UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA TESIS

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1 UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA TESIS PRESENTADA AL HONORABLE CONSEJO DIRECTIVO COMO REQUISITO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE MÉDICO VETERINARIO Y ZOOTECNISTA TEMA ESTUDIO DE LA POTENCIA NEUTRALIZANTE EN LOTES DE SUEROS ANTIOFÍDICOS DE MAS DE UN AÑO DE ALMACENAMIENTO AUTOR JOSÉ LEONARDO LEÓN QUISPE DIRECTOR DR. SANTIAGO RANGEL BAJAÑA. Msc. GUAYAQUIL-ECUADOR 2013

2 TEMA ESTUDIO DE LA POTENCIA NEUTRALIZANTE EN LOTES DE SUERO ANTIOFÍDICO DE MAS DE UNA AÑO DE ALMACENAMIENTO AUTOR JOSÉ LEONARDO LEÓN QUISPE TESIS PRESENTADA AL H. CONSEJO DIRECTIVO COMO REQUISITO PARCIAL A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE: MÉDICO VETERINARIO Y ZOOTECNISTA LOS MIEMBROS DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN DESIGNADO POR EL H. CONSEJO DIRECTIVO DE LA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA, DAN POR APROBADA LA PRESENTE INVESTIGACIÓN CON LA CALIFICACIÓN DE ( ) EQUIVALENTE A ( ) Dr. Santiago Rangel Bajaña Msc. Director de Tesis Blgo. Antonio Freire Lascano Examinador Principal Dr. Mauro Loor Macías Examinador Principal ii

3 Los datos escritos en esta investigación son de Conocimiento y responsabilidad del autor. JOSÉ LEONARDO LEÓN iii

4 DEDICATORIA Al culminar esta etapa tan importante en mi vida, dedico este trabajo y agradezco a Dios porque me ha permitido estar rodeado de personas que siempre creyeron y confiaron en mí. A mis padres Luis León y Marina Quispe; que con su esfuerzo siempre me impulsaron a concluir mi carrera. A mi esposa Sandra Barrientos; que siempre ha estado conmigo en los buenos y malos momentos. A las dos personas más importantes que han llegado han mi vida como son; mis dos hijos Lucas y Samuel que a pesar de su cortad edad me dan fuerza para seguir adelante.

5 AGRADECIMIENTO Le doy las gracias a Dios porque de Él viene la sabiduría y la inteligencia. También agradezco al Instituto Nacional de Higiene Leopoldo Izquieta Pérez, institución que me abrió las puertas para desarrollar mi trabajo de tesis. A los doctores Héctor Cabrera y Raúl Martínez que siempre colaboraron con lo necesario para el desarrollo de mi investigación. Al Dr. Santiago Rangel Bajaña Msc. que con su conocimiento y experiencia fue parte fundamental de este trabajo investigativo. A los docentes de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Guayaquil, por impartir con calidez calidad y paciencia sus conocimientos. A cada una de las personas que de una forma u otra colaboraron para la culminación de la presente investigación. A todos mis compañeros y amigos, muchas gracias. ii

6 ÍNDICE GENERAL CAPÍTULOS Pág. I. INTRODUCCIÓN II. REVISIÓN DE LITERATURA III. MATERIALES Y MÉTODOS IV. RESULTADOS V. DISCUSIÓN 29 VI. CONCLUSIONES. 31 VII. RECOMENDACIONES. 32 VIII. RESUMEN. 33 IX. SUMMARY 34 X. BIBLIÓGRAFAA 35 XI. ANEXOS 38

7 CONTENIDO Portada.. I Aceptación del Tribunal de Sustentación.. Ii DEDICATORIA... Iv AGRADECIMIENTO. V I. INTRODUCCIÓN OBJETIVOS HIPÓTESIS DE LA INVESTIGACIÓN 1.3. VARIABLES II. REVISIÓN DE LITERATURA SUEROS ANTIOFÍDICOS GENERALIDADES PRODUCCIÓN DE SUERO ANTIOFÍDICO Obtención del Veneno Obtención del plasma hiperinmune Purificación de los anticuerpos APLICACIÓN DEL SUERO ANTIOFÍDICO Tiempo de aplicación Reacciones Caducidad PODER NEUTRALIZANTE DEL SUERO ANTIOFÍDICO Neutralización de los efectos sistémicos Neutralización de los efectos locales (Hemorragia, edema y mionecrosis) Neutralización de las actividades enzimáticas de los venenos ii

8 2.5. UNIFORMIDAD Y ESTABILIDAD DEL SUERO ANTIOFÍDICO. III. MATERIALES Y MÉTODOS LOCALIZACIÓN DEL ENSAYO Coordenadas 3.2. CONDICIONES METEOROLÓGICAS MATERIALES Materiales biológicos Materiales de laboratorio Equipo general y complementario Materiales de oficina MÉTODOS Recolección del suero antiofídico Pesaje de los ratones Incubación e inoculación de suero y veneno Potencia neutralizante Recolección de datos Análisis estadístico IV. RESULTADOS POTENCIA NEUTRALIZANTE Potencia neutralizante de sueros antiofídicos del Género Bothrops por especie Potencia neutralizante de sueros antiofídicos del género Bothrops por año de almacenamiento Desviación estándar de la potencia neutralizante de sueros antiofídicos del Género Bothrops iii

9 Desviación estándar de la potencia neutralizante de sueros antiofídicos del género bothrops de acuerdo a los años de almacenamiento V. DISCUSIÓN VI. CONCLUSIONES. VII. RECOMENDACIONES. VIII. RESUMEN.. IX. SUMMARY X. BIBLIOGRAFÍA. XI. ANEXOS iv

