%. Se debe hacer notar que las personas que expresan este fenotipo son capaces de producir anticuerpos anti c y antie, frente a la carencia de éstos dos antígenos en membrana eritrocitaria, si estos son expuestos a estos antígenos ya sea por sensibilización feto-materna o transfusiones de Concentrado globular cuyos eritrocitos expresen antígenos c y E. Por lo que se define que el 29,06% de la población estudiada se verá afectada (Cuadro 12), encontrándose en riesgo de ser sensibilizados ante una transfusión o embarazos que vehiculicen con antígenos c+ y E+, si observamos la relación a nivel Bolivia con los escasos estudios realizados se ve que el 22.05% de nuestra población es afectada con relación a otros países como Costa Rica que presenta un 19% de población en riesgo, Venezuela 20% y España un 49% (Cuadro 13). En tercer lugar en la tabla se encuentra la expresión del fenotipo que presenta los cinco antígenos eedcc con una frecuencia de 17.41% del total de la población estudiada, de acuerdo al sexo la expresión de éstos antígenos es de 15,80 en el sexo Masculino y 19.51% en el sexo femenino, se observa por grupo sanguíneo se determina que los donantes que son del grupo sanguíneo A expresan los cinco antígenos con una frecuencia de 16.20%, el grupo 77

86 sanguíneo B 13.33%, el grupo sanguíneo AB no expresa en la población estudiada, y el grupo sanguíneo O que es dador expresa en un 17.95%. Si observamos la frecuencia de grupos sanguíneos de acuerdo a sexo, la expresión en varones del grupo sanguíneo O es mayor (81.70%) y en el sexo Femenino es menor (76.15%), lo muestra que se expresa más en el sexo masculino que en el femenino, por éste punto analizado se puede deducir que las mujeres tienen mayor riesgo de crear anticuerpos frente a los antígenos c y E por sensibilización en el embarazo(feto-materna) o transfusiones que se pueda realizar con expresión de antígenos c y E. De acuerdo a estudios realizados en nuestro país se determina que la ciudad de La Paz presenta una expresión de éste antígeno eedcc en un 33% con relación a la población Cochabambina que expresa solo un 17.41% (Cuadro 12). Comparando con otros países se tiene que Bolivia expresa los cinco antígenos en un porcentaje de 27.03% con relación a Costa Rica que expresa 19%, Venezuela 20% y España en un 49%. Estudios realizados en Norteamérica (según bibliografía) en individuos blancos y negros se identifica que éste fenotipo se expresa en un 13.9% en blancos y 4.2% en negros, también se encontró que éste fenotipo presenta una frecuencia de 20.44% en personas de la población de La Paz-Baja California Sur, México y 20.14% en los valles del sur de Chile, datos que lleva a determinar que en población mestiza como la nuestra él fenotipo eedcc estaría presente con mayor frecuencia. 78

87 CUADRO Nº 13 Fenotipo Nomenclatura Bolivia Costarica Venezuela Española e E D c C FENOTIPO Nº % Nº % Nº % Nº % edcc eedcc edc eedc EDc edc eedc EDC edc eedc edcc * + + ed*cc * - + ed*c EDcC eed Total *Rev. Esp. Antrop.Biol. (2000) Castro Guerra (Venezuela) (18) *Estudio de los sistemas sanguíneos de Amalgosa Ma. P. Aluja (España) (19) *Distribución de Fenotipos Martín Rojas, RA solano, E.M. Espinoza (Costa Rica) (22) 79

