6. SENSORES BIOLÓGICOS
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- José Manuel Blázquez Crespo
- hace 7 años
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1 C6-Sensores biológicos 1 6. SENSORES BIOLÓGICOS 6.1 Clasificación y principios de operación. Estructura jerárquica de sistemas biológicos: Moléculas pequeñas: Aminoácidos, ácidos nucleicos, agua, lípidos, iones. Procesos importantes: polimerización de ácidos nucleicos para formar RNA y DNA, polimerización de aminoácidos para formar proteínas. Virus: escala de nm, infecciosos pero no se reproducen a sí mismos. Bacterias (células procariontes): escala de 1-10 µm, unicelulares, pueden reproducirse a sí mismos (organismos vivientes). Células eucariontes: células animales y vegetales, escala de µm, estructura compleja, pueden reproducirse a sí mismas y son capaces de ensamblarse para formar tejido. Construcción jerárquica de organismos vivientes: Células. Tejido: generado por diferenciación y asociación de células. Órganos: generado a partir de la organización para realizar una función específica. Organismos: generado a partir de la integración de varias funciones. Definición de sensores biológicos: dispositivos analíticos que pueden detectar especies químicas o biológicas o también microorganismos (nivel molecular). Modos de empleo: a) Monitoreo in vivo de concentraciones de una especie endógena en función de cambios fisiológicos inducidos internamente o por una invasión de un microbio. b) Detección de toxinas, bacterias y virus (desarrollo reciente e interés muy grande por guerras biológicas). Aplicaciones: Diagnóstico clínico Desarrollo de fármacos
2 C6-Sensores biológicos 2 Monitoreo ambiental (aire, agua y tierra) Control de calidad en alimentos Esquema general para biosensado: en general, se utiliza un elemento biológico de reconocimiento que detecta la presencia de la especie a detectar (analyte) y genera una respuesta física o química que es convertida a una señal por medio de un transductor. Muestreo Bioreconocimiento Transducción Detección Estimulación El funcionamiento general se basa en las siguientes etapas (ver diagrama): Muestreo: esta unidad introduce la especie a medir en el detector y puede ser tan simple como un circulador de líquido. Bioreconocimiento: liga o reacciona únicamente con la especie a detectar, lo que provee al sensor con especificidad. Estimulación: de manera general, puede ser proporcionada por campos ópticos, eléctricos u otra clase de campos que extraigan una respuesta como resultado del bioreconocimiento. Transducción: en presencia de la estimulación, transforma la respuesta física o química del bioreconocimiento en una señal eléctrica u óptica para ser detectada posteriormente por la unidad o etapa de detección. Detección: puede incluir reconocimiento de patrones para identificación de la especie a detectar (e.g., red neuronal). Biosensor óptico: en su forma más común, la estimulación utiliza una onda óptica. El proceso de transducción induce un cambio en la fase, amplitud, polarización o frecuencia de la onda óptica como respuesta a los cambios físicos o químicos producidos por el proceso de bioreconocimiento.
3 C6-Sensores biológicos 3 Otros tipos: algunos pueden utilizar estimulación eléctrica para producir transducción óptica (e.g., sensor electro-luminiscente), o estimulación óptica para producir transducción eléctrica (e.g., sensor foto-voltáico). Los primeros biosensores se basaban en respuestas electroquímicas, y en la actualidad son los que dominan el mercado. Sin embargo, los progresos en fibras ópticas y dispositivos de óptica integrada, en conjunto con el desarrollo de sistemas láser semiconductores, han hecho de los biosensores ópticos una opción muy atractiva para muchas aplicaciones. La sensibilidad en este tipo de biosensores se incrementa gracias a la inmovilización del elemento de bioreconocimiento en un elemento óptico tal como una fibra, una guía de onda o en dispositivos para propagación de plasmones superficiales. Componentes principales de un biosensor óptico: Fuente de luz Medio de transmisión óptico (fibra, guía de onda) Elemento de bioreconocimiento inmovilizado (enzimas, anticuerpos o microbios) Sondas ópticas para transducción (e.g., marcadores fluorescentes). Sistema de detección óptico Ventajas ofrecidas por biosensores ópticos: Alta selectividad y especificidad Sensado remoto Aislamiento de interferencia electromagnética Mediciones rápidas (tiempo real) Detección multicanal/multiparámetro Invasión mínima (útil para mediciones in vivo) Elección de componentes ópticos para bio-compatibilidad Información química detallada sobre la especie a detectar.
