TEMA 13. PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE ANTIBIÓTICOS

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1 TEMA 13. PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE ANTIBIÓTICOS 1. INTRODUCCIÓN Los antibióticos son productos del metabolismo microbiano capaces de matar o inhibir el crecimiento de otros microorganismos a bajas concentraciones. Para buscar antibióticos que ataquen a las células bacterianas y no a las humanas debemos buscar aquellos que destruyen elementos que no posean las células humanas y sí las bacterianas, como por ejemplo, la pared celular solo presente en las bacterianas, o los ribosomas que son diferentes en ambos tipos de células. De los grupos taxonómicos conocidos, las bacterias (unicelulares) son el 14& de los antibióticos, los hongos el 22% y los actinomicetos (bacterias filamentosas) el 64%; el principal productor de antibióticos es el género Actinomyces. De los sistemas de producción industrial solo unos pocos sirven y se usan comercialmente, el principal es la fermentación, que produce 123 antibióticos, luego los métodos semisintéticos, que producen 50 y por último los métodos sintéticos, con los que solo se han obtenido tres antibióticos, cloranfenicol, fosfomicina y pirrolnitrina, ya que su estructura es muy simple. De los 1600 antibióticos producidos por hongos, solo 10 son comerciales y solo 4 se usan en clínica, penicilinas, cefalosporina C, griseofulvina y ácido fusídico. A partir de la década de los 70 no se ha descrito ningun nuevo antibiótico que se pueda usar en clínica, todos los que se han desarrollado son modificaciones de antibióticos ya conocidos; esto se debe a que han aumentado muchísimo los costes para el desarrollo de un nuevo antibiótico, se necesitan desde que se describe a nivel de laboratorio hasta que se comercializa una media de 10 años y el coste es de entre 10 y 20 millones de euros, las pruebas clínicas son lo más costoso. La búsqueda de nuevos antibióticos por tanto se centra en la mejora de antibióticos por procedimientos uqímicos o genéticos (mutasíntesis, fusión de protoplastos, ingeniería genética...) y en sintetizar antibióticos con estructuras básicas nuevas, se realizan screening en nuevos grupos de microorganismo y se utilzan nuevos procedimientos de prueba. TIPOS DE ANTIBIÓTICOS Se pueden clasificar según su estructura química: β-lactámicos Penicilinas: Bencilpenicilina (Penicillium chrysogenum) Clavamas: Ácido clavulánico (Streptomyces clavuligerus) Cefalosporinas: 3ª generación.cefotaxina (Acremonium-Cephalosporium) Monobactamas: Aztreonam (Chromobacterium violaceum) Carbapenemas: Imipenem (Streptomyces cattleya) MACRÓLIDOS: Eritromicina (Streptomyces griseus) AMINOGLICÓSIDOS: Estreptomicina (Streptomyces griseus) TETRACICLINAS: Doxiciclina (Streptomyces) POLIPEPTÍDICOS: Bacitracina (Bacillus subtilis); polimixina B (Bacillus polymixa) POLIENOS: Nistatina (Streptomyces noursei), anfotericina B (Streptomyces nodosus) OTROS: Cloranfenicol (Streptomyces venezuelae)-ya no se usa en humanos 1

2 2. ANTIBIÓTICOS β-lactámicos-penicilina Todos los antibióticos β-lactámicos tienen en común el anillo β-lactámico en su estructura. La penicilina fue descrita por Fleming en 1929, aislada por Florey y Chain en 1940, comprobaron que la penicilina era muy lábil al ácido y se desactivaba, esto implica que la penicilina G no se puede administrar oralmente. Florey y Chain viajan a EEUU y en 1942 ya consiguen cantidad suficiente de penicilina para distribuirla, gracias al licor de maceración del maíz que se usó como caldo de cultivo para Penicillium. La penicilina es producidad por muchos hongos como Penicillium y Aspergillus, además tiene baja toxicidad, solo el % de los pacientes desarrollan alergias. Las penicilinas son inhibidores específicos de la síntesis de peptidoglicano ya que son análogos estructurales de la D-alanil-D-alanina, péptido que une las cadenas de N- acetilglucosamina que forman la pared bacteriana. Al ser análogos estructurales las transpeptidasas tienen mayor afinada por ellos y se unen irreversiblemente, inactivándolas. La penicilina G es muy efectiva frente a G+, ya que para inactivar las transpeptidasas tiene que entran en el interior de la célula y es más difícil atravesar la membrana externa que poseen las bacterias G-. AMOXICILINA: es la penicilina que se puede administrar por vía oral. El Clamoxyl es el nombre comercial de un antibiótico que contiene amoxicilina y ácido clavulínico. ESTRUCTURA Y SÍNTESIS La penicilina está compuesta por el ácido-6- aminopenicilánico (6-APA), que en la posición 6 tiene un radical que varía y en funcion de la estructura que haya tendremos los distintos tipos de penicilina. La primera descrita, llamada penicilina G, es la bencilpenicilina, y tiene como radical all fenilacético. El 6-APA consta del anillo β-lactámico y un anillo tiazolidínico. Según el medio de obtención hay tres tipos de penicilinas, naturales, biosintéticas y sintéticas. PENICILINAS NATURALES: Se producen cuando se lleva a cabo la fermentación sin adición de precursores de la cadena lateral; solo es útil terapéuticamente la bencilpenicilina. PENICILINAS BIOSINTÉTICAS: Se producen cuando se lleva a cabo la fermentación con adición de precursores de la cadena lateral. De las más de 100 penicilinas biosintéticas obtenidas solo se han comercializado la G, V y pequeñas cantidades de O. 2