88 *Frecuencia del Fenotipo del sistema Rh Daneyba Calderón (Bolivia más datos propios) (23) El cuarto fenotipo de mayor frecuencia es EDC con 11.06%en la población en estudio, de acuerdo al sexo la expresión de estos antígenos es de 10,40% los varones y mayor expresión en el sexo femenino con 11.92%, de acuerdo a grupo sanguíneo predomina el fenotipo EDC en el grupo AB que discriminamos el dato por haber muy pocos donantes testados con este grupo sanguíneo, por tanto se considera la mayor frecuencia en el grupo A con 14,79%, seguido del grupo O con una frecuencia de 10.39%, el grupo B cuenta con una frecuencia de 6.67%. De acuerdo a estudios realizados en nuestro país se determina que la ciudad de La Paz presenta una expresión de éste antígeno EDC en un 0.83% con relación a la población Cochabambina que expresa solo un 11.06% (Cuadro 12). Comparando con otros países se tiene que Bolivia expresa los antígenos EDC en un porcentaje de 5.2% con relación a Costa Rica que expresa 0.5%, Venezuela 5.62% y España en un 0.4%. Estudios realizados en Norteamérica en individuos blancos y negros presenta una frecuencia baja en blancos % y 0% en negros. Presentan frecuencias más bajas los fenotipos que expresan EDcC, la población donante en estudio presenta una frecuencia de 3.76%, siendo más frecuente en el sexo masculino con un 3.95% y en el sexo femenino se expresa en un 3.52%, los grupos sanguíneos que presenta mayor frecuencia son el grupo A y O con una frecuencia de 1.41% y 1.78% 80

89 respectivamente los grupos AB y B no expresan los antígenos del respectivo fenotipo, con relación a datos obtenidos de la ciudad de La Paz en una población de 1200 donantes solo expresan este fenotipo un 2.08%. De acuerdo a estudios realizados en otros países la frecuencia también es menor se ve que relacionando los datos de Bolivia se expresa en un 2.8%, Costa Rica no expresa, Venezuela expresa en un 16.6% y España no expresa. La expresión del antígeno edcc presenta una expresión similar al anterior 3.76% en la población estudiada, se expresa más en el sexo femenino con una frecuencia de 1.90% en la distribución de los fenotipos del sistema ABO se observa una mayor frecuencia en individuos del grupo O que cuenta con 1.78% de expresión, en el grupo sanguíneo A se expresa en 1.41% y no se expresa en los grupos AB y B. Comparado con la frecuencia de expresión de éste fenotipo en diferentes en lancos (34.07%), negra (24.6%), mestizos de México y Chile (27.78% y 27.78% respectivamente 11 de la misma manera se compara en la investigación con otros países como ser Costa Rica que expresa un 26.2%, Venezuela un 31.56% y España que no expresa, se tiene a Bolivia con una expresión 8.8%. Por tanto el 3.76% de nuestra población estudiada, cuyo fenotipo no expresa el Antígeno E, podría producir anti-e, lo que llevaría a un Rh post-transfusional o riesgo de una enfermedad EHRN. 81

90 Aun son menos frecuentes los siguientes fenotipos eedc con una frecuencia de 0.71% en la población en estudio y 9.35% en la población de La Paz, de acuerdo a sexo predomina en el sexo femenino con una frecuencia de 1.08% y en el sexo masculino un 0.42% eedc con una frecuencia de 2.24% en la población en estudio y 4% en la población de La Paz, de acuerdo a sexo predomina en el sexo masculino con una frecuencia de 2.08% y en el sexo femenino un 2.44%. Estos individuos que carecen del antígeno c podrían producir anti-c, lo que llevaría a un Rh post-transfusional o riesgo de una enfermedad EHRN. El fenotipo edc con una frecuencia de 0.94% en la población donante de Cochabamba y 1.25% en la población paceña de acuerdo a sexo predomina en el sexo masculino con una frecuencia de 1.25% y en el sexo femenino un 0.54%., el fenotipo eed es menos frecuente en la población en estudio se presenta en un 0.94% de la población y 0.25% en población paceña, siendo baja en la población en general 0.55% en Bolivia, se debe mencionar que los fenotipos que carecen de los antígenos C/c son producidos por deleciones o llamada también delecciones y revelan una actividad D muy intensa,esto porque en uno de los alelo no se expresa el antígeno c. En el caso de no expresión del antígeno D que de acuerdo a nomenclatura debe nominarse como d o mudo expresan a su vez los antígenos c y e siendo más frecuente esta expresión en la ciudad de La paz con un 2% y en la ciudad de Cochabamba con un 1.65%. Con relación al sistema ABO se encuentra más frecuente la expresión de éste fenotipo en el grupo sanguíneo B con 6.67% de frecuencia, seguido del grupo A con un 3.52%, siendo el menos frecuente en el grupo sanguíneo O, este dato se obtiene de una población de 850 donantes. 82