4 C6-Sensores biológicos Elementos fundamentales: principio de biosensado óptico. Principios fundamentales: bioreconocimiento y transducción óptica Reconocimiento biológico. Los elementos de bioreconocimiento son sustancias biológicas tales como enzimas, anticuerpos e inclusive células y microorganismos, que reconocen selectivamente a una especie biológica en particular. Estos elementos son frecuentemente inmovilizados en la vecindad de un elemento óptico con el fin de incrementar su concentración local y también para permitir su reciclaje. Enzimas. Se utiliza como bioreconocedor por su selectividad para ligarse con reactivos específicos (sustrato) y catalizar su conversión a un producto. Además de selectividad, ciertas reacciones pueden proveer de transducción óptica a través de un producto que absorba a una longitud de onda diferente (cambio en absorción), o bien produzca fluorescencia. Alternativamente, la reacción puede interactuar con un tinte orgánico para producir una respuesta óptica. Anticuerpos. Son proteínas que se ligan de manera selectiva con un antígeno gracias a su compatibilidad geométrica. Generalmente esta asociación selectiva se representa como la combinación de un candado (anticuerpo) y una llave (antígeno). Esta asociación física puede también producir una respuesta óptica que puede ser intrínseca como el cambio de una propiedad óptica del anticuerpo o del antígeno como resultado de la asociación. Alternativamente, pueden utilizarse también marcadores fluorescentes.
5 C6-Sensores biológicos 5 Lecitinas. Son proteínas que se ligan con residuos de azúcares o también con otros tipos de proteínas. Han sido las más utilizadas para el desarrollo de sensores de glucosa en los que generalmente se utilizan marcadores fluorescentes para producir una respuesta óptica. Neuroreceptores. Estos son compuestos que son neurológicamente activos como la insulina, hormonas y neurotransmisores que actúan como mensajeros a través de interacciones entre las ligas. Se etiquetan con marcadores fluorescentes para producir una respuesta óptica a través de la reacción química. DNA/PNA. La paridad complementaria que proporciona la estructura del DNA puede ser utilizada para reconocimiento de una secuencia para ciertas bases de ácidos nucleicos. El PNA es otro tipo de ácido nucleico que presenta también una estructura ordenada y que se liga con su secuencia complementaria con gran afinidad y especificidad Transducción óptica. Existen diversas manifestaciones de tipo óptico que puede crear la etapa de bioreconocimiento bajo la presencia de una especie a detectar (analyte) cuando esta se excita con una onda de luz. Algunos de los principios de transducción ópticos utilizados para biosensado se listan a continuación.
6 C6-Sensores biológicos 6 Cambios de fase: producidos por el cambio en la parte real del índice de refracción. Pueden manifestarse como: i) Cambio en la polarización de un haz polarizado linealmente ii) Cambio en las características de propagación de una guía de onda (fibra o plana) iii) Cambio en la distribución del campo óptico, particularmente en una interfaz (onda evanescente). Cambios en amplitud: son los cambios en la intensidad del haz de luz que pueden producirse por absorción, reflexión u otros mecanismos de pérdidas de transmisión. Cambios en frecuencia: se puede utilizar fluorescencia generada por luz absorbida (la fluorescencia generalmente se presenta desplazada a longitudes de onda mayores por el efecto de Stokes), o bien utilizar dispersión de Raman (excitación por vibraciones). También puede utilizarse algún efecto no lineal Mediciones fluorescentes. Las mediciones fluorescentes pueden realizarse de manera directa o indirecta. Sensado directo: registra directamente el cambio en las propiedades fluorescentes debido a la liga entre la especia a detectar y el elemento de bioreconocimiento (anticuerpo o enzima), o bien, registra la producción de alguna propiedad fluorescente generada por la reacción de una enzima específica catalizada. Sensado indirecto: se utiliza como etiqueta fluorescente un tinte externo cuyas propiedades de fluorescencia cambian en respuesta al bioreconocimiento de una especie. 3.3 Elementos para inmovilización. Los elementos de bioreconocimiento se inmovilizan generalmente sobre un soporte sólido, por ejemplo, membranas, polímeros o vidrios fabricados con el proceso de sol-gel. Los métodos para inmovilizar pueden ser de carácter físico, químico y, en algunos casos,
