PARTES DEL MICROSCOPIO OPTICO

Transcripción

1 EL MICROSCOPIO Ya los antiguos sabían que los espejos curvos y las esferas de cristal llenas de agua aumentaban el tamaño de las imágenes. En las primeras décadas del siglo XVII se iniciaron experiencias con lentes (así llamadas por tener forma de lentejas) a fin de lograr el mayor aumento posible. Para ello se basaron en otro instrumento con lentes que obtuvo gran éxito, el telescopio, usado por primera vez con fines astronómicos por Galileo, en Antes de esta fecha, los seres vivientes más pequeños conocidos eran insectos diminutos. Naturalmente, se daba por sentado que no existía organismo alguno más pequeño. Los instrumentos para aumentar la visión de los objetos, o microscopios (la palabra griega significa para ver lo pequeño ) comenzaron a usarse progresivamente. Por primera vez la biología se ampliaba y extendía gracias a un mecanismo que llevaba el sentido de la vista humana más allá de sus límites naturales. Así, los naturalistas podían describir en detalle los pequeños organismos, cosa de otro modo imposible, y los anatomistas podían descubrir estructuras hasta entonces invisibles. Existían dos tipos de microscopios: el sencillo y el compuesto; el sencillo no era más que una lente montada, el compuesto estaba formado por una combinación de lentes y fue inventado por Zacharias Jansen en Holanda. La imagen muestra el microscopio hallado en Middleburg, Holanda correspondiente a Jansen que contenía dos lentes. Luego de la invención de Jansen, en pocos años hubo un gran número de diseñadores de microscopios en Europa. El primer avance técnico del microscopio luego de Jansen fue el paso de un sistema de 2 lentes a uno de 3, este sistema es la configuración estándar que se mantiene en los microscopios de hoy. Lo siguiente intenta resumir los acontecimientos más sobresalientes en la historia de la microscopía: El naturalista holandés J. Swammerdam observó insectos con el microscopio haciendo hincapié en su conformación, descubrió también que la sangre no es un líquido uniforme rojo sino que existen corpúsculos que le dan ese color. El botánico inglés Grew estudió los órganos de reproducción de las plantas y descubrió los granos de polen. El anatomista holandés Graaf realizó estudios similares en animales describiendo ciertos elementos del ovario que desde entonces se conocen con el nombre de folículos de Graaf. Malpighi fue uno de los microscopistas más grandes de la historia de acuerdo a su espectacular descubrimiento. Sus primeros estudios los realizó con pulmones de rana, pudiendo observar en ellos una compleja red de vasos sanguíneos, demasiado pequeños para ser vistos por separado y muy anastomosados. Cuando siguió el recorrido de los vasos hasta que se unían con otros mayores, comprobó que estos últimos eran venas en una dirección y arterias en dirección opuesta. Por consiguiente, las arterias y las venas se hallaban unidos mediante una red de vasos llamados capilares. Otro descubrimiento importante en la época fue el del científico inglés Robert Hooke. El microscopio lo fascinaba y realizó uno de los mejores trabajos en esta rama, nueva para ese entonces. En 1665 publicó un libro llamado Micrographia en el cual pueden encontrarse algunos de los mejores dibujos que se hallan hecho de observaciones microscópicas. 1

2 La observación simple más importante fue la de un delgado trozo de corcho sobre el cual no se sabía porque flotaba en agua y era tan liviano y firme. Hooke observó que estaba constituido por una fina trama de pequeñas celdillas rectangulares en las cuales se encontraba aire, que él llamó células, un término habitual para designar pequeñas habitaciones en los monasterios. El microscopio utilizado por Hooke se ilustra en la siguiente figura y no había sido construido por él. Los primeros en usar el microscopio, incluso Malpighi, usaron sistemas de lentes que producían aumentos mucho mayores que los obtenidos con una sola lente. Sin embargo, empleaban lentes imperfectos, de superficies irregulares y con fallas internas. Si se intentaba lograr un aumento apreciable, la visión de los detalles se hacía confusa. Un comerciante holandés, Anton van Leeuwenhoek usaba lentes simples, que por su reducido tamaño podían obtenerse de pequeños trozos de cristal perfecto. Puliendo cuidadosamente dichos fragmentos, logró aumentar un objeto hasta 270 veces sin perjuicio de la nitidez. Tenía 419 lentes alguna de las cuales eran de cristal de roca y hasta de diamante, en algunos casos no eran mayores que el tamaño de un alfiler, por lo que sus microscopios tenían un tamaño diminuto comparados con otros de la misma época. Con esas lentes observaba todo lo que podía y logró describir los glóbulos rojos de la sangre y los capilares con mayor detalle que los verdaderos descubridores: Swammerdam y Malpighi. Pero lo más sensacional de todo ello fue su descubrimiento de pequeños organismos invisibles a simple vista, al estudiar aguas estancadas con su microscopio, con todos los atributos de la vida. Las descripciones de van Leeuwenhoek eran, desde luego, imprecisas, pero no cabe duda que fue el primero en ver lo que más tarde se llamarían bacterias y animalículos, como los denominó entonces, conocidos hoy como protozoarios que en griego significa pequeños animales. El microscopio fue perfeccionándose con gran lentitud, uno de los defectos de los microscopios primitivos era que sus lentes descomponían la luz blanca en los 2

