Por qué hacer estudios genómicos en mirtáceas nativas en Uruguay? Dos ejemplos. Marianella Quezada Clara Pritsch

Transcripción

1 Por qué hacer estudios genómicos en mirtáceas nativas en Uruguay? Dos ejemplos. Marianella Quezada Clara Pritsch Jornada Técnica en Biotecnología Forestal INIA Tacuarembó 2012

2 Genómica Se enfoca al estudio de la información codificada en el ADN de un individuo Algunas preguntas que estudia la Genómica Cuáles son las diferencias y semejanzas en el ADN entre individuos de diferentes especies, poblaciones, tipos de plantas? Cómo está organizado físicamente (estructura) el genoma de una especie? Cuáles regiones en el ADN contienen los genes responsables de la expresión de una característica agronómica productiva en particular como : sabor de fruta, largo de ciclo etc? Cuáles son los individuos portadores de información genética mas favorable? La genómica de las mirtáceas está en gran desarrollo

3 Distribución de la familia Myrtaceae Adaptado de Heywood 1996

4 Organización de las mirtáceas en tribus Grattapaglia, 2012 Mirtáceas nativas (33) Mirtáceas exóticas Guayabo E. grandis E. globulus Pitanga Arazá

5 Importancia económica Fuente madera o fibra Aceites Eucalyptus grandis Melaleuca alternifolia Producción de fruta fresca Especies Psidium guava Pimenta dioica La importancia económica de esta familia ha incentivado la realización de estudios genómicos pero con nivel de desarrollo variable.

6 Estudios genómicos Como todo proceso generador de conocimiento los énfasis en los estudios genómicos se balancean entre: EXPLORACION VS. EXPLOTACION Eucalyptus género pilar en la exploración del genoma: Desarrollo del primer mapa de ligamiento para una especie leñosa. Actualmente mapas altamente saturados Publicación del primer genoma de referencia completamente anotado (E. grandis, BRASUZ1) (2012) Identificación de genes asociados a caracteres de interés: crecimiento y propiedades de la madera, resistencias a estrés biótico y abiótico

7 Exploración de la información genómica en Eucalyptus Genómica estructural Tamaño del genoma Número de genes Variantes alélicas Conocimiento Familia de secuencias repetidas Organización de la información genética Localización de genes y QTLs asociados a caracteres de interés (formación de madera, estrés biótico y abiótico, propagación vegetativa) Herramientas Mapas genéticos Mapas físicos Mapas funcionales Bibliotecas genómicas Microarreglos (DArT, SFPs) Borrador del genoma ensamblado de E. grandis Genómica funcional Catalogo y perfil de expresión de genes vinculados a: estrés por frío, formación de madera, resistencia a enfermedades, metabolismo secundario Identificación de genes candidatos Base de datos de EST Validación de la función propuesta del gen candidato:

8 Explotación de la información genómica en Eucalyptus Manejo de poblaciones Diversidad genética, prueba de paternidad, estimación de heterocigosis, identificación de clones Selección asistida por marcadores Con dificultades de implementación en familias poco relacionadas Selección genómica Resultados preliminares prometedores Tecnología transgénica Tolerancia a helada

9 Ejemplo: explotación de la información genómica Grattapaglia, 2004

10 Situación de los estudios genómicos en otras mirtáceas

11 Tamaño del genoma en mirtáceas Adaptado de Grattapaglia E. grandis E. globulus Guayabo del país (Acca sellowiana) Guayabo brasilero (Psidium guajava) Arazá (Psidium cattleianum) Contenido 1C de ADN (pg) Eucalyptus grandis Eucalyptus grandis Eucalyptus globulus Eucalyptus globulus Eucalyptus urophylla Eucalyptus urophylla E. camaldulensis Corymbia citriodora Eugebnia uniflora Myrciaria glazioviana Acca sellowiana Accara elegans Calyptranthes brasiliensis Gomidesia affins Campomanesia adamantium Pimenta idoica Psidium guajava Psidium guajava P. acutangulum. P cattleianum Eucalypteae Myrteae

12 Guayabo del país (Acca sellowiana) Buena producción de fruta Fruto con propiedades nutracéuticas Vitamina C, Iodo Rico en bioactivos con propiedades biomédicas (Bontempo et al., 2007) antimicrobiana anti-oxidante anti-inflamatoria anti-cancerígena inmunoestimulante Integrante de la comunidad de especies que comparte microorganismos beneficiosos y patógenos con Eucalyptus

13 Integración al sistema productivo DESARROLLO TECNOLÓGICO Cultivares Sistemas de producción Sistemas de propagación Manejo de post-cosecha Marketing