10 I. INTRODUCCIÓN En muchas partes del mundo, el ofidismo es un problema sanitario al que se le presta especial atención, a causa de las características clínicas críticas que se presentan con las mordeduras de serpientes venenosas. En este sentido, la eficacia de los sueros antiofídicos enfrenta problemas que se traducen en una pérdida de su capacidad neutralizante al momento de su aplicación, debido a un mal manejo en su almacenamiento, a un incorrecto seguimiento de las recomendaciones del fabricante y la fecha de expiración propuesta por el fabricante. Algunos factores explicativos tienen que ver con las altas temperaturas y a la carencia de sistemas de refrigeración adecuados. Al respecto, se encuentra bastante documentado que las temperaturas elevadas favorecen la desnaturalización o precipitación irreversible de las inmunoglobulinas, tal como ocurre con las proteínas en general, las cuales al perder su conformación tridimensional, pierden su funcionalidad. Pero cuando éstos elementos han sido manipulados eficientemente, existe la posibilidad de que aún estando caducado, el poder neutralizante aún siga activo en el suero antiofídico, y ante la posibilidad de escasez y la presentación de emergencias se debe conocer si es posible la suministración de los mismos y en qué medida necesaria para coadyuvar al efecto neutralizante del envenenamiento en la vida del afectado. Es muy importante comprender que los sueros antiofídicos producidos en otros países como México o Colombia, tienen una efectividad mucho menor ante las mordeduras de víboras en Ecuador ya que por lo general no se trata de las mismas especies, o porque las proteínas que componen sus venenos no son las mismas en los venenos locales. Un suero antiofídico suele tener un tiempo de validez de un año (esto por garantía de la casa fabricante), aun que en realidad son activos hasta los 4 años. (Liofilizados) No existen en realidad ó son nulos los estudios concernientes a esta temática planteada sobre la potencia neutralizante de los sueros antiofídicos con un año de almacenamiento, por eso es difícil considerar estudios anteriores comparativos relacionados al tema de la presente tesis. El presente estudio se presenta con el fin de establecer, sustentar, verificar o confirmar la condición de los lotes de suero antiofídico con más de un año de almacenamiento como antiveneno POLIVALENTE, es decir, que posee una adecuada capacidad de neutralización 1

11 contra todos y cada uno de los venenos de las diferentes especies de serpientes en el Ecuador. En lo fundamental, se pretende que los resultados que se obtengan con este trabajo constituyan una experiencia valiosa en el sentido de posibilitar la incorporación de un paso adicional que refuerce la seguridad vial del producto final, el cual consiste en una conservación efectiva para que al término del tiempo de caducidad se conserven aún las propiedades autónomas del producto.. En última instancia, se procura realizar el estudio de la efectividad del suero antiofídico almacenado, manteniendo la potencia neutralizante del suero, generando la menor cantidad posible de reacciones adversas en las personas a las que se apliquen el mismo. 1 LÓPEZ, N.et al Características de los pacientes con accidente ofídico y complicaciones infecciosas atendidos en el Hospital Pablo Tobón Uribe entre los años 2000 y

12 1.1. OBJETIVOS GENERAL: Establecer un estudio de la potencia neutralizante en lotes de suero antiofídicos de más de un año de almacenamiento ESPECÍFICOS: Verificar la eficacia de la potencia neutralizante en lotes de sueros antiofídicos almacenados HIPÓTESIS DE LA INVESTIGACIÓN H.I. Los sueros antiofídicos de más de 1 año de almacenamiento mantiene la potencia neutralizante aceptable para uso humano. H.o.Los sueros antiofídicos producidos en el Instituto Nacional de Higiene Leopoldo Izquieta Pérez no mantiene la potencia neutralizante aceptable para uso humano VARIABLES Variable independiente: Sueros antiofídicos almacenados Variable Dependiente: Estudio de la potencia neutralizante. 3

13 II. REVISIÓN DE LITERATURA 2.1. SUEROS ANTIOFÍDICOS GENERALIDADES Los antivenenos son preparaciones de inmunoglobulinas purificadas a partir del plasma de animales, generalmente ovinos o equinos, que han sido inmunizados con veneno de serpiente. Debido a que la naturaleza y composición de los venenos varía de una especie a otra, los sueros antiofídicos son específicos solo para venenos antigénicamente relacionados con los venenos empleados en la inmunización. En cualquier caso, los envenenamientos ofídicos deben ser tratados con antivenenos específicos, cuya eficacia haya sido validada en la neutralización de efectos particulares como hemorragia, edema y coagulopatías, tanto en estudios preclínicos como en estudios clínicos PRODUCCIÓN DE SUERO ANTIOFÍDICO OBTENCIÓN DEL VENENO: Primero se obtiene el veneno de las serpientes. Para conservar la estructura y la actividad de los diferentes componentes del veneno, este es estabilizado mediante un proceso llamado liofilización, en el cual el agua es sublimada y el veneno es recuperado como un polvo seco que puede ser almacenado durante años sin descomponerse y que al ser disuelto en agua recupera las propiedades que tenía el día de su extracción. EL Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical Leopoldo Izquieta Pérez elabora en sus instalaciones una solución salina de inmunoglobulina heteróloga purificada de origen equino que contiene fenol 0.25% y thimerosal al 0.005% como preservativos. Cada frasco de 10 ml de Suero Antibotrópico neutraliza no menos de 25 mg de veneno de: Bothrops asper (equis, equis rabo de hueso), Bothrops atrox (pitala, macanche), Bothrops xanthogramma (equis pachona). 2ACOSTA P., Edit (2004). MINISTERIO DE SALUD PÚBLICA - ECUADOR Manual de Normas y Procedimientos sobre Prevención y Tratamiento de Accidentes Ocasionados por Mordedura de Serpientes.. 4

14 En la práctica diaria del Hospital José María Velasco Ibarra hay disponibilidad del suero antiofídico polivalente liofilizado PROBIOL, de elaboración colombiana, cada ampolla reconstituida contiene inmunoglobulinas equinas que neutralizan como mínimo 25 mg de veneno de Bothrops atrox, 25 mg de veneno de Bothrops asper, 10 mg de veneno de Crotalus durissus y 20 mg de veneno de Lachesis muta OBTENCIÓN DEL PLASMA HIPERINMUNE: Una vez que el veneno es liofilizado se emplea para preparar una serie de inyecciones con dosis progresivas que son administradas a caballos por vía subcutánea. El sistema inmunológico de los caballos reconoce a las proteínas del veneno como extrañas y responde de una forma que se caracteriza por la producción de gran cantidad de anticuerpos dirigidos contra los elementos del veneno. Posteriormente los caballos son sometidos a un proceso en el cual se les extrae sangre en una cantidad que no compromete su salud. Luego de que la sangre es colectada asépticamente en bolsas estériles que contienen un anticoagulante, se deja reposar en refrigeración hasta que las células sanguíneas sedimentan y es posible separar de ellas el plasma donde se encuentran los anticuerpos que constituyen el principio activo de los antivenenos. Para evitar que este proceso de sangría produzca cuadros de anemia en los animales empleados, cada paquete de glóbulos rojos es resuspendido en solución salina y retransfundido al caballo respectivo. Finalmente los caballos son enviados al campo, donde descansan y se recuperan antes de ser empleados nuevamente. 4 3AGUADO, J; AGUILAR, J, Y AGUIRRE, C Medicina Interna de Farreras/ Rozman. 14ta.ed. Barcelona: Dworki. ÁNGEL R ActMed Col 14:349, 4BOLAÑOS, R., ROJAS, O., ULLOA, C.E