3 colores que la constituyen. Los objetos pequeños se veían rodeados de anillos de color (aberración cromática) que impedían observar con claridad los detalles. Pero alrededor de 1820 se perfeccionaron cuando J. J. Lister, un óptico inglés, diseñó un microscopio acromático capaz de eliminar los anillos de color que limitaban la claridad de la imagen. Lister descubrió que los glóbulos rojos eran en realidad, discos bicóncavos. El microscopio acromático constituyó un gran avance, iniciando una serie de perfeccionamientos que dieron como resultado el moderno microscópio óptico. Desde 1660 hasta la actualidad el microscopio óptico ha sido el pilar fundamental en el conocimiento de lo invisible. Aunque su poder de resolución aumentó a través del tiempo (con la mejora en la calidad de las lentes) al igual que el poder de magnificación, su factor limitante fue la longitud de onda de la luz. PARTES DEL MICROSCOPIO OPTICO En el microscopio distinguimos un sistema óptico destinado a la iluminación y obtención de una imagen muy aumentada del objeto examinado, y un sistema mecánico (o montura), cuya finalidad es la de sustentar convenientemente los elementos ópticos y los preparados que se examinan. La parte óptica fundamental del microscopio está formada por dos sistemas centrados de lentes de aumento o convergentes: el objetivo y el ocular, y por el aparato de iluminación, que facilita y mejora la observación microscópica. El objetivo está compuesto por un sistema centrado de lentes convergentes. Existen distintos tipos de objetivos, que se diferencian por las características de su composición, o por la manera de utilizarse: Objetivos a seco: En éstos, el aire se interpone entre su lente y el preparado. Los objetivos más comúnmente utilizados son de 4, 10, 40 y 45 X. Objetivos a inmersión: Se distinguen de los anteriores porque entre la lente y el preparado se debe interponer un medio transparente con un índice de refracción (n) superior al del aire (n=1), y semejante al del vidrio (n=1.5), que permite aprovechar un mayor número de rayos refractados por el preparado para la formación de la imagen. El medio utilizado es un aceite de inmersión, como por ejemplo el aceite de cedro. La distancia al preparado utilizando estos objetivos es muy pequeña y suelen tener un muelle protector para evitar roturas. El ocular recibe la imagen dada por el objetivo. Está compuesta por dos lentes: la inferior o colectora, y la superior, o lente ocular. 3

4 El aparato de iluminación, situado debajo de la platina, está formado por: Espejo: cuando existe, posee una cara plana y otra cóncava destinadas a proyectar el haz de rayos que iluminará el objeto, dirigiéndolos hacia arriba del eje óptico. Los microscopios con luz incorporada generalmente no poseen espejo. Condensador: está constituido por un sistema de lentes convergentes que proyecta sobre el preparado en forma de un amplio cono el haz de luz que lo atraviesa. Concentra los rayos luminosos procedentes de la fuente de luz sobre la preparación. Diafragma: dispuesto debajo del condensador, sirve para graduar la cantidad de rayos luminosos que llegan al objeto. Filtros de luz: son placas de vidrio coloreadas que dejan pasar las radiaciones de longitud de onda más convenientes para la más adecuada observación (κ= nm), absorbiendo las restantes. FUNCIONAMIENTO DEL MICROSCOPIO El objetivo del microscopio actúa como una cámara fotográfica. Cuando un objeto se sitúa más allá del foco de su lente, se produce una imagen ampliada, real e invertida. El ocular actúa como una lupa que observa la imagen que ha formado el objetivo, construyendo una nueva imagen mucho más ampliada, virtual y derecha con relación a aquella, pero invertida con relación al objeto examinado. Así, la imagen del microscopio compuesto resulta de la combinación de las provocadas por una lente (objetivo) que actúa como una cámara fotográfica, y otra (ocular) que actúa como una lupa que observa la imagen formada por la primera. En la figura anteriores podemos observar, de manera muy simplificada, que la 4