91 De acuerdo a investigaciones realizadas de otros países se puede ver que es más frecuente en España con una frecuencia de 37.8% seguido de Venezuela con 9.15% de expresión, Venezuela con una frecuencia de 6.05%, en nuestra población Boliviana la frecuencia es baja se tiene un 2.8% en la población estudiada se cuenta con una frecuencia de 1.65%, predominando en el sexo masculino con 1.87% y el sexo femenino con un 1.36% de expresión. De acuerdo a otros estudios se observa, que la mayor frecuencia de no expresión del antígeno D en la raza Blanca con 15.8% que en los demás grupos raciales, en negros 7.6%, en Mestizos, México 4.64% y 5.21% Chile. Esta expresión de antígenos c y e y la carencia de D (d) fenotipo Rh (d), está ligeramente predominante en el sexo Masculino que en el femenino, estos datos son corroborados por estudios realizados en el año sobre una población de personas donde el fenotipo Rh (d) presentó una frecuencia del 2.03% al igual que en el estudio realizado actualmente en 850 donantes con una frecuencia de 1.65% del Rh (d). En nuestra población la frecuencia de Rh(d), es baja por tanto el grado de inmunizarse contra el antígeno D es mínima, debido a que la mayor parte de la población expresa éste antígeno. En los Servicios transfusionales se procede a la realización de pruebas pretransfusionales en la que se realiza la compatibilidad y determinación de grupo sanguíneo 83

92 ABO y Rh(d) en el receptor, con la finalidad de identificar si existe la presencia de un Du o conocido como D débil, mediante la prueba de inmunoglobulina indirecta a una temperatura de 37ºC. En el presente estudio no se encontró ningún fenotipo Du (D débil) positivo, lo que significa que no es frecuente en nuestro medio. En cuanto a la expresión de los antígenos por grupo se observa que el grupo O expresa al antígeno D en un 98.96%, los antígenos más inmunógenoscomo (c y E) presentan una expresión en un 53.26%, no expresan al Antígeno E un 32,94%, y no expresan al antígeno c un 43.03%, no expresan ni c ni E un 46.74% (cuadro nº 8). Lo que muestra que a la ausencia, dan lugar a la formación de anticuerpos por sensibilización feto-materna o transfusiones, pero al ser dador el grupo sanguíneo O es un porcentaje considerable el que no produciría sensibilización. En el Grupo sanguíneo A el 96,48% expresa el antígeno D, a su vez expresan los antígenos c y E un 50%, si se procede con el análisis del total de la población donante A no expresan el antígeno E un 33,80%, no expresan el antígeno c un 44.37% y no expresan ni c ni E un 50% del total de la población, este es el segundo grupo sanguíneo de mayor frecuencia por lo que el estudio muestra también principal atención. En el grupo sanguíneo B la expresión del antígeno D es del 93.33%, el 50% expresan además los antígenos c y E, no expresan antígeno E un 36.67%, un 40.00% no expresan antígeno c. Se observa que el grupo sanguíneo O expresa el antígeno D, antígenos c y/o E en un 83.81% de la población estudiada, en el grupo sanguíneo A el 71.83% expresan 84