15 PURIFICACIÓN DE LOS ANTICUERPOS: Los anticuerpos son purificados adicionando ácido caprílico al plasma, la mayoría de las proteínas presentes en el plasma que no tienen actividad neutralizante sobre la toxicidad del veneno, como son la albúmina y el fibrinógeno, son precipitadas y posteriormente removidas por una serie de filtraciones. El producto resultante es una solución estéril de anticuerpos equinos que es formulada a ph fisiológico con preservantes y otros excipientes. 5 reanimación. 2.3 APLICACIÓN DEL SUERO ANTIOFÍDICO Se cateteriza una vena periférica, distinta a la utilizada en la fase de No se debe realizar prueba en conjuntiva ocular o inyección intradérmica. Todo paciente debe considerarse como potencialmente alérgico o sensibilizado y debemos tener a mano el equipo de reanimación. La prueba no tiene valor predictivo. El número de ampollas calculado se disuelve en 250cc de solución salina normal para adultos y en 100 cc para niños. Se inicia el goteo de la mezcla a una velocidad de 10 gotas por minuto durante 10 a 15 minutos. Si no hay reacción alguna, el resto de la dilución se pasa en 30 a 60 minutos. Importante purgar el equipo de venoclisis, para que el paciente reciba desde el comienzo el suero. Las manifestaciones de sensibilidad al suero pueden presentarse entre unos pocos minutos y 24 horas. El paciente puede presentar signos de inestabilidad hemodinámica, escalofríos, urticaria, angioedema y aun anafilaxia franca. Ante cualquiera de estas situaciones se debe suspender el goteo e iniciar una dosis de adrenalina entre 0.3 y 0.5 mg. por vía intravenosa, hidrocortisona 3 a 6 mg. IVcada Costa Rica. Rev. Biol. Trop.; 30: h BOLAÑOS, R., CERDAS, L. Rica. Bol. Of. Sanit. Panam. 1980; 88:

16 seis horas por un día y aplicar un antihistamínico. Aunque en el manejo de la reacción alérgica por otras causas, se recomienda la administración de adrenalina IM, el cuadro hemorrágico del accidente ofídico lo contraindica. Quince minutos después de la aplicación de la adrenalina,se reinicia el goteo del suero. Si la reacción alérgica vuelve a presentarse, se inicia un goteo de adrenalina diluyendo una ampolla (un miligramo) en 250 cc de suero fisiológico y pasar la mezcla a 5-10 gotas por minuto. Cuando los signos de la reacción desaparezcan, pasar el suero antiofídico restante en dos horas TIEMPO DE APLICACIÓN El tiempo transcurrido desde el accidente es de suma importancia, ya que como en todos los envenenamientos, la aplicación oportuna de los antídotos es mucho más eficaz y evita que se presenten complicaciones; así por ejemplo, un accidente severo tratado adecuadamente en los primeros minutos, tendrá una evolución favorable y sin mayores complicaciones, pero un accidente leve o moderado, atendido muchas horas después de ocurrido, necesariamente presentará complicaciones propias de los daños causados por la acción del veneno. La cantidad de suero antiofídico que debe aplicarse, depende de la cantidad del veneno inoculado en la mordedura. No se recomienda la práctica rutinaria de pruebas de sensibilidad previa a la aplicación del suero antiofídico, porque no predicen la posibilidad de reacciones de hipersensibilidad y si pueden por el contrario, retardar el inicio de la terapia específica, que en los casos de envenenamiento grave es de suma urgencia. En el momento de aplicar el suero, hay que tomar las medidas pertinentes y estar preparado para tratar una reacción de anafilaxia, así no haya el antecedente de hipersensibilidad a sueros heterólogos. De existir el antecedente de hipersensibilidad al suero, se debe analizar el factor riesgobeneficio de la aplicación del suero antiofídico según la gravedad del accidente. 6CHARRY, R Centro de Investigación y Asesoría Ofidiológica. Manizales Colombia. 7

17 El suero antiofídico se aplica por vía intravenosa disuelto en 100 ml Solución Salina o Dextrosa en agua al 5%, iniciando a 15 ml/hora en los primeros 10 minutos, y si no se presentan reacciones de hipersensibilidad, se aumenta el goteo para pasar la totalidad del suero en un lapso no mayor de 20 minutos. En cuanto a la dosis no existe un esquema terapéutico estandarizado. La cantidad de antiveneno a utilizar dependerá de la capacidad de neutralización del suero antiofídico y de la cantidad de veneno inoculado por la serpiente causante del accidente. Las serpientes del género Bothrops del Ecuador inoculan en promedio 100 a 150 mg. de veneno, por lo tanto la cantidad de antiveneno administrada en las primeras 24 horas debe ser la necesaria para neutralizar esa cantidad de veneno. En caso de serpientes del género Lachesis que inoculan grandes cantidades de veneno, las dosis de suero antiofídico administradas deben ser mayores. Es importante que se revise la literatura proporcionada por el fabricante del antiveneno respecto a la capacidad de neutralización y al tipo de especies para las que es efectivo. En casos de pacientes pediátricos, la dosis de antiveneno debe ser igual a la de un adulto, en razón de que ellos reciben mayor cantidad de veneno de acuerdo a su peso corporal REACCIONES Todos los antivenenos producen reacciones adversas. Estas reacciones fueron clasificadas por la Organización Mundial de la Salud como reacciones tardías y reacciones tempranas, las cuales a su vez pueden ser de dos tipos: reacciones tempranas anafilácticas y reacciones tempranas anafilactoides. Reacciones tardías (hipersensibilidad tipo III): Las reacciones tardías corresponden al cuadro clínico conocido como enfermedad del suero, una hipersensibilidad tipo III que ocurre de 7 a 15 días después de la administración del antiveneno. En estas reacciones, el organismo del paciente reconoce a las proteínas 7CHARRY RESTREPO, H Restrepo

18 heterólogas como extrañas y produce una respuesta de anticuerpos en su contra. En la fase inicial de esta respuesta hay un exceso de antígeno, por lo que se forman complejos inmunes pequeños y solubles, que difunden y se depositan en lugares como las membranas sinoviales y las membranas basales de glomérulo y de endotelio. 8 Reacciones anafilácticas (hipersensibilidad tipo I): Las reacciones anafilácticas o de hipersensibilidad tipo I ocurren en pacientes que han sido tratados con antivenenos en ocasiones previas y que, como parte de su respuesta inmunológica contra las proteínas del antiveneno, producen anticuerpos de la clase IgE. Estos anticuerpos se unen a receptores presentes en mastocitos y basófilos, de modo que en una posterior exposición al antiveneno, las células sensibilizadas se desgranulan y liberan diversos mediadores vasoactivos entre los que destaca la histamina, favoreciendo la vasodilatación y el aumento de la permeabilidad vascular. El resultado final puede ser urticaria, hipotensión, choque, espasmos en músculo liso, broncoconstricción, obstrucción respiratoria, colapso respiratorio y muerte. Reacciones anafilactoides: Son las que se observan con más frecuencia durante la administración de antivenenos. Para que estas ocurran, a diferencia de las reacciones anafilácticas, no se requiere exposición previa al producto. Aunque las causas por las cuales ocurren este tipo de reacciones no son del todo comprendidas, su inducción se ha relacionado con la actividad anticomplementaria de los antivenenos y la presencia de anticuerpos en el antiveneno contra antígenos celulares del paciente y anticuerpos del paciente contra las proteínas constituyentes del antiveneno CADUCIDAD La fecha de expiración está indicada en la etiqueta del frasco, pasado ese tiempo y de haberse mantenido la cadena de frío, el suero puede utilizarse hasta por un año después, debiendo en estos casos utilizarse el doble de la dosis recomendada. 8ELIZONDO J Trabajo de Graduación. Facultad de Microbiología. Universidad de Microbiología. Universidad de Costa Rica 9