5 imagen aumentada, producida por el objetivo, es tomada por el ocular (como si fuera un objeto) y es magnificada nuevamente. Por lo tanto, la imagen definitiva (que es invertida respecto de la original) resulta el producto entre el aumento del objetivo por el aumento del ocular. En consecuencia, los mayores aumentos que pueden conseguirse con el microscopio óptico son de x. Esto significa que una estructura que mide un micrometro puede observarse como si tuvieran 1 o 1,5 milímetros. Sin embargo, por qué existe una limitación en la amplificación que puede brindar un sistema de lentes? El principal problema radica en que la capacidad de aumentar una imagen no es la única propiedad a tener en cuenta para una buena observación. Aumento: Es la proporción entre el tamaño de la imagen observada al microscopio y el tamaño real del objeto. La forma de calcular el aumento en el cual se está trabajando consiste en multiplicar el aumento correspondiente al ocular por el aumento correspondiente al objetivo que se está utilizando para visualizar el preparado. Ejemplo: Ocular: 10x Aumento: 400 x Objetivo: 40x Distancia frontal: Es la distancia ente el objeto observado y la lente del objetivo cuando el preparado se encuentra enfocado correctamente. Es inversamente proporcional al aumento, es decir, que a medida que se utilizan objetivos de mayor aumento disminuye la distancia frontal y por lo tanto aumenta el riesgo de romper el preparado. Profundidad de campo o de foco o poder de penetración: Es el espesor del preparado que se observa con nitidez, es decir, profundidad de planos que están en foco en un momento dado. Con aumentos medianos o grandes, al mover el tornillo micrométrico, podemos observar sólo pequeños espesores con nitidez, mientras que por encima y por debajo de esta zona la imagen se desvanece. La profundidad de foco guarda relación inversa con el aumento: es tanto menor cuanto mayor es el aumento de la lente. Con inmersión en aceite, la profundidad de campo es muy escasa (menor que 1 µm). Campo observado: Es la porción del preparado incluida en la imagen. Se representa por el diámetro de la parte de la preparación que se está observando (área del campo). El tamaño del campo observado es inversamente proporcional al aumento total del microscopio, y por esta razón las lentes de pequeño aumento son útiles para rastrear la preparación. Si cambiamos de un objetivo a otro de mayor aumento, observaremos una imagen más aumentada pero que incluirá sólo una parte de lo que observábamos con el objetivo menor. 5

6 Poder de resolución: Es la capacidad de las lentes de distinguir o resolver (mostrar separados) con nitidez dos puntos situados muy próximos entre sí. Se expresa como la distancia mínima que permite dar una imagen bien definida de dos puntos, en vez de verlos como uno solo. Cuanto mayor es el poder de resolución (PR), menor es la distancia que separa dos puntos entre sí sin que estos se confundan. En consecuencia, cuanto mayor sea el poder resolutivo del objetivo, más finos serán los detalles de la preparación que puedan distinguirse. Límite de resolución: Es la distancia mínima que debe existir ente dos puntos del objeto para que puedan visualizarse separados. En los microscopios ópticos, el límite de resolución no es, en general, inferior a 0.2 µm. Apertura numérica: Es una medida es una medida de la capacidad del microscopio de agrupar las refracciones de la luz producidas por los finos detalles del objeto, debido a que determina el tamaño del haz de luz que es captado por el objetivo luego de haber pasado a través del objeto. Es una característica propia de cada objetivo, es por esto que forma parte de las inscripciones grabadas en los objetivos. El límite de resolución del microscopio óptico es de 0,2 mm mientras que la del ojo humano es de 0,1 mm. La profundidad y el diámetro del campo, como así también la distancia focal son inversamente proporcionales a la apertura numérica. Por ejemplo, el objetivo de 4x tiene una pequeña apertura numérica y por ello se lo utiliza como objetivo panorámico. Para conseguir el poder máxima de resolución hay que utilizar el objetivo de inmersión (100x) en el cual debemos aumentar el valor de la apertura numérica. Esto se logra aumentando el índice de refracción del medio interpuesto entre el objeto y la lente frontal del objetivo (2 x n x seno de α, donde n es el índice de refracción del medio y α es el ángulo de abertura del objetivo). Para ello, se utilizan medios como el aceite de inmersión, que poseen un índice de refracción superior al aire y similar al del vidrio del portaobjetos y al de las lentes. Ello permite que los rayos lumínicos no se desvíen y de ese modo se consigue mayor información del objeto en la formación de la imagen resultante VARIANTES DE MICROSCOPIO OPTICO ESTEREOMICROSCOPIO O LUPA BINOCULAR El estereomicroscopio consta realmente de dos microscopios completos, cada uno con su objetivo y ocular en los que, al no coincidir sus ejes ópticos, las imágenes formadas en los oculares son distintas (lo mismo que ocurre con la visión ocular), por lo que vemos una imagen de tres 6