93 antígeno D y antígenos c y/o E, en el grupo sanguíneo B expresan antígeno D y antígenos c y/o E, en el grupo sanguíneo en un 73.33%. De acuerdo a estudio realizado en la ciudad de La Paz, se determina que existeen esa ciudad una mayor expresión de los antígenos más inmunógenos D, c, E en los grupos A y B siendo mayor los porcentajes de referencia en Cochabamba en el grupo universal O, con una diferencia mínima. CUADRO Nº 14 Población estudiada Grupo O Grupo A Grupo B La Paz 82.93% 86.73% 83.1% Cochabamba 83.81% 71.83% 73.33% Fuente: Elaboración propia Perez-Chacon Barragán Ximena, Estudio retrospectivo de Rh (D) en población de la C.P.S. Datos de investigación propia. De acuerdo a estos estudios se ve que el riesgo inmunohematológico de generar anticuerpos contra anti-c y anti-e es baja en los tres fenotipos del sistema ABO.Considerando al fenotipo CDe en la que no expresa E ni c, existe un riesgo de formar anticuerpos contra este fenotipo, el grupo sanguíneo O presenta una frecuencia de 29.23%, el grupo sanguíneo A un 28.17% y el grupo sanguíneo B 26.67%, expresándose en mayor porcentaje en el grupo sanguíneo O y A.El grupo sanguíneo AB que existe en una frecuencia muy baja (0.47%) con relación a la totalidad de la población estudiada, expresa en 85

94 un 100% el antígeno D solo un 25% expresan los antígenos E y c, solo un 25% expresan antígeno c y un 50% no expresan ni c ni E. Los resultados de este estudio demuestran que el 98.35% de la población expresa el antígeno D, el 52.47% expresan tanto el antígeno c como E, un14.24% solo expresan el antígeno E y el 4.24% expresan solo el antígeno c, existe una población muy pequeña que no expresa ni E ni c dando un total de 29.06%, lo que nos permite afirmar que un 70.95% de la población expresa los antígenos c y /o E disminuyendo el riesgo de formar anticuerpos especialmente anti-d, anti-e o anti-c en aquella población carente de dichos antígenos. Esto demuestra que nuestra población no se encuentra en gran riesgo de sensibilización por los antígenos más inmunógenos del sistema Rh, pero se debe tomar muy en cuenta aquella población que va en un 29.06% de falta de expresión de los antígenos c y E, pero si presentan al antígeno D, esta población puede ser sensibilizada por los dos antígenos que no expresan y de esa manera producir una reacción hemolítica posterior a una transfusión o ser la razón de incompatibilidad feto-materna. En comparación con otro estudio realizado en la ciudad de La Paz se puede afirmar que la frecuencia de los antígenos inmunógenos del sistema Rh en Bolivia se expresan, en un 97.2% el antígeno D y un 75% expresan E y/o c, con certeza se tiene una población susceptible de sensibilización de un 22.05%, solo un 2.8% de la población es carente del antígeno D (d), aparentemente la frecuencia parece ser no significativa pero si se debería tipificar los antígenos más inmunogénicos del sistema Rh, especialmente en mujeres con 86

95 antecedentes de hijos con EHRN, en pacientes con enfermedad renal o politransfundidos por enfermedades neoplácicas (Leucemias, cáncer, etc.). Con los datos obtenidos en éste estudio y en comparación con otros trabajos realizados en Costa Rica, Venezuela, España se puede ver que la frecuencia de fenotipos no tiene mucha variación, se percibe que no existe relación con la distribución en individuos de raza blanca o negra. Esto nos permite deducir que la distribución de los antígenos del sistema Rh es diferente entre las razas y regiones. Como variable complementaria también el estudio hace una investigación sobre la distribución de los fenotipos del sistema ABO, así se observa que el fenotipo O con una frecuencia de 79.29% siendo el que más se expresa tanto en el sexo femenino (76.15%) como masculino (81.70%), existe menor frecuencia con el fenotipo A que se expresa con una frecuencia de 16.71% en la población en general, siendo más frecuente en el sexo femenino (19.24%) que en el masculino (14.76%), los fenotipos B como AB son menos frecuentes 3.53% y 0.47% respectivamente. Los datos obtenidos en este estudio en comparación a otros datos de poblaciones Bolivianas, tienen estrecha relación como la que se hizo en el año 2006 en la que se ven expresiones similares con una mayor frecuencia en el fenotipo O 76.17% y para A y B 17.58% y 5.92% respectivamente estudio realizado en una población de 1200 donantes. En éste estudio también se consideró la frecuencia de los fenotipo ABO de acuerdo a etnia, en nuestra población en estudio, se obtuvo datos a partir de su Historia clínica con el 87