19 En caso de que el contenido del frasco se torne opaco o exista precipitación de proteínas es conveniente no utilizar el suero antiofídico, porque existe un alto riesgo de producir reacciones adversas alérgicas en el paciente. Si se rompe la cadena de frío por más de 24 horas, el suero pierde su efectividad PODER NEUTRALIZANTE DEL SUERO ANTIOFÍDICO Los anticuerpos presentes en el suero antiofídico tiene una acción neutralizante sobre los componentes del veneno, por esto el cálculo de la dosis a administrar debe ser de acuerdo a la capacidad neutralizante que se encuentra escrita en el inserto o indicaciones para su uso, en cada uno de ellos. Como la cantidad de veneno inoculado es similar en el niño o el adulto, la neutralización del mismo se hace sin consideración de dosis por edad o peso. A niños y adultos se aplica una dosis igual, calculada de acuerdo a la calificación de gravedad del accidente. En el accidente leve se deben neutralizar al menos 100 mg. de veneno. En el accidente moderado se deben neutralizar al menos 200 mg. En el grave se deben neutralizar no menos de 300 mg. Los sueros monovalentes contienen anticuerpos contra el veneno bothrópico. Se recuerda que este accidente representa el 95% de los casos. Los sueros polivalentes pueden ser para accidente bothrópico y crotálico o contener además anticuerpos contra el veneno lachésico. La capacidad neutralizante, como ya se expresó, es la que determina el número de ampollas a utilizar. Es responsabilidad del MSP del Ecuador, conocer con anterioridad el tipo y capacidad de neutralización del suero antiofídico del que dispone en su país y lugar de trabajo. Se han efectuado una serie de estudios de carácter experimental tendientes a conocer la capacidad del suero polivalente para neutralizar varios efectos y 9LOMONTE, B Edema-forming activity of bushmaster Lachesis muta stenophrys) and Central American rattesnake (Crotalus durissus durissus) venoms and neutralization by a polyvalent antivenom.toxicon. 10

20 actividades farmacológicas de los venenos. Inicialmente se demostró que este suero era eficaz en la neutralización del efecto letal inducido por los venenos de serpientes de la familia Viripidae. Sin embargo, estos venenos inducen a una serie compleja de efectos fisiopatológicos, entre los que destacan un severo cuadro de alteraciones locales (mionecrosis, hemorragia y edema), los cuales se desencadenan pocos minutos después de la mordedura. Posteriormente, aparecen los efectos sistémicos, entre los que se destacan la hemorragia, la desfibrinación y otras alteraciones de la coagulación, el choque cardiovascular y la insuficiencia renal. Estos efectos son causados por diversos tipos de toxinas, que tienen propiedades químicas y farmacológicas muy distintas. La complejidad de este cuadro hace que sea insuficiente evaluar la capacidad neutralizante de un suero únicamente con base en la neutralización del efecto letal. La Organización Mundial de la Salud recomienda un enfoque más integral en el estudio de los sueros y su capacidad neutralizante. En el Instituto Clodomiro Picado se ha estudiado la capacidad neutralizante de los sueros mediante el uso de metodología que incluye dos tipos de experimentos. En el primer tipo, el suero se incuba con el veneno durante 30 minutos a 37ºC, antes de inocular la mezcla en animales de experimentación. El objetivo es determinar cuantitativamente la presencia de anticuerpos neutralizantes en el suero, sin tomar en cuenta la farmacocinética del veneno y, a diferentes intervalos de tiempo, se administra el suero. En este tipo de procedimiento sí se toma en cuenta la farmacocinética del veneno y del suero, así como la rapidez con que se desencadenan los efectos inducidos por el veneno NEUTRALIZACIÓN DE LOS EFECTOS SISTÉMICOS Neutralización del efecto letal: Tradicionalmente, esta neutralización se ha estudiado mediante experimentos con preincubación de suero y veneno. Se 10LÓPEZ, N.et al Características de los pacientes con accidente ofídico y complicaciones infecciosas atendidos en el Hospital Pablo Tobón Uribe entre los años 2000 y

21 hademostrado claramente que, en estas circunstancias, el suero polivalente es eficaz en la neutralización de los venenos de las especies de la familia Viperidae. Los estudios más recientes han permitido concluir que este suero es también eficaz en la neutralización del efecto letal de los venenos B. asper y B. nummifer de Honduras, de Agkistrodon bilineatus y Crotalus durissus de Guatemala, así como de B. atrox y B. pictus del Perú y de B. atrox de Colombia. Por otra parte, cuando los estudios de neutralización se efectúan mediante inoculación independiente de veneno y suero se observa, en el caso del veneno de Lachesis muta melanocephala, que aún administrando el suero con un retraso de varias horas, se logra una adecuada neutralización de la letalidad. Alteraciones en la coagulación: Los venenos de serpientes de la familia Vipiridae afectan el mecanismo de la coagulación sanguínea de varias maneras. La mayoría de estos venenos contienen enzimas tipo trombina, capaces de convertir el fibrinógeno en fibrina. Además algunos venenos contienen enzimas que activan el Factor X. En el organismo, estos venenos inducen un síndrome de desfibrinación, con disminución de los niveles de fibrinógeno, aparición de los productos de degradación de la fibrina y prolongación de los tiempos de coagulación y de protrombina. La determinación del tiempo de protrombina se ha venido utilizando como un índice para seguir el curso del envenenamiento. El suero antiofídico polivalente es eficaz para neutralizar los efectos coagulantes, fibrinolítico, fibrinogenolítico y desfibrinante de los venenos de estas serpientes. Por otra parte, y en contraste con las observaciones de la neutralización de efectos locales, el suero polivalente es eficiente en la neutralización de la actividad desfibrinante del veneno de B. asper, aun cuando se administre después del envenenamiento. Estos hallazgos concuerdan con observaciones clínicas efectuadas con observaciones clínicas efectuadas en varios hospitales de Costa Rica, en el sentido de que las alteraciones en el tiempo protrombina se corrigen luego de administrado el suero antiofídico GARCÍA J, et al