3 PENICILINAS SEMISINTÉTICAS: Se producen cuando se añade químicamente la cadena lateral al ácido 6-APA PRODUCCIÓN DE 6-APA: Penicillium chrysogenum puede sintetizar este ácido si el medio de cultivo carece de precursores de la cadena lateral. Sin embargo, la producción de 6-APA en estas condiciones es tan pequeña que hace inviable este procedimiento. Actualmente el uso de las penicilinas naturales es 38% en medicina humana, 12% en veterinaria y un 43% son penicilinas semisintéticas. BIOSÍNTESIS Y REGULACIÓN El ácido 6-APA siempre está unido al grupo acilo. La bencilpenicilina es un tripéptido cuyo origen es el anillo L-alfa aminoadípico, al que se le une la L-cisteína y luego la L-valina. No se sabe muy bien como ocurre, solo que en una ciclación de dos etapas se obtiene la isopenicilinan para luego dar la bencilpenicilina gracias a la penicilina transacetilasa. 3

4 SISTEMAS DE REGULACIÓN: -REGULACIÓN POR RETROALIMENTACIÓN.- La observamos en la biosíntesis de lisina y penicilina por Penicillium chrysogenum. Se produce porque a partir del α-aminoadipato (α-aa) se produce lisina y bencilpenicilina. La lisina inhibe a la homocitrato sintasa, primera enzima de la síntesis y se inhibe la síntesis de bencilpenicilina. -REGULACIÓN CATABÓLICA: El azúcar que reprime la biosíntesis de la penicilina es la glucosa, determinadas concentraciones hacen que la enzima se inactive y que se produzca menos penicilina; se puede sustitiur la glucosa como fuende de carbono por lactosa o por una cantidad inferior a la que actúa como represor catabólico. -INDUCCIÓN ENZIMÁTICA REGULACIÓN POR EL ESTADO ENERGÉTICO DESARROLLO DE CEPAS Es la obtención de cepas más productoras que la original. Métodos: -Mutación-selección (método más utilizado): La primera productora de penicilina fue el contaminante sobre el Staphylococcus aureus, ese hongo era Penicillium notatum. En 1945 se cambió el hongo a P.chrysogenum. En 1951 se empezó a trabajar con P.chrysogenum NRRL ç-recombinación Los objetivos son: 1- Reunir en una cepa las mejoras obtenidas en varias por distintos métodos. 2- Eliminar mutaciones indeseables que tienen defectos pleiotrópicos para el rendimiento (limpieza génica); el incremento de producción es un 8%. Los defectos pleiotrópicos son aquellos que reproducen en una mutación al azar defectos colaterales al utilizar un mutágeno. 3- Eliminar en las cepas de alta producción cambios fisiológicos indeseables. Esporulación más estable. -Ingeniería genética que incluye la tecnología del DNA recombinante "in vitro" 4

5 MÉTODOS DE PRODUCCIÓN Se añade cultivo hasta llegar a la producción en fermentación. Hay que evitar la formación de agregados, ya que son hongos filamentosos y puede haber un déficit de la llegada de oxígeno. Una vez obtenida la penicilina se filtra y nos quedaremos con el sobrenadante de cultivo que se purifica. PROCESO FERMENTATIVO: 1- Fermentación sumergida en tanques de a L 2- Velocidad de aireación: vvm 3- Agitación: impulsores tipo turbina ( rpm) 4- Temperatura óptima: 25-27ºC 5- ph: 6.5 MEDIO DEFINIDO : FUENTE DE CARBONO ÁCIDOS ORGÁNICOS Lactosa Glucosa Almidón Ácido cítrico Ácido acético 30 g/l 10 g/l 15 g/l 10 g/l 2.5 g/l PRECURSORES Ácido fenilacético 0.5 g/l FUENTE DE NITRÓGENO SALES MINERALES Etilamida Sulfato amónico Fosfato potásico Sulfato magnésico " ferroso " cinc " cobre " manganeso " cobalto " sódico 3.0 g/l 5.0 g/l 1.0 g/l 0.5 g/l 50 mg/l 10 mg/l 10 mg/l 10 mg/l 5.0 mg/l 1.0 mg/l MEDIO COMPLEJO: FUENTE DE CARBONO ÁCIDOS ORGÁNICOS Lactosa Glucosa Almidón Ácido láctico Ácido acético g/l 5.0 g/l 15 g/l 0.5 g/l 0.5 g/l PRECURSORES Ácido fenilacético 0.5 g/l FUENTE DE NITRÓGENO Aminoácidos Aminas Sales de amonio Ntotal g/l 5

6 ALIMENTACIÓN CONTINUA DEL FERMENTADOR Con glucosa como fuente de carbono y amonio como fuente de nitrógeno; el rendimiento es: 65% en mantenimiento energético, 25% en crecimiento, y un 10% en la penicilina. RECUPERACIÓN DEL PRODUCTO Se lleva a cabo por dos etapas de extracción continua en contracorriente del caldo de fermentación con acetato de amilo o de butilo a 0-3ºC y ph El caldo acuoso de fermentación se pone en contacto con un solvente inmiscible, se produce la concentración de la fase solvente y la purificación adicional. CRISTALIZACIÓN Y PRECIPITACIÓN: La penicilina G del caldo de fermentación se pone en contacto con acetato de butilo (solvente orgánico) y acetato potásico en solución etanólica y precipita la penicilina G con un rendimiento del 90%. 6