7 dimensiones. No debe confundirse este aparato óptico con los microscopios binoculares, ya que en éstos la imagen formada en un único objetivo es desdoblada en dos imágenes idénticas por un prisma situado entre el objetivo y los dos oculares. Puede apreciarse que la lupa posee un par de oculares, cada uno de los cuales se enfoca independientemente del otro, con el fin de proveer una imagen nítida para ambos ojos. Nótese que éste es un instrumento de baja magnificación. EL MICROSCOPIO INVERTIDO En el laboratorio de virología se utiliza muchísimo el microscopio invertido que no es más que una variante del microscopio convencional que, tal y como indica su nombre, tiene invertida la posición normal de los objetivos, que están, en el revólver, por debajo de la platina, mientras que la luz de la fuente de iluminación, a través del condensador y del diafragma, llega desde encima de la platina, lo que facilita cierto tipo de trabajos como el control del estado de las monocapas celulares cuando se trabaja con botellas o tubos de cultivo EL MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO Se le llama también ultramicroscopio y es un microscopio óptico cuyo sistema condensador ha sido modificado para dirigir la luz a la preparación desde los lados, de tal modo que sólo la luz difractada por la preparación pasa al ocular y se hace visible. A causa de esta disposición, la muestra en el preparado aparece iluminada sobre un fondo oscuro. La microscopía de campo oscuro hace posible la observación en estado vivo de partículas y células que de otra manera estarían por debajo de los límites de resolución del microscopio óptico, aunque resulten visibles pocos detalles estructurales. La microscopía de campo oscuro ha sido ampliamente usada en el estudio de pequeñas células móviles tales como Treponema pallidum, la espiroqueta causante de la sífilis, que es invisible con microscopía óptica. MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES El estudio de estructuras in vivo es normalmente muy difícil, ya que sus componentes, con raras excepciones, son incoloros y transparentes. El microscopio de contraste de fase permite el estudio de muchas estructuras celulares in vivo. Generalmente se utiliza en combinación con las técnicas de cultivo de células y tejidos, y también para el examen de células recientemente removidas de animales vivos, o también material fijado, pero sin colorear. Esta técnica se basa en el hecho de que las diferentes estructuras celulares introducen pequeñas variaciones de fase en las radiaciones, retrasándolas ligeramente, siendo estos retrasos diferentes según el tipo de estructura. Con este microscopio, el bajo contraste existente se refuerza por medio de un sistema óptico especial que transforma las diferencias de fase, que no son captadas por el ojo humano, en diferencias de amplitud (intensidad luminosa), que sí son detectables. En el microscopio de contraste de fase existen dispositivos especiales que transforman estas diferencias de fase en diferencias de amplitud, produciendo en consecuencia diferencias de intensidad luminosa, para las cuales la retina es 7