22 NEUTRALIZACIÓN DE LOS EFECTOS LOCALES (HEMORRAGIA, EDEMA Y MIONECROSIS) Hemorragia: Uno de los efectos que aparecen con mayor rapidez luego de inocular venenos de serpientes de la familia Viperidae es la hemorragia local. Este fenómeno se origina en la alteración drástica de la microvasculatura, especialmente capilares y vénulas, por la acción directa de ciertos componentes de los venenos. Estas «hemorrágicas» son proteínas de un peso molecular relativamente alto, muchas de las cuales tienen actividad colagenasa. El efecto hemorrágico de los venenos se cuantifica en el laboratorio mediante la técnica de Kondo et, basada en la inoculación intradérmica del veneno y la subsecuente medición del área hemorrágica en la piel. Porotra parte, Ownby et al. desarrollaron un método que cuantifica la hemoglobina presente en el tejido, asumiéndose que el efecto hemorrágico va a resultar en un aumento en la cantidad de hemoglobina presente en el tejido. Los estudios de Gutiérrez et al.handemostrado que el suero polivalente es eficaz para neutralizar este efecto en experimentos con preincubación de suero y veneno, incluso cuando el antiveneno se incuba con venenos que no son utilizados en la mezcla antigénica para producir el suero polivalente. Este fenómeno también ha sido observado con otros venenos y antivenenos en otras partes del mundo. Estos resultados señalan claramente que las toxinas hemorrágicas son muy antigénicas, capaces deinducir una respuesta elevada de anticuerposneutralizantes en los caballos y que las hemorraginas de venenos de diferentes especies presentan epitopos comunes. Sin embargo, cuando los experimentos se efectúan con inoculación independiente de suero y veneno, los resultados son diferentes. En estos experimentos, se observó una neutralización sólo parcial del efecto hemorrágico local cuando el suero se administró en los primeros minutos posteriores al Características bioquímicas y evaluación preclínica de un antivenenobotrópico liofilizado contra el veneno de la serpiente bothropsatrox. revperumedexp salud pública. 25(4). Pp

23 envenenamiento, en tanto que casi no hubo neutralización cuando la seroterapia se atrasó. La explicación de este fenómeno se basa en la rapidez con la que se desencadena la hemorragia local una vez que el veneno se ha inoculado intramuscularmente. En cuestión de minutos se observa extravasación, lo que obviamente dificulta la neutralización de este efecto por los anticuerpos del suero, los cuales probablemente llegan al tejido afectado cuando el veneno ha ejercido su efectovasculotóxico. Además, es factible que las alteraciones drásticas que produce el veneno en los vasos sanguíneos dificulten el acceso y distribución de los anticuerpos al área afectada. La explicación de esta situación aparentemente paradójica es clara: el suero tiene anticuerpos neutralizantes contra las toxinas hemorrágicas, pero la acción de éstas es tan rápida que se dificulta mucho la neutralización en circunstancias en donde el veneno y el suero se administran por separado. La necrosis muscular: Los venenos de serpientes de la familia Viperidae originan alteraciones muy drásticas en el tejido muscular. Estos venenos poseen «miotoxinas», es decir, proteínas que afectan directamente las células musculares. La mayoría de estas toxinas actúan directamente sobre la membrana plasmática de los miocitos. En el caso de los venenos de las serpientes costarricenses Bothrops asper y B. nummifer, se ha aislado varias miotoximas, las cuales inducen un cuadro patológico similar. Por otra parte, los venenos que inducen un efecto hemorrágico afectan también al tejido muscular al inducir isquemia, resultante de la disminución en la perfusión sanguínea que sobreviene como consecuencia de la destrucción de la microvasculatura. Tradicionalmente, el efecto miotóxico de los venenos se ha evaluado mediante histología. En años recientes, se ha introducido la determinación de los niveles séricos de la enzima creatina kinasa como un índice cuantitativo de la necrosis muscular inducida por venenos. Dada la especificidad que presenta esta 14

24 enzima para detectar alteraciones en tejidomuscular, ha sido de suma utilidad para el estudio del efecto miotóxico inducido por venenos y de la capacidad neutralizante de los sueros antiofídicos. En experimentos con preincubación, el suero polivalente es eficaz en la neutralización del efecto miotóxico inducido por los venenos de Bothrops asper y Lachesis muta, no ha sido investigada su capacidad neutralizante contra otros venenos. En el caso del veneno de B. asper, especie que produce accidentes caracterizados por una mionecrosis evidente con lesiones permanentes, se ha demostrado que el efecto miotóxico se debe a un grupo de cuatro miotoxinas con pesos moleculares de alrededor de daltons y composición de aminoácidos muy similar. Lomonte et al lograron aislar, mediante cromatografía de inmunoafinidad, anticuerpos antimiotoxina del suero polivalente, que neutralizan el efecto miotóxico del veneno de B. asper cuando se preincuban con este veneno antes de inocularse. Los resultados experimentales obtenidos indican, por lo tanto, que el suero polivante contiene anticuerpos eficaces en la neutralización del efecto miotóxíco del veneno de terciopelo. Sin embargo, cuando se efectúan experimentos con inoculación independiente de veneno y suero, la neutralización de la miotoxicidad es sólo parcial. Esto indica que, al igual que en el caso de la hemorragia, las miotoxinas tienen una acción tan rápida y drástica que dificulta muchísimo el éxito del tratamiento, si el antiveneno no se administra rápidamente. Recientemente, produjeron siete anticuerpos monoclonales contra las miotoxinas del veneno de B. asper, algunos de los cuales demostraron tener capacidad neutralizante. Ello plantea la posibilidad de utilizar la tecnología dehibridomas en el desarrollo de recursos terapéuticos inmunológicos más eficaces para neutralizar actividades tóxicas de los venenos. El efecto edematizante: Los venenos de serpientes de la familia Viperidae inducen un pronunciado edema local, pocos minutos después de la inoculación. Este 15