96 Otro s Trópico Valles Altiplano consentimientoinformado, basado en la investigación en Bancos de Sangre avalado por la ética para Bancos de Sangre y cuidando la confidencialidad, es así que vemos que de los 850 donantes estudiados se ha clasificado en Altiplano (Oruro, La Paz, Potosí), Valles (Cbba, Sucre, Tarija) Trópico (Santa Cruz, Beni y Pando) y otros del exterior. CUADRO Nº 15 A B AB O TOTAL LA PAZ ORURO POTOSI CBBA CHUQUISACA TARIJA BENI SANTA CRUZ PANDO EXTERIOR Fuente: Elaboración propia Según el cuadro 16 podemos determinar que la frecuencia del grupo sanguíneo O es mayor en el altiplano con un 86.9%, los valles con un 77.2%, Trópico con un 72.1% y la población extranjera con un 75%, el grupo sanguíneo A se presenta con mayor frecuencia en el trópico con un 20.9%, en los valles 18.7%, altiplano 10% y exterior un 15.6%, el grupo 88

97 Otros Trópico Valles Altiplano sanguíneo B se presenta con mayor frecuencia en la población del exterior con un 6.3%, seguido del trópico con el 4.7%, el valle con 3.7% y el altiplano con la menor frecuencia 2.3%., el grupo sanguíneo AB es menos frecuente y se ve con mayor frecuencia en la población extranjera con un 3.1%, trópico con 2.3%, los valles 0.4% y 0% en el altiplano. Esto nos permite analizar que el grupo sanguíneo O que es el más frecuente es proveniente en mayor cantidad de la población del altiplano y los valles, sabemos que es un fenotipo carente de antígenos tanto A como B siendo un dador universal. CUADRO Nº 16 A % B % AB % O % TOTAL 23 10,7% 5 2,3% 0 0,0% ,9% ,7% 21 3,7% 2 0,4% ,2% % 9 20,9% 2 4,7% 1 2,3% 31 72,1% ,6% 2 6.3% 1 3.1% % Fuente: Elaboración propia Para la elaboración de éste cuadro se tomó en cuenta los datos numéricos de la cantidad de donantes de acuerdo a la clasificación geográfica en función al total de donaciones 89

98 realizadas por esa población, englobando a los que sean de una misma situación geográfica como el 100% de la misma. GRAFICA Nº 11 Frecuencia del Grupo ABO - Etnia 100,0% 80,0% 86,9% 77,2% 72,1% 75,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% 18,7% 20,9% 15,6% 10,7% 2,3% 3,7% 4,7% 6,3% 0,0% 0,4% 2,3% 3,1% A B AB O Fuente: Elaboración propia Esta gráfica nos muestra la relación de frecuencia del sistema ABO de acuerdo a procedencia, clasificado como Altiplano; Valles, Trópico y Otros, se ve claramente la predominancia del grupo sanguíneo O CUADRO Nº 17 A B AB O TOTAL Altiplano 10,28% 0,47% 2,34% 0,00% 0,00% 0,00% 86,45% 0,47% 100,00% Valles 18,18% 0,53% 3,57% 0,18% 0,36% 0,00% 76,47% 0,71% 100,00% Trópico 20,93% 0,00% 4,65% 0,00% 2,33% 0,00% 72,09% 0,00% 100,00% 90