8 sensible. MICROSCOPIO DE POLARIZACIÓN Cuando la luz atraviesa ciertas sustancias o estructuras, sufre una división de tal orden que de un solo rayo luminoso a la entrada, resultan dos rayos llamados polarizados. Tal capacidad se debe a que esas sustancias poseen una ordenación interna y periódica de sus átomos. Sea o no aparente esta ordenación, se dice que tales cuerpos tienen estado cristalino. Por el contrario, las sustancias que no pertenecen a este grupo se llaman amorfas. La velocidad a la que se propaga la luz en estos cuerpos amorfos, también llamados isótropos o monorrefringentes, es siempre igual, independientemente de la dirección que siga dentro de ellos. Así, el cuerpo tienen un único índice de refracción. En los cuerpos cristalinos, o anisótropos o birrefringentes, la velocidad de la luz varía según la dirección de propagación, lo que da lugar al fenómeno conocido con el nombre de doble refracción. De un único rayo luminoso resultan dos rayos refractados, que son polarizados rectilíneamente; esto es, la dirección de la vibración de la luz pasa a seguir una dirección determinada. El microscopio de polarización emplea un prisma que deja pasar solamente la luz polarizada rectilíneamente, eliminando otros rayos por reflexión total. Este instrumento óptico está compuesto de una platina rotatoria, a la que se le añaden dos polarizadores: uno ubicado debajo de la platina (polarizador) y el otro, encima de ella, junto al ocular analizador). Polarizador y analizador están colocados de tal manera que sus secciones principales están cruzadas, o sea, se cortan perpendicularmente. En estas condiciones el observador no ve ninguna luz en el ocular. Cuando se coloca en la platina un cuerpo amorfo, esta situación no se altera porque la luz no sufre modificación. Lo contrario ocurre cuando observamos un cuerpo cristalino o birrefringente. Entonces, y según la orientación de ese cuerpo en la platina, la luz brilla con mayor o menor intensidad. El microscopio de polarización sirve, entonces, para distinguir las sustancias monorrefringentes de las birrefringentes. Además, permite conocer la ordenación interna de las sustancias birrefringentes, su orientación a escala submicroscópica. EL MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA Algunos colorantes denominados fluorocromos tienen la propiedad de ser excitados (pasar a un nivel superior de energía) cuando absorben luz ultravioleta (luz de longitud de onda corta). A medida que las moléculas excitadas regresan a su estado normal liberan el exceso de energía en forma de luz visible de mayor longitud de onda que la radiación excitante. Esta propiedad se denomina fluorescencia. Se han desarrollado métodos microscópicos modernos que aprovechan la mayor detección que posibilita este sistema. Este tipo de microscopios lleva una fuente luminosa que emite radiaciones ultravioleta, en el límite del espectro visible, que atraviesan el material de la preparación de la misma forma en que lo hace un microscopio óptico. Las lentes suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiación ultravioleta. A continuación del objetivo lleva unos filtros que retienen la radiación ultravioleta, que 8

9 es peligrosa para el ojo humano, dejando pasar solamente la radiación visible, que no es peligrosa. Hoy día se utiliza mucho un microscopio de fluorescencia en el cual la luz es emitida desde arriba del preparado (epifluorescencia). Un filtro deja pasar luz de la longitud de onda deseada para excitar al fluorocromo y un filtro barrera en el objetivo protege al ojo del observador de la radiación fluorescente. Los objetos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados contra un fondo oscuro, según el color del colorante usado. EL MICROSCOPIO CONFOCAL El microscopio confocal es un microscopio óptico que incorpora dos diafragmas: un diafragma de iluminación, generalmente de tamaño invariable y localizado tras la fuente luminosa, y un diafragma de detección, de tamaño variable situado delante del fotodetector. La utilidad de este diafragma de detección es eliminar la luz proveniente de planos superiores e inferiores al plano focal, aumentando con ello la claridad y resolución de la imagen. Esta capacidad de obtener SECCIONES ÓPTICAS es la característica principal y exclusiva del microscopio confocal. La obtención de secciones ópticas más o menos gruesas viene determinada por una combinación entre el diámetro del diafragma de detección, la apertura numérica del objetivo y de la longitud de onda de la luz utilizada. El haz de láser es dirigido a un punto concreto del plano focal. La luz reflejada por la muestra o la fluorescencia emitida es dirigida y captada por un fotodetector, una vez atraviesa el diafragma. La imagen focal se optiene tras rastrear la muestra (scanning) con el láser. Las imágenes obtenidas son siempre imágenes digitales: Los fotodetectores (PMTs) transforman la señal lumínica en una señal eléctrica que mediante el sistema informático acoplado se traduce en un píxel. Cada píxel/voxel, proporciona información referente a la localización tridimensional del punto excitado, así como la intensidad lumínica de dicho punto. Las principales aplicaciones de la microscopía confocal son, entre otras -expresión y localización de moléculas en 2 o 3 dimensiones permitiendo reconstrucción tridimensional, tanto en cultivos celulares, como tejidos histológicos, - estudios de proteínas u otro tipo de moléculas - transporte intracelular, endocitosis, - medidas de concentraciones de iones intracelulares, - desarrollo y expresión génica, - hibridación in situ con sondas fluorescentes. CON EL MICROSCOPIO ÓPTICO SE PUEDEN OBSERVAR: La forma general de la mayoría de las células procariontes 9