25 edema es causado, por un lado, por toxinas que afectan directamente la integridad de los vasos, originando un aumento en la permeabilidad. Pero además, los venenos inducen la liberación de varios autacoides, entre los que se destacan la histamina, las prostaglandinas y la bradikinina, aunque también el complemento podría desempeñar un papel de importancia. Experimentalmente, el edema se cuantifica mediante el aumento de peso de la pata de un ratón inoculada con veneno, comparándose con el peso de la otra pata, la cual se inyecta con solución salina Gutiérrez et al., efectuaron un estudio detallado sobre la capacidad del suero antiofídico polivalente para neutralizar el edema inducido por los venenos de serpientes costarricenses de la familia Viperidae. Los experimentos clásicos de preincubación de suero y veneno no fueron de utilidad, ya que se observó que las proteasas del veneno actuaban sobre proteínas presentes en el suero antiofídico, liberándose como consecuencia péptidos capaces de inducir edema. Se desarrolló entonces un método alterno que consiste en inyectar el suero por la vía intravenosa y, cinco minutos más tarde, administrar el veneno en la almohadilla plantar de los ratones, cuantificándose el edema posteriormentede la forma descrita. Medianteeficaz en la neutralización de la actividad edematígena de los venenos de Bothrops asper, B. schlegelii, B, lateralis, B. nummifer, Agkistrodon bilineatus y Lachesis muta, siendo ineficiente en la neutralización del edema inducido por la cascabel centroamericana Crotalus durissus durissus. Se ha propuesto que los venenos cuya actividad edematígena es mal neutralizada podrían contener toxinas de bajo peso molecular, incapaces de inducir formación de anticuerpos cuando los venenos son inoculados en caballos. Sin embargo, pese a que efectivamente existen componentes de bajo peso molecular capaces de inducir edema, la mayor parte del edema inducido por venenos costarricenses de la familia Viperidae es debido a toxinas de un peso molecular relativamente alto. Es importante profundizar en el estudio de este fenómeno, para obtener una mejor comprensión de las causas de esta deficiente neutralización. Cuando el estudio 16

26 de la neutralización del edema se ha efectuado mediante experimentos en los que el suero se administra a diferentes intervalos de tiempo posteriores al envenenamiento, los resultados han sido similares a los descritos para hemorragia y mionecrosis: la neutralización del efecto es sólo parcial, incluso cuando el suero se administra de inmediato. En síntesis, la neutralización de los efectos locales (hemorragia, mionecrosis y edema) inducidos por los venenos de serpientes de la familia Viperidae plantea un problema de difícil solución. Los hallazgos expuestos señalan claramente que el suero polivalente tiene anticuerpos que neutralizan estos efectos, con la excepción del edema inducido por el veneno de cascabel. Ello indica que la gran mayoría de las toxinas hemorrágicas, miotóxicas y edematizantes son inmunogénicas y que los caballos inmunizados desarrollan un buen título de anticuerpos contra ellas. Sin embargo, estos efectos se desarrollan con una rapidez tal, una vez inoculado el veneno, que cuando la administración del suero se efectúa a posteriori, como ocurre en condiciones naturales, la neutralización de estos efectos patológicos es sólo parcial. Esto se debe, posiblemente, a que cuando los anticuerpos neutralizantes llegan al tejido afectado, ya se ha producido buena parte de la destrucción tisular y de las alteraciones vasculares. Como explicación alternativa, podría ser que la drástica destrucción de la vasculatura por el veneno dificulte el acceso de los anticuerpos a los sitios afectados. Esto indica que la rapidez con la que se inicie la seroterapia es un factor fundamental en la neutralización de los efectos locales y en la disminución de las posibles secuelas de estos efectos. Por otra parte, nuestros hallazgos experimentales han confirmado algo que se había observado en la experiencia clínica: la administración del sueropor la vía intravenosa es mucho más eficaz que por la vía intramuscular para la neutralización de la mionecrosis, hemorragia y edema. Por ende, no se justifica administrar el suero intramuscularmente, bajo condiciones de hospitalización GUTIERREZ. J. et. al., 2009.El Suero Antiofídico Polivalente producido en Costa Rica. Instituto Clodomiro Picado. Facultad de Microbiología. Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica. 17

27 NEUTRALIZACIÓN DE LAS ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS DE LOS VENENOS En el laboratorio del Instituto de Higiene Leopoldo Izquieta Pérez, se ha estudiado también la capacidad del suero polivalente para neutralizar algunas actividades enzimáticas de los venenos de serpientes. Las observaciones efectuadas indican que el suero contiene anticuerpos que neutralizan los efectos proteolítico (sobre diversos sustratos como caseína, fibrinógeno y fibrina), hialurodinasa y fosfolipasa. En el caso de la neutralización de la actividad fosfolipasa demostraron que el suero es más eficaz contra ciertas isoenzimas que contra otras. Aunque la neutralización de las actividades enzimáticas no necesariamente se relaciona con actividades fisiopatológicas, su estudio permite una mejor comprensión de la capacidad neutralizante de los sueros. Por otra parte, se ha propuesto que la actividad hialuronidasa de los venenos juega in vivo el papel de factor de difusión degradando glicosaminoglicanes del tejido conectivo y facilitando la difusión del veneno. Por ello, el estudio de su neutralización es importante UNIFORMIDAD Y ESTABILIDAD DEL SUERO ANTIOFÍDICO La concentración del suero antiofídico se modifica, antes del envasado final, de tal manera que tenga una capacidad neutralizante, o Dosis Efectiva 50% de 3 mg de veneno de Bothrops asper neutralizados por cada ml de suero; lo anterior se hace GENÉ, J.A., GÓMEZ, M., Gutiérrez, J.M., Cerdas, L. Neutralization of polyvalent antivenom. Toxicon 1985; 23: GENÉ, J.A., GÓMEZ, M., Cerdas, L. Estudio sobre la estabilidad de la actividad neutralizante del suero antiofídico contra veneno de terciopelo (Bothrops asper). Rev. Cost, Cienc. Méd. 1986; 7: GUTIÉRREZ, J.M., ROJAS, G., CERDAS, L. Ability of polyvalent antivenom to neutralize the venom of Lachesis muta melanocephala, a new Costa Rican subspecies of the bushmaster.toxicon. 1987; 25:

28 para que los diferentes lotes tengan una potencia neutralizante similar, y así uniformar los protocolos de tratamiento. Dado que esta uniformidad se basa únicamente en la neutralización del efecto letal, y dado que los venenos serpientes producen otros efectos farmacológicos relevantes, se estudió en cinco lotes diferentes de suero polivalente cuan uniformes son en cuanto a la neutralización de los efectos hemorrágicos, proteolíticos y desfibrinante. Los resultados obtenidos permiten concluir que el ámbito de variación en la capacidad neutralizante de varios lotes es pequeño y que el suero es un producto bastante uniforme en su potencial terapéutico. Por otra parte, ya desde los años 60 se estableció que el suero polivalente líquido tiene un plazo de vencimiento de 3 años, en tanto que el suero liofilizado tiene un plazo de 5 años. En lo referente al suero líquido, corroboraron el plazo de 3 años, demostrando incluso que la capacidad neutralizante del suero se prolonga durante varios meses posteriores a la fecha de vencimiento, siempre y cuando el producto se almacene a 4ºC. Más recientemente, Rojas et al 1987., estudiaron la estabilidad de este suero a diferentes temperaturas (4, 23, 30 y 37ºC) durante un año, encontrando que aún a 37ºC el suero no pierde capacidad neutralizante al cabo de un año de almacenamiento. No obstante, estos autores observaron la aparición de turbidez en los sueros almacenados a temperaturas de 23ºC, 30 ºC y 37 ºC. Esta turbidez se debió a la formación de agregados de proteínas, tanto de IgG como de otras proteínas séricas. En conclusión, es recomendable mantener el suero líquido a temperaturas de refrigeración