99 Otros 12,50% 3,13% 3,13% 3,13% 3,13% 0,00% 68,75% 6,25% 100,00% Fuente: Elaboración propia El presente estudio se avoca principalmente a la relación con el sistema Rh y sus antígenos más inmunógenos y se puede a través del cuadro 17 tener una relación del porcentaje de expresión del antígeno D como la falta de expresión del mismo d, así se determina que en el altiplano existe una frecuencia de 86.45% de grupo O Rh positivo (D) y solo 0.47% grupo O Rh negativo (d), siendo menos frecuente la expresión del antígeno D en el grupo A Rh positivo, con una frecuencia de 10.28% y solo un 0.47% de grupo A Rh negativo que no expresa el antígeno (d), el grupo B en el estudio reporta solo 2.34% de B Rh positivo y 0% B Rh negativo, no existe grupo AB en la población del altiplano estudiada. En el Valle la frecuencia de grupo O Rh Positivo (D) es de 76.47% y 0.71% de grupo O Rh Negativo, con relación al grupo A presenta una frecuencia de 18.18% con expresión D o Rh positivo y 0.53% sin expresión D o sea Rh negativo, el grupo B presenta una expresión D en un3.57% y solo cuenta con B Rh negativo (d) 0.18%, el grupo AB solo expresa D en una frecuencia de 0.36%, esto nos permite ver que en el valle se tiene una mayor frecuencia de falta de expresión D o grupos con factor Rh negativos. En el trópico de acuerdo a la población en estudio se ve que la mayoría de la población expresa en sus diferentes grupos sanguíneos el antígeno D no se observa en ninguno de los grupos sanguíneos la falta de expresión reportando ausencia de grupos negativos. 91

100 La población extranjera muestra en el estudio un comportamiento mayor de no expresión del antígeno D así se puede determinar que el grupo sanguíneo O tiene una frecuencia en ésta población de 68.75% con expresión del antígeno D y un 6.25% de aquellos que no la expresan, el grupo sanguíneo A que es el segundo en frecuencia presenta un12.50% de expresión D y un 3.13% de grupo A sin expresión D o Rh Negativo, el grupo B mantiene la relación con las demás etnias dando un 3.13% de frecuencia, pero muestra un aumento con relación a las otras en aquellas que no expresan el antígeno D en un 3.13%., el grupo AB no presenta frecuencia de falta de expresión D por tanto no reporta AB Rh negativo. Lo que se puede aseverar es que nuestro país en sus diferentes etnias, presenta un porcentaje mayor de expresión del antígeno D siendo más una población con factor Rh positivo, y con muy escasa frecuencia el factor Rh negativo. Por tanto la población receptora que no expresa antígeno D es menor y aquella que tiene esa carencia de antígeno tiene la posibilidad de recibir de donantes del exterior, entre ellos población Brasilera que como muestra el estudio existe una frecuencia de 6.25% perteneciente al grupo O quien es dador universal y en un porcentaje similar en el grupo A como B (3.13%). Si realizamos la comparación con otras poblaciones, la frecuencia del fenotipo O como el caso de Chile expresan en un 64.60%, Argentina 50.94% y México 57.37%, lo que 92

101 nos permite apreciar que nuestra población expresa mucho más este fenotipo que es de carácter universal (dador). El fenotipo A tiene una expresión de 16.71% y una mayor expresión en el sexo femenino que en el masculino si, realizamos comparación con otros países vemos que la frecuencia en Chile es de 24.64%, en México 26.10%, Argentina 36.46%, en la población Europea presenta una frecuencia del 45%, en estadounidenses blancos una frecuencia de 40% y en población negra estadounidense 27%. El fenotipo B presenta una frecuencia de 3.53%, más frecuente en el sexo femenino que en el masculino, comparando con otros estudios se observa que la frecuencia de expresión del fenotipo B es baja, aunque en la raza negra proveniente de Estados Unidos ésta es Mayor. El fenotipo AB presenta una frecuencia de 0.47% con mayor frecuencia en el sexo masculino y 0.27% en el sexo femenino, es uno de los grupos de menor frecuencia en diferentes poblaciones estudiadas. 93