7 C6-Sensores biológicos 7 pueden también basarse en la confinación de bioreconocedores en el volumen de una matriz con porosidad controlada (el tamaño del poro proporciona también especificidad). Métodos de inmovilización. Membranas semipermeables. Utilizadas en muchos sensores de fibra óptica; es el método más simple. Adsorción. Se basa en la atracción de la biomolécula por medio de fuerzas iónicas, hidrofóbicas o de van der Waal (depende de la naturaleza de la molécula). Se utiliza mucho en sensores de ph y es un método muy simple aunque carece de especificidad. Otras desventajas: variación en la densidad de material adherido y pérdida de bioreconocedores por desorción. Ligado iónico. Se basa en interacciones electrostáticas entre el soporte sólido y el bioreconocedor. La polaridad o la carga del bioreconocedor puede ajustarse mediante el ph, mientras que en el soporte se utiliza un polímero con cargas generalmente negativas. Trampas físicas. El bioreconocedor queda atrapado en una matriz porosa. Este método es de los más flexibles y permite diseñar sensores para diversas moléculas gracias al control del tamaño de los poros. La desventaja más importante de este método es que no puede controlarse la orientación de los bioreconocedores y algunos quedan atrapados en la matriz sin ejercer acción alguna sobre la molécula. Inmovilización química. Se basa en la formación de un enlace covalente entre el soporte sólido y el bioreconocedor. Se utiliza mucho en sensores de fibra óptica, en sensores SPR. 3.4 Tipos de sensores. Los biosensores pueden clasificarse de acuerdo a la técnica óptica utilizada para medir, o bien, de acuerdo al dispositivo utilizado para confinar la luz. En algunos casos, el dispositivo utilizado como guía de onda puede incluir al elemento sensor, o también pueden presentarse combinaciones de técnicas especiales con alguna guía de onda en particular (e.g., sensores de fibra óptica utilizando SPR).
8 C6-Sensores biológicos Sensores de fibra óptica. Han sido los más estudiados debido a la madurez alcanzada por la tecnología de fibras ópticas gracias a los desarrollos en sistemas de comunicaciones. Existen diversos tipos de fibras y dispositivos de fibra óptica que pueden ser utilizados para implementar sensores con topologías diversas. Algunas características atractivas incluyen: Pueden utilizarse grandes longitudes de fibra; esto permite incrementar la longitud de interacción además de la superficie disponible para realizar detección de moléculas múltiples. Compatibilidad con catéteres y/o endoscopios para sensado in vivo. Esto ofrece la posibilidad de realizar mediciones de flujo sanguíneo, contenido de glucosa y otras. Algunas clasificaciones de estos sensores: Extrínsecos o intrínsecos. Modulados en intensidad, modulados en fase (generalmente interferométricos): mientras que los primeros pueden utilizar fuentes de luz no coherentes, los sensores interferométricos requieren muchas veces de sistemas láser monomodales y de alta coherencia. Sensores modulados en intensidad: al igual que los sensores basados en fluorescencia, estos elementos utilizan fibras ópticas de varios tipos y en las puntas se inmovilizan los elementos de reconocimiento biológico (e.g., enzimas o anticuerpos). Algunas configuraciones se muestran en las siguientes figuras. Los sistemas de detección pueden ser tan simples como un fotodetector, hasta basarse en técnicas espectroscópicas (sobre todo de absorción). Pueden utilizar también sistemas de detección balanceados (i.e., con sistemas de referencia) u otras técnicas de supresión de ruido.