29 III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. LOCALIZACIÓN DEL ENSAYO: La presente investigación se realizo en el serpentario de los laboratorios de salud animal del Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical Leopoldo Izquieta Pérez. Dirección: Av. De las Américas y Juan Tanca Marengo Parroquia: Tarqui Cantón: Guayaquil Provincia: Guayas Republica: Ecuador -Sur-América COORDENADAS: Latitud Sur 02º, 16, 05ˮ. Longitud Oeste 79º, 54, 06ˮ 3.2. CONDICIONES METEOROLÓGICAS - Altura promedio: 4 m.s.n.m. - Precipitación pluvial: mm / ano - Características meteorológicas: - Humedad atmosférica: 75% - Temperatura máxima absoluta: 36 ºC - Temperatura media anual: 25 ºC - Temperatura mínima absoluta: 18 ºC - Evaporación: mm / mes. Fuente: INOCAR 20

30 3.3. MATERIALES MATERIALES BIOLÓGICOS Lotes de sueros antiofídicos antibothrópico de más de un año de almacenamiento. Lotes de venenos de serpientes bothrops conservados en el serpentario. Ratones albinos adultos de entre 17 y 18 gramos de peso MATERIALES DE LABORATORIO Jeringas de 1,3,5 ml., con agujas No. 22 y 24 Tubos de ensayo de 10 x 20 con tapa rosca. Gradillas Pipetas de 1,2,3, 5, 10 ml. Portafiltro de Nalgene de 25 mml de diámetro Prefiltro de vidrio Pipetero de caucho Espátula Solución salina de 0,85% Algodón Alcohol Guantes, mascarillas, estetoscopio, termómetros, tijeras, bisturí rasuradoras EQUIPO GENERAL Y COMPLEMENTARIO: Cajas para ratones Balanceado para ratones Bebederos para ratones Rejillas para caja de ratones Aserrín o viruta Agua Baño María Tapones de caucho Balanza de precisión de 160g. De 3 decimales. Balanza gramera electrónica 21

31 MATERIALES DE OFICINA Marcador permanente Plumas, lápices, Cinta adhesiva Cuaderno, borrador, cartillas de observación Computadoras Impresoras 3.4. MÉTODOS En esta investigación se utilizaron 24 lotes de sueros antiofídicos Bothrópicos de las especies B. asper, B. atrox y B. xanthogramma con más de un año de almacenamiento, ratones albinos de 3 a 4 semanas de edad. El efecto neutralizante de los sueros se determinó mediante la prueba de neutralización (suero-veneno) en ratones RECOLECCIÓN DEL SUERO ANTIOFÍDICO Se obtuvo de lotes de sueros antiofídicos de más de un año de almacenamiento, los cuales se encuentran a temperatura de refrigeración a 4ºC en el serpentario del Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical Leopoldo Izquieta Pérez PESAJE DE LOS RATONES Los ratones se pesaron en una balanza gramera, registrando un peso de 17-18g, se los colocó en una caja plástica con sus respectivos bebederos y alimento INCUBACIÓN E INOCULACIÓN DE SUERO Y VENENO 1. El suero y el veneno se incubaron a una temperatura de 37ºC, durante 30 minutos. 2. Una vez realizadas las diluciones de la diferentes concentraciones que contengan 4 Dl 50 (250 mg.) de veneno bothrópico. Se procedió a inocular a cada ratón con 0,5 ml por vía intraperitoneal. 22

32 3. Los ratones se colocaron con suficiente agua y comida en sus cajas debidamente identificadas. 4. Los ratones experimentales fueron observados por 24, 48,y 78 h, anotando los muertos durante ese periodo. 5. Finalmente se calculó la potencia neutralizante de los sueros en base al porcentaje de próbito y porcentaje de mortalidad POTENCIA NEUTRALIZANTE Para la determinación de la potencia neutralizante, se estableció en primera instancia la dosis alcanzada en referencia al número de ratones vivos y la cantidad de suero inoculado. Cada lote de suero antiofídico polivalente, debía tener dosis mínima de 2,5 mg/ml en cada especie, para su aprobación o descarte como suero efectivo RECOLECCIÓN DE DATOS Se recogen en cartillas de apuntes y las tablas respectivas, que básicamente refieren a la determinación de la potencia neutralizante, dosis aplicada, síntomas y signos clínicos ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los métodos de comprobación y presentación se refieren básicamente al estadístico en la representación de gráficos, tablas y curvas.para el análisis estadístico de los resultados obtenidos, se determinó la desviación estándar de los lotes de sueros antiofídicos analizados, bajo la siguiente fórmula: 23

33 IV. RESULTADOS 4.1. POTENCIA NEUTRALIZANTE En los 24 lotes de sueros Bothrópicos antiofídicos analizados; de más de un año de almacenamiento; se verificó la eficacia de la potencia neutralizante, obteniendo como resultado el 67% de efectividad en los mismos, mientras que el 33% se reportan como no válidos o no aprobados para su administración. (Figura 1). El cuadro muestra los valores correspondientes para la potencia neutralizante de los sueros antiofídicos de la especie Bothrops. CUADRO 1. POTENCIA NEUTRALIZANTE DE LOS SUEROS ANTIOFÍDICOS DEL GÉNERO Bothrops DE MÁS DE UN AÑO DE ALMACENAMIENTO LOTES ENCONTRADOS (n) PORCENTAJE (%) APROBADOS 16 67% NO APROBADOS 8 33% TOTAL % FIGURA 1. POTENCIA NEUTRALIZANTE DE LOS SUEROS ANTIOFÍDICOS DEL GÉNERO Bothrops DE MÁS DE UN AÑO DE ALMACENAMIENTO 24