102 VI. CONCLUSIÓN El objetivo principal de ésta tesis ha sidoinvestigar la frecuencia del fenotipo del sistema sanguíneo Rh, aplicando el método de aglutinación en Microplaca en donantes efectivos que acuden al Banco de Sangre Regional de Referencia Cochabamba, en un periodo determinado. De acuerdo a resultados obtenidos se tiene la siguiente conclusión: Este método ha permitido determinar los cinco antígenos más inmunógenos del sistema Rh (D, C, c, E, e), se ha determinadola frecuencia de once fenotipos en los que se observó presencia o ausencia de los antígenos E, c y D. El fenotipo EDc con 30.59% es el de mayor frecuencia en la población en estudio, teniendo menor expresión eedc con 0.71%, en ambos casos se tiene la presencia de los antígenos E,D,c que fueron motivo de estudio. Se demuestra que la frecuencia de distribución delos fenotipos Rh de acuerdo al sexo presentan una expresión similar, esto es demostrado de acuerdo a la población masculina y femenina estudiada, reportando % y frecuencias similares. De acuerdo al estudio las personas que expresan el fenotipo CDe en la que no se ve expresión de los antígenos E y c se encuentran en una frecuencia de 29.06% de las 94

103 cuales un 29.54% son del sexo femenino y 28.69% del sexo masculino, estas personas corren el riesgo de sensibilizarse ante una transfusión o embarazo que vehiculicen eritrocitos con antígenos c y E, estando con mayor riesgo el sexo femenino. La población que expresa fenotipo en las que no se tiene el antígeno E como ser edcc en 1.65% y edc con 0.94% tienen la posibilidad de producir anti-e con la consecuencia de producir además anticuerpos afines anti-c y anti-e por la capacidad inmunogénica que presenta, lo que llevaría a una reacción post-transfusional por factor Rh o lo más frecuente a una EHRN (Enfermedad Hemolítica del Recién Nacido). Colateralmente, se demuestra y confirma con la investigación que el fenotipo O del sistema ABO es el de mayor frecuencia en nuestra población. Se tiene un 79.29% de frecuencia en toda la población estudiada y se observa una frecuencia de 81.70% en el sexo masculino y 76.15% en el sexo femenino. El fenotipo A tiene una frecuencia de 16.71% en la población estudiada con mayor porcentaje en el sexo femenino 19.24% que en el sexo masculino 14.76%. El fenotipo B tiene una frecuencia de 3.53% con relación a la población en estudio y es más frecuente en el sexo femenino 4.34% que el masculino que cuenta con 2.91% de frecuencia. El Fenotipo AB es el menos frecuente solo se cuenta con un 0.47% del total de la población estudiada con un 0.62% en el sexo masculino y un 0.27% en el sexo femenino. El estudio muestra que el fenotipo O del sistema ABO, presenta mayor frecuencia en población donante que proviene del Altiplano con un 86.9%, el Valle con 77.2% Trópico con 72.1% y otros 75.0%. el fenotipo A es más frecuente en el Trópico y Valle con un 20.9% y 18.7% respectivamente. Son menos frecuentes en el altiplano y en población extranjera con 10.7% y 15.6% respectivamente. El fenotipo B es más 95