14 en Uruguay Especie prioritaria en el Programa de Selección de Frutas Nativas (FA-UdelaR, INIA, Dirección Forestal-MGAP) Prospección e Instalación de materiales en la EFFAS para evaluación de caracteres agronómicos Selección de genotipos destacados por calidad de fruta (tamaño, sabor, productividad) Realización de cruzamientos dirigidos entre padres seleccionados, con el fin de identificar genotipos recombinantes superiores Liberación de cultivares adaptados a nuestras condiciones locales Diferentes estrategias de análisis genómico como apoyo al mejoramiento genético

15 Algunas características de A. sellowiana que facilitan los análisis genéticos Se cuenta con material, de buen adaptación, genéticamente elite diverso Diploide Numero cromosómico conocido 2n = 22 Genoma pequeño Especie alógama, con facilidad para realizar cruzamientos Gran producción de semillas por frutos Corto período juvenil Optimización de metodologías de propagación vegetativa Mapas genéticos disponibles en especies emparentadas (Eucalyptus spp, Psidium guajava,)

16 Un nuevo desafío: Profundizar en la exploración del genoma de A. sellowiana Proyecto Hacia la caracterización de la estructura del genoma de Acca sellowiana: abordajes genéticos, citológicos y moleculares ( )

17 Que hemos aprendido estudiando el ADN de las diferentes colecciones de guayabo del país? CUATRO POBLACIONES (PLANTAS SILVESTRES) ALTA DIFERENCIACION GENETICA ENTRE POBLACIONES (Baccino, 2011) JARDIN DE INTRODUCCION- EEFAS (PLANTAS SELECCIONADAS) AMPLIA (Y NOVEDOSA) DIVERSIDAD GENETICA ENTRE PLANTAS DE ALTO VALOR AGRONOMICO (Quezada, 2008)

18 Tamaño del genoma (contenido de ADN en pg) 1. Confirmar el tamaño del genoma del guayabo (contenido total del ADN) con ejemplares de Uruguay Metodología: citometría de flujo Contenido 1C de ADN (pg) 0,37 pg El genoma de A. sellowiana es pequeño. 1C = 0,37pg Es tres veces menor que el genoma de Eucalyptus

19 Número de cromosomas 2. Determinar si existe variación en el número de cromosomas presentes en el genoma dentro de la especie 3. Caracterizar los cromosomas de acuerdo a su morfología y distribución de secuencias de ADN eucromáticas y heterocromáticas Se confirmó el número cromosómico esperado de 2n = 22. Todos los cromosomas son metacéntricos con un largo entre 0.74 μm y 2.46 μm. El par cromosómico 4 se distingue por presentar una región satelital Foto: C. Mazzella

20 Identificación de sitios específicos en el genoma de A. sellowiana 4. Identificar secuencias de ADN reconocibles, como señalizadores de sitios específicos en el genoma (marcadores moleculares). Utilizando diferentes técnicas de análisis de ADN se detectaron en total 299 marcadores moleculares (cada marcador señala un sitio en el genoma).

21 Construcción de mapa genético 5. Identificar en el genoma la localización de dichos marcadores y generar un mapa genético que describa dicha información Cruzamiento biparental entre padres contrastantes en caracteres morfológicos y productivos, que mostraron polimorfismo en los 299 marcadores seleccionados. Progenitores heterocigotos, Programa de mejoramiento genético Cruzamiento dirigido oct-2008 Población F1 de 160 individuos sembrados a campo mayo-2009 X TCO BR

22 Población de mapeo Característica TCO BR Origen Silvestre Huerta comercial Tamaño de fruta Pequeña Grande Color cáscara Amarilla brillante Verde oscura Grosor cáscara Muy fina Gruesa Sabor Muy bueno Sin sabor Pulpa Fundente No fundente Desarrollo Bueno Bueno Productividad Muy bueno Muy bueno F1 (Salto, EEFAS) Beatriz Vignale

23 Ordenamiento de las regiones genómicas definidas por los marcadores moleculares definiendo un mapa genético (pseudo test cross, OneMap) Características Mapa Integrado TCO x BR Número de marcadores mapeados 224 Grupos de ligamiento 38 Largo total del mapa (cm) 2927,9 Largo del grupo mayor (cm) 448,1 Largo del grupo menor (cm) 6,4 Largo promedio de grupos 77,1 Distancia promedio entre marcadores (cm) 16, 0 Densidad de marcadores (cm/numero marcadores) 13,1