34 POTENCIA NEUTRALIZANTE DE SUEROS ANTIOFÍDICO DEL GÉNERO BOTRHOPS POR ESPECIE En los sueros antiofídicos de las tres especies analizadas, se encontró que B. asper posee un 67% de lotes aptos, B. atrox con el 50% y B. xanthograma con el 58% de sueros eficaces para su administración (Figura 2). El cuadro muestra la potencia neutralizante de sueros antiofídicos del Género Bothrops de más de un año de almacenamiento por especie. CUADRO 2. POTENCIA NEUTRALIZANTE DE LOS SUEROS ANTIOFÍDICOS DEL GÉNERO Bothrops DE MÁS DE UN AÑO DE ALMACENAMIENTO POR ESPECIE Especie Aprobados % Aprobados Reprobados % No aprobados B. asper 16 67% 8 33% B. atrox 12 50% 12 50% B. xanthograma 14 58% 10 42% Total 42 58,3% 30 41,7% FIGURA 2. POTENCIA NEUTRALIZANTE DE LOS SUEROS ANTIOFÍDICOS DEL GÉNERO Bothrops DE MÁS DE UN AÑO DE ALMACENAMIENTO POR ESPECIE 25

35 POTENCIA NEUTRALIZANTE DE SUEROS ANTIOFÍDICO DEL GÉNERO BOTHROPS POR AÑO DE ALMACENAMIENTO En los dos años de almacenamiento (2009 y 2010) de los sueros antiofídicos analizados, se encontró valores idénticos para ambos periodos, dando como resultado un 67% de lotes aprobados y un 33% como no aprobados para su utilización (Figura 3). El cuadro 3 muestra las cifras correspondientes a la potencia neutralizante de sueros antiofídicos del género Botrhops por año de almacenamiento. CUADRO 3. POTENCIA NEUTRALIZANTE DE LOS SUEROS ANTIOFÍDICOS DEL GÉNERO Bothrops POR AÑO DE ALMACENAMIENTO AÑO APROBADOS % APROBADOS REPROBADOS % REPROBADOS % 4 33% % 4 33% Total 16 67% 8 33% FIGURA 3. POTENCIA NEUTRALIZANTE DE LOS SUEROS ANTIOFÍDICOS DEL GÉNERO Bothrops DE MÁS DE UN AÑO DE ALMACENAMIENTO POR ESPECIE 26

36 DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE LA POTENCIA NEUTRALIZANTE DE SUEROS ANTIOFÍDICOS DEL GÉNERO Bothrops Según el periodo de almacenamiento de 2 años de los lotes de sueros antiofídicos bothrópicos, se encontró una desviación estándar global de ± 0,50 mg/ml (Figura 4), para la potencia neutralizante de los mismos. De acuerdo a la especie la desviación estándar para el B. asperes de ± 0,46 mg/ml, para el B. atrox ± 0,50 mg/ml, y para B xanthograma es de ± 0,55 mg/ml. (Figura 4). El cuadro 4 muestra los valores correspondientes a la desviación estándar en la potencia neutralizante por especie de en los suero antiofídicos de más de una año de almacenamiento. CUADRO 4. DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE LA POTENCIA NEUTRALIZANTE DE LOS SUEROS ANTIOFÍDICOS DEL GÉNERO Bothrops Especies N de lotes Media Desviación Estándar B. asper 24 2,45mg/ml ± 0,46mg/ml B. atrox 24 2,3 mg/ml ± 0,50mg/ml B. xanthogramma 24 2,5mg/ml ± 0,55mg/ml Global 2,48 mg/ml ± 0,50mg/ml FIGURA 4. DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE LA POTENCIA NEUTRALIZANTE DE LOS SUEROS ANTIOFÍDICOS DEL GÉNERO Bothrops 27

37 DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE LA POTENCIA NEUTRALIZANTE DE SUEROS ANTIOFÍDICOS DEL GÉNERO BOTHROPS DE ACUERDO A LOS AÑOS DE ALMACENAMIENTO Las fluctuaciones de acuerdo a los años de almacenamiento presentan variaciones similares entre las tres especies bothrópicas bajo estudio. Así se reporta que para el B. aspery B. atrox presentan una desviación a los 2 años de ±0,6 mg/ml; y al año ±0,4 mg/ml. A diferencia de B. xanthogramma que presenta una desviación estándar a los 2 años de almacenamiento de ±0,7 mg/ml. (Figura 5). El cuadro 5 muestra los valores correspondientes a la desviación estándar de la potencia neutralizante de sueros antiofídicos bothrops por años de almacenamiento. CUADRO 5. DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE LA POTENCIA NEUTRALIZANTE DE LOS SUEROS ANTIOFÍDICOS Bothrops POR AÑOS DE ALMACENAMIENTO Años de almacenamiento B. asper B. atrox B. xanthogramma 2 años ±0,6 ±0,6 ±0,7 1 año ±0,4 ±0,4 ±0,4 Global ±0,5 ±0,5 ±0,55 FIGURA 5. DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE LA POTENCIA NEUTRALIZANTE DE LOS SUEROS ANTIOFÍDICOS Bothrops POR AÑOS DE ALMACENAMIENTO 28

38 V. DISCUSIÓN El 67% de los lotes de sueros Antibothrópicos analizados fueron aprobados como efectivos para su aplicación en casos de mordeduras de serpientes, resultado que respalda lo enunciado por la revista médica electrónica venezolana (SERPIENTES DE VENEZUELA, 2012), donde se especifica que los sueros antiofídicos pueden ser utilizados aún con fecha de vencimiento, y en tales casos, se usarán dosis mayores. Por otra parte Gutiérrez, J. 2009en su publicación El Suero Antiofídico Polivalente producido en Costa Rica manifiesta que desde los años 60 se estableció que los sueros antiofídicos polivalentes líquidos tienes un plazo de vencimiento de 3 años, demostrando incluso que la capacidad neutralizante del suero se prolonga durante varios meses posteriores a la fecha de vencimiento, siempre y cuando el producto se almacene a 4 ºC. Para la potencia neutralizante de los sueros bothrópicos por especie, se demuestra que B. asper posee un porcentaje levemente superior de lotes efectivos frente a las otras especies bajo estudio, análisis que concuerda por lo manifestado por Elizondo J, 1987 en su investigación de Tesis Sueros antiofídicos Polivalente de Costa Rica, donde los resultados obtenidos permiten concluir que el ámbito de variación en la capacidad neutralizante de varios lotes es pequeño y que el suero es un producto bastante uniforme en su potencial terapéutico. Charry R. 2006, en su artículo Aspectos biomédicos del Accidente Bothrópico propone que las variaciones en la composición de los anti-venenos están fuertemente ligadas a factores geográficos y climáticos además de los específicos, y por este motivo concluye que los sueros antiofídicos de una determinada región serán ineficaces frente al veneno de serpientes extranjeras. En la evaluación de la potencia neutralizante de los sueros antibothrópicos por años de almacenamiento se demuestra que existen valores idénticos tanto para los lotes del 2009 como para los del 2010, donde el 67% se registran como aprobados y el 33% como no aprobados para su utilización, esto podría explicarse dado que la desviación estándar anual y bianual corresponde a un promedio de ±0,5 mg/ml, siendo la tendencia decreciente a menor número de años, donde se reporta una 29