10 La forma general de las células eucariontes Algunas organelas eucariontes: núcleo, nucleólos, cromosomas, mitocondrias, cloroplastos, flagelos, cilias, centriolos, vacuolas, pared celular. Estas estructuras se identifican con claridad utilizando alguna técnica accesoria con preparación de la muestra. NO PUEDEN OBSERVARSE CON EL MICROSCOPIO ÓPTICO: Las bacterias más pequeñas La estructura interna de las células procariontes La estructura de las organelas eucariontes La membrana plasmática Los conjuntos membranosos como los retículos endoplásmicos y el aparato de Golgi, aunque su ubicación en la célula puede ser revelada mediante ciertas técnicas Los ribosomas MICROSCOPIO ELECTRONICO En 1930 el mundo submicroscópico se amplió con la aparición del microscopio electrónico cuya ventaja principal con respecto al microscopio óptico es un aumento de 1000 veces en la magnificación del material observado acompañado de una mayor capacidad de resolución generando una mejor definición y una ampliación del mundo microscópico. ADN, virus y pequeñas organelas fueron observadas por primera vez con este microscopio. Vamos a referirnos a las características del ME que lo diferencian de la microscopía de luz y que permite mejorar el límite de resolución de este último. Se logran haces de electrones con una longitud de onda de 0,05 nm, cuyo poder de resolución es de 0,2 nm mientras que la longitud de onda de la luz visible oscila alrededor de 500 nm y su poder de resolución es de 0,2 µm. La resolución en un ME depende de la condición del potencial acelerador Por lo tanto la gran diferencia radica en reemplazar el haz de luz fotónica por un haz de electrones que se genera en el cañón electrónico, donde un filamento de tungsteno en forma de V y con propiedades de termoemisión, al calentárselo con un voltaje de calentamiento del cátodo produce el haz de electrones. El filamento constituye el cátodo y está rodeado por un cilindro abierto (cilindro de Wehnelt) que contribuye a producir un haz más pequeño pero de igual intensidad. El ánodo es un disco abierto en la base del cilindro de Wehnelt conectado a tierra (con potencial 10