24 Mapa integrado E_AAC/M_CTC_291.88_D AG8TA_14_C E_AAT/M_CAG_86.27_C E_AAT/M_CAG_122.38_C E_AAT/M_CAG_55.39_C E_AAT/M_CCG_147.9_D E_ACG/M_CAC_106.63_C E_AAC/M_CTC_83.31_C E_AAC/M_CTA_100.79_C E_AAT/M_CAG_258.9_C E_AAC/M_CTA_101.95_D E_AAT/M_CAC_307.87_C E_ATG/M_CAG_280.68_C E_ATG/M_CAG_356.11_C E_ATG/M_CAG_299.63_D E_ATG/M_CAG_190.54_C E_ATG/M_CAG_116.34_D E_AAT/M_CAC_237.24_C E_AAT/M_CTC_77.5_C E_AAT/M_CAC_283.11_C E_AAC/M_CTC_181.28_C E_ATG/M_CAG_169.32_C E_ACG/M_CTA_205.05_D E_ACG/M_CTA_201.17_D E_ACG/M_CTA_68.09_D E_AAC/M_CGA_294.01_D E_AAT/M_CGA_230.63_D E_ACG/M_CCG_101.85_D E_ACG/M_CCG_72.68_D1.13 E_AAT/M_CAC_238.03_D E_AAT/M_CAC_236.02_D AG8TA_03_D CT8AG_08_C8 0.0 CT8AG_01_D E_ACA/M_CAC_395.28_C E_AAT/M_CTA_213.19_C E_AAT/M_CTA_162.0_C E_AAC/M_CGA_290.38_C E_AAC/M_CGA_403.59_C E_ATG/M_CCG_124.7_D E_AAC/M_CGA_360.54_C E_AAT/M_CCG_296.43_C E_ACG/M_CCG_81.08_C E_ACG/M_CGA_129.97_C E_ACA/M_CAA_130.48_C E_ACA/M_CAC_269.64_C E_ACG/M_CCG_441.32_C E_AAC/M_CGA_243.7_D E_AAC/M_CGA_322.81_C E_ACA/M_CAA_155.07_C E_AAC/M_CAA_368.76_C E_ATG/M_CTT_195.66_C E_AAC/M_CGA_312.98_D E_AAT/M_CAG_72.8_C E_ATG/M_CCG_85.23_C E_ATG/M_CTT_164.44_C E_AAC/M_CGA_173.58_C E_AAT/M_CCG_187.61_D E_ACA/M_CAA_86.96_C E_AAC/M_CTA_77.25_C E_AAT/M_CCG_88.3_C E_ATG/M_CTT_324.73_D E_ACG/M_CTC_56.6_C E_ACG/M_CTC_59.12_C E_AAT/M_CGA_89.6_C8 0.0 E_AAT/M_CGA_80.96_C E_ACG/M_CTC_72.64_C E_ATG/M_CAC_175.47_C E_ATG/M_CAC_328.23_C E_ATG/M_CAC_128.69_C E_ATG/M_CAC_130.95_D1.13 E_ATG/M_CAC_206.14_C E_ATG/M_CAC_235.89_C E_ATG/M_CAC_133.14_C8 E_ATG/M_CAC_157.25_D E_ATG/M_CAC_298.71_C E_ATG/M_CAC_164.04_C E_ATG/M_CAC_113.58_C E_ATG/M_CAC_54.66_D E_ATG/M_CAC_102.73_C E_ACG/M_CCG_162.2_C E_ATG/M_CTT_381.14_D E_ATG/M_CTT_152.09_C E_ATG/M_CTT_222.78_C E_ATG/M_CCG_109.39_C E_ACA/M_CAA_144.34_C E_AAT/M_CTA_72.04_C E_AAT/M_CCG_132.34_C CT8TG_03_D GACAC3T_07_D E_ACG/M_CGA_152.64_D E_ACG/M_CCG_234.94_D CT8TG_01_D CT8TG_04_D CT8TG_08_C E_AAT/M_CTA_411.89_C CT8TG_02_C E_ATG/M_CCG_451.11_C E_ATG/M_CCG_449.66_C E_ATG/M_CCG_404.38_C E_ATG/M_CCG_258.29_C E_AAT/M_CCG_257.31_D E_AAC/M_CTA_479.5_D E_ACG/M_CAC_152.2_D E_AAT/M_CCG_137.52_D E_AAT/M_CCG_222.05_D E_AAT/M_CTA_200.07_D E_AAC/M_CAA_79.03_C E_ATG/M_CCG_414.39_D E_ACA/M_CAC_267.56_D E_AAC/M_CTA_209.08_C E_AAC/M_CGA_86.1_C E_AAC/M_CGA_114.75_D E_AAC/M_CGA_149.84_C E_ATG/M_CCG_177.67_D E_ACA/M_CAC_120.02_D E_AAT/M_CTA_116.03_C E_AAT/M_CAC_77.61_C8 0.0 E_AAT/M_CAC_78.71_C E_AAT/M_CAC_97.74_C E_AAT/M_CAC_66.91_C E_AAC/M_CTC_101.69_C E_AAC/M_CTC_75.73_C E_AAC/M_CTC_97.74_D E_AAC/M_CTC_77.1_C E_AAC/M_CTC_166.91_C E_AAT/M_CAC_116.82_C E_AAT/M_CAC_414.06_D E_ACG/M_CTC_315.96_D Ase04_A CT8GG_06_D E_ACA/M_CAC_300.42_D E_ACG/M_CGA_142.11_D E_ACG/M_CTC_306.76_D