104 frecuente en la población extranjera con un 6.3% que en el trópico 4.7%, en el altiplano y valles se encuentra disminuida en un 2.3% y 3.7% respectivamente. El fenotipo AB se encuentra con mayor frecuencia en la población extranjera y en el trópico con 3.1% y 2.3% de frecuencia respectivamente, no se presenta en el altiplano y en el Valle solo cuenta con un 0.4%. El fenotipo EDc del sistema Rh es el que se presenta con mayor frecuencia tanto en fenotipo O, A y B, exceptuando el AB No existe fenotipo que no se exprese en el grupo sanguíneo O de acuerdo al estudio realizado es el fenotipo edc que muestra una disminución en su frecuencia con relación al grupo A y B exceptuando el AB que muestra una población muy disminuida en el estudio. De acuerdo a grupo ABO el fenotipo CDe que no expresa ni E ni c se encuentra en un 29.23% en el grupo sanguíneo O, en 28.17% en el grupo sanguíneo A un 26% en el grupo sanguíneo B y un 50% en el grupo AB. El grupo sanguíneo AB que es muy escaso en el estudio solo expresa tres fenotipos pertenecientes al sistema Rh uno es el EDc con el 25% el edc con el 50% y EDC con el 25%. La introducción de las microplacas en Banco de Sangre se demuestra a través de esta investigación, como una muy buena alternativa para procesar gran número de muestras sin el costo que supone la automatización. Además, permite ir adoptando una automatización progresiva a elección del usuario, acogiendo la técnica para las diferentes pruebas inmunohematológicas, al ser estandarizada de acuerdo a las condiciones del medio, presenta ventajas sobre los métodos convencionales (tubo y 96

105 gel), su validación se realiza en cada corrida a través de un control interno y comparando ocasionalmente con la técnica en tubo y paralelo en gel. VII. RECOMENDACIONES Se debe tipificar los antígenos más inmunógenos en mujeres en edad fértil o aquellas que hayan tenido antecedentes de hijos con Enfermedad Hemolítica del Recién nacido sin diagnóstico, con la finalidad de determinar si la causa haya podido ser un antígeno del sistema Rh. a) En Politransfundidos, enfermos renales, Oncológicos, en pacientes que son candidatos a trasplante ya que las transfusiones se debe dar Iso-grupo, evitando la aloinmunización. b) Se debe tipificar los antígenos más inmunógenos del sistema Rh, tanto al receptor como al donante especialmente cuando se procederá con una terapéutica transfusional La presente tesis queda abierta para posteriores estudios de reacciones transfusionales por transfusión incompatible al sistema Rh. A futuro se recomienda, debido a la importancia de los grupos sanguíneos ABO y Rh en la medicina transfusional ya que los antígenos de estos sistemas son altamente inmunógenos, por lo que debe ser considerado en todas las actividades relacionadas con el empleo terapéutico de la sangre y sus hemocomponentes y de acuerdo a estudios revisados, se recomienda el estudio no solo serológico de los fenotipos correspondientes al Rh, sino la genotificación del Rh dando un aporte en el avance de la medicina transfusional, los estudios demuestran que la precisión de la genotificación 97

106 por PCR, tiene una estimación muy alta comparándola con la serología actualmente realizada que serviría como método de referencia. 98

107 50,00% Expresión de los Fenotipos Rh en el Sistema ABO 50,00% 45,00% 40,00% 35,00% 30,00% 25,00% 20,00% 15,00% 10,00% 5,00% 0,00% 33,33% 31,69% 30,27% 29,23% 28,17% 26,67% 25,00% 25,00% 17,95% 16,20% 14,79% 13,33% 10,39% 6,67% 6,67% 6,67% 3,52% 1,41% 1,41% 3,33% 4,45% 3,33% 0,00% 0,00% 2,52% 0,70% 1,41% 0,00% 0,00% 1,04% 1,78% 0,89% 0,70% 0,00% 0,00% 0,89% 0,00% 0,00% 0,59% 0,00% A B AB 0,00% 0,00% 0,00% O edc edc EDcC eed eedc eedcc EDC edcc eedc edc EDc 99