9 C6-Sensores biológicos 9 Sensores modulados en fase: Además de utilizar técnicas interferométricas, pueden usarse también técnicas polarimétricas Sensores de guías de onda planas. Al igual que en los sensores de fibra óptica, las guías de onda planas utilizan elementos de inmovilización en la superficie. La mayoría de estos sensores se basan en la interacción con la onda evanescente. Ofrecen también la posibilidad de realizar análisis de moléculas múltiples por medio de técnicas de generación de patrones al inmovilizar diversos bioreconocedores en un arreglo ordenado. De acuerdo a las dimensiones de la guía pueden clasificarse como: Sensor de óptica integrada: las dimensiones de la guía son comparables a la longitud de onda; se utiliza la óptica de ondas para describir la propagación de la luz en la guía. Se considera además que los dispositivos de óptica integrada incorporan diversas funciones en un solo sustrato, por lo cual, estos pueden contener ya la etapa de detección del biosensor o bien, un arreglo interferométrico que permita detectar cambios de fase en la onda óptica. Sensor de reflexión total interna: las dimensiones son mucho mayores a la longitud de onda y la propagación se puede describir mediante óptica de rayos. Algunas configuraciones demostradas para detección de moléculas múltiples con guías de onda planas se muestran en las siguientes figuras.
10 C6-Sensores biológicos Sensores de onda evanescente. Estos sensores se basan en la interacción de las moléculas con la luz que no queda confinada en la guía de onda y que penetra la región de índice de refracción menor que rodea al núcleo de la guía (revestimiento, aire o elemento bioreconocedor inmovilizado en la superficie). Algunos de los mecanismos de transducción que pueden utilizarse con estos sensores son: Conversión de frecuencia (excitación de fluorescencia, SHG). Acoplamiento de onda evanescente en acopladores direccionales. Espectroscopía con onda evanescente. Un ejemplo de un arreglo para sensado de fluorescencia se muestra en la figura anterior. Se trata de excitar el campo evanescente además de recolectar la fluorescencia emitida en la región que se deja expuesta para colocar los bioreconocedores y fluoróforos. El sensado utilizando acopladores direccionales se basa en alterar el acoplamiento entre las dos fibras o guías que forman el acoplador. Esto se logra inmovilizando el
11 C6-Sensores biológicos 11 bioreconocedor en la región de acoplamiento del dispositivo. Cuando la molécula es atrapada en la región de sensado, se genera un cambio local de índice de refracción que, a su vez, genera cambios en el coeficiente de acoplamiento. Pueden monitorearse cambios en la cantidad de potencia óptica transferida de una guía a otra, la longitud de onda u otros parámetros. Los sensores de espectroscopía con onda evanescente utilizan la interacción de esta onda con la capa de sensado para obtener información espectroscópica del ligado de las moléculas. La información puede ser en las bandas de absorción en el IR (vibracional) o en las regiones UV-visible (electrónicas); puede también utilizarse transiciones espectroscópicas de Raman Otros tipos: interferométricos, resonancia superficial de plasmones. Los sensores interferométricos más utilizados se basan en el interferómetro de Mach- Zehnder. En estos casos, uno de los brazos del interferómetro se utiliza para inmovilizar el bioreconocedor. El cambio de fase generado por la liga entre la molécula y el bioreconocedor se registra en el interferograma. Los sensores SPR son quizás los más utilizados para aplicaciones biológicas y existen diversos dispositivos comerciales basados en este principio que pueden encontrarse en el mercado. En principio, esta técnica es una extensión del sensado por onda evanescente, con la diferencia de que la guía de onda plana se reemplaza por una interfaz metaldieléctrico.
12 C6-Sensores biológicos 12 Plasmones superficiales: ondas electromagnéticas que se propagan a lo largo de la interfaz entre un material metálico y uno dieléctrico (e.g., una película orgánica). La manera más común de excitar estas ondas es mediante reflexión total atenuada. Principio de operación: el arreglo más común utiliza un prisma para generar la excitación de los plasmones. El ángulo al que se presenta la reflexión total entre la interfaz cambia cuando la molécula se liga con el bioreconocedor. La información que se mide de la curva obtenida es el ángulo SPR, el valor mínimo de reflectividad y el ancho de las curvas de resonancia. Con esto puede obtenerse la parte real y la imaginaria del índice de refracción, así como el espesor de la capa sensora. Los experimentos con estos arreglos involucran medir el desplazamiento del ángulo SPR en función del ligado de las moléculas. Algunas ventajas de SPR: no requieren etiquetas fluorescentes, análisis en tiempo real, requieren cantidades pequeñas para realizar el análisis.
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