11 cero). Los electrones generados son acelerados por un voltaje de aceleración negativo entre el cátodo y el ánodo de 1000 KV (fuente de alta tensión); el ánodo atrae los electrones, los saca fuera evitando la acumulación en el filamento, genera una fuente puntual de electrones y además es enfocante. El haz de electrones se genera en una columna con un alto vacío a fin de evitar la dispersión de los electrones al chocar con las partículas de la atmósfera. El alto vacío se logra en general mediante una bomba difusora apoyada por una bomba mecánica. La columna tiene un lugar donde introducir el espécimen en una precámara; la misma se pre-vacía antes de ser comunicada con la columna para introducir el espécimen que consiste en una grilla de unos 4 mm de diámetro de cobre o níquel de 200 o 300 mesh, donde se recogen los cortes del material biológico, los cuales deben ser lo suficientemente finos (60 nm). Una cámara fotográfica se ubica debajo de la pantalla, por lo general en alto vacío y que se comunica con la columna al levantarse la pantalla y abrirse un shunt. El sistema óptico del ME consiste en bobinas electromagnéticas; las lentes condensadoras concentran el haz sobre el especimen y permiten también regular la intensidad de luz. La lente objetivo forma la primera imagen aumentada de la porción iluminada del especimen en un plano que luego se puede volver a aumentar por las lentes proyectoras. Las lentes objetivas y proyectoras juntas magnifican la imagen sobre una pantalla fluorescente o cuando ésta se levanta sobre una placa fotográfica. La lente objetivo es la más crítica porque de ella depende el poder de resolución. Las lentes intermedias y proyectoras se usan en condiciones tales que los errores de la lente no interfieren seriamente con la imagen, usando aperturas angulares tan pequeñas que la aberraciones son escasas. En la microscopía electrónica de transmisión (MET), los electrones que atraviesan la muestra son los que van a impactar en la pantalla para dar la imagen, a diferencia de la microscopía de scanning (o barrido) (MES o MEB), en la que no son los electrones transmitidos los que dan la imagen sino los electrones secundarios que son refractados en la superficie del material biológico. Pero la diferencia con la MO es que en ésta la imagen se forma porque el material absorbe la luz, proceso intensificado por las tinciones del especimen, lo que resulta en diferencias visibles en diversas partes de la imagen. En el ME en cambio, la porción de electrones absorbido por el material biológico es infinitésima. La formación de la imagen no se basa en la absorción de electrones sino que se basa en la pérdida de electrones del haz por el scattering (o dispersión) en distintos puntos del preparado. La imagen se forma en blanco y negro correspondiendo el negro a las zonas con alta densidad de material capaz de dispersar electrones; el blanco corresponde a los electrones que no fueron desviados y atraviesan el espécimen y constituyen el background. Existen escalas de grises. Podemos resumir las diferencias entre el MO y el ME : 1) Las lentes magnéticas no tienen distancias focales fijas como las lentes ópticas. La distancia focal es dependiente de la intensidad de campo, cambiando la corriente que pasa a través de la bobina. 2) En el ME no es necesario cambiar la lente de Objetivo o las proyectoras cuando se desean distintas magnificaciones. Esto se logra variando la distancia focal de la proyectora, en tanto que la magnificación del objetivo es siempre fija. 11

12 3) El modo de formar la imagen es diferente en los 2 microscopios. En el MO se forma por absorción diferente de la luz, en tanto que en el ME la pérdida de electrones por dispersión en puntos individuales del espécimen resulta en variaciones de la intensidad de la imagen (contraste). Resulta claro por qué es necesario cortes muy finos. A tal fin el material biológico debe estar incluido en resinas especiales para vacío y con una rigidez suficiente para poder seccionarlo tan finamente en un ultramicrótomo con cuchillas de vidrio o de diamante. Dichas resinas son hidrofóbicas y requieren una deshidratación previa con solventes como acetona. Tratamientos tan drásticos hacen indispensables una adecuada fijación del material biológico que asegure la correcta preservación de la ultraestructura. Para ello el material debe ser procesado de manera específica y rigurosa. Este procesamiento incluye fijaciones, deshidrataciones, inclusiones, cortes ultradelgados, tinciones o contrastados. Un hecho destacable con el desarrollo del ME fue que mientras el microscopio de luz u óptico (MO) alcanzó su perfección de más de 2 siglos de desarrollo, el ME alcanzó un nivel comparable en el espacio corto de 2 décadas. Una enorme expansión de nuestro conocimiento de la ultraestructura de la materia ha tenido lugar gracias al ME. Ambos, instrumento y técnicas se han vuelto casi de rutina, lo que ha permitido la respuesta a muchos problemas fundamentales de significado biológico y médico. 12

13 MO (a) MET (b) MEB (c) El microscopio electrónico de transmisión (MET) tiene un límite de resolución de cerca de 2 nm. Esto es debido a limitaciones del lente usado para enfocar electrones hacia la muestra. Un MET mira a replicas de células muertas, después de haber sido fijadas y teñidas con iones de metales pesados. Los electrones son dispersados cuando pasan a través de una fina sección del espécimen, y luego detectados y proyectados hacia una imagen sobre una pantalla fluorescente. El microscopio óptico tiene un limite resolución de cerca de 200 nm (0.2 µm). Este límite se debe a la longitud de onda de la luz ( µm). Las células observadas bajo el microscopio óptico pueden estar vivas o fijadas y teñidas El microscopio electrónico de barrido (MEB) también tiene un límite de 2nm. Al igual que el MET, el MEB permite mirar a células muertas, después de haber sido fijadas y teñidas con iones de metales pesados. Con esta técnica los electrones son reflectados sobre la superficie del espécimen. Características principales del (a) Microscopio óptico, (b) Microscopio electrónico de transmisión y (c) Microscopio electrónico de barrido. 13