25 Mapa integrado GACAC3_09_D2.18 E_ACG/M_CTC_204.58_D2.18 E_ACG/M_CTC_115.35_C8 E_ACG/M_CTC_216.63_D1.13 EMBRA72_D GACAC3_02_D2.18 E_ACA/M_CAC_131.15_D2.18 E_ATG/M_CCG_69.74_D2.18 E_ACA/M_CAC_115.27_D2.18 E_ACG/M_CTC_450.29_C AG8CA_01_D1.13 E_ACG/M_CGA_145.87_D1.13 E_AAC/M_CGA_257.77_D1.13 Ase19_D E_AAC/M_CGA_215.19_D2.18 E_ACA/M_CAA_107.3_C8 E_ACG/M_CTC_123.08_D2.18 E_ACA/M_CAC_335.99_D E_AAT/M_CAC_152.24_C8 E_AAC/M_CTC_164.54_D2.18 E_AAT/M_CAC_121.23_C8 E_AAT/M_CAC_64.35_C E_AAT/M_CTA_82.67_C8 E_AAC/M_CAA_324.55_D2.18 E_AAC/M_CGA_185.61_C8 E_ACA/M_CAC_176.74_C AG8CA_04_C8 AG8CA_01_C8 AG8CA_05_C8 AG8CA_09_C CT8AG_02_D2.18 CT8AG_05_C8 CT8AG_09_C8 CT8AG_11_C8 Transferencia exitosa de marcadores microsatélites de Eucalyptus (EMBRA) en A. sellowiana.

26 Comparación de mapas de guayabos Especie P. guajava A. sellowiana N o cromosómico 2n = 22 2n = 22 Contenido 2C ADN (pg) 0,551 0,503 Tipo marcadores AFLP, SSR ISSR, AFLP, SSR N o marcadores mapeados 578 (42 %) 224 (75 %) N o grupos de ligamiento Largo total del mapa (cm) 2179,0 2927,9 Largo promedio de grupos (cm) 198,1 77,1 Rango largo de grupos (cm) 165, 7 232,5 6,4 448,1 Densidad de marcadores 3,8 13,1 Referencia Lepitre et al., 2010 Este trabajo

27 Estudios biológicos y taxonómicos en la especie frutal nativa Psidium cattleianum Speroni G., et al. CSIC I+D ( )

28 Arazá (Psidium cattleianum) Buena adaptación Buena producción de fruta Alta variabilidad intraespecífica Reproducción por semilla Citotipos reportados en la literatura 2n= 44, 66, 77 y 88 No se conoce la diversidad genética de las poblaciones silvestres en Uruguay Sistema reproductivo poco estudiado. Especie potencialmente apomíctica

29 Tamaño del genoma y número cromosómico en P. cattleianum Color fruto Origen 2n Ploidía Contenido ADN 1C (pg) amarillo Uruguay 88 8x 2,1 rojo Uruguay 88 8x 1,9 El genoma de Arazá es casi 8 veces mayor que el de guayabo

30 Identificación de marcadores moleculares en el genoma de P. cattleianum Aplicaciones: Estudio de diversidad genética de las poblaciones silvestres de arazá Dilucidación del sistema reproductivos mediante análisis genéticos de la progenie de cruzamientos dirigidos Prospección (Speroni, G.) Cruzamientos (Vignale, B.)

31 Desarrollo de marcadores moleculares microsatélites en arazá mediante transferencia desde otras Mirtáceas Origen de los iniciadores microsatélites Psidium guajava (Lepitre et al., 2010) Acca sellowiana (Santos et al., 2008) Myrciaria dubia (Rojas et al., 2008) N o de microsatélites evaluados N o de microsatélites exitosamente transferidos TOTAL 36 23

32 QUE SIGUE? EXPLORACION Continuar las actividades de exploración del genoma para ampliar el área explorada nuevas estrategias (nuevos marcadores) UTILIZACION/EXPLOTACION Encontrar asociaciones entre secuencias de ADN y funciones biológicas, caracteres productivos, riqueza de compuestos nutracéuticos, biomédicos. Desarrollar herramientas que faciliten el Mejoramiento genético

33 Beatriz Vignale Pamela Lombardo Cristina Mazzella Paola Gaiero Sandra Vázquez Clara Pritsch Marianella Quezada Paula Silva Gabriela Speroni Danilo Cabrera Patricio Hinrichsen Gonzalo Ravest Dr. AAF García Onofre Nodari Karine dos Santos Gracias

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