TP-Hibridación in situ

Transcripción

1 Genómica Aplicada 2013 TP-Hibridación in situ Sergio Rodríguez Gil Paola Talia Ruth Heinz Soledad Cosentino

2 TP-Hibridación in situ Objetivos: Familiarizarse con las técnicas de FISH y GISH y sus aplicaciones. Entrenarse en la interpretación de resultados de hibridación in situ. Familiarizarse en el uso del microscopio de fluorescencia.

3 Genómica Aplicada 2009 Aplicaciones: TP hibridación in situ FISH: Fluorescence in situ Hybridization Detección de secuencias de ADN ribosomal, ADN altamente y poco repetitivo Detección de secuencias de bajo número de copias o de copia única Detección de transgenes Integración de mapas genéticos con mapas físicos En humanos permite detectar anomalías génicas o cromosómicas BAC-FISH Utilización de sondas de insertos grandes para identificación cromosómica, mapeo de secuencias únicas, asociación de mapas físicos y genéticos GISH: Genomic in situ Hybridization GISH: utilización en análisis de composición de genomas, introgresiones, estudios evolutivos

4 FISH: Localización de la región ribosomal 26S utilizando una sonda homologa de girasol Metafases mitóticas hibridadas con sonda EF235 correspondiente a la región ribosomal 26S. Se observan seis señales de hibridación detectadas con Cy3 (roja).

5 Identificación del complemento cromosómico completo de girasol mediante BAC-FISH, ADNr-FISH y caracterización morfológica a y b Cariograma de girasol realizado a partir de la célula de la figura c. Idiograma correspondiente al cariograma. m= cromosomas metacéntricos, sm= cromosomas submetacéntricos, st= cromosomas subtelocéntricos. La barra indica 10 μm

6 BAC- FISH: Hibridación de sonda BAC en girasol sin bloqueo Prometafase mitótica: se observan señales de localización dispersa en ensayo de BAC-FISH utilizando como sonda el clon de BAC3 marcado con digoxigenina 11- dutp y detectado con FITC. Contratinción con DAPI. La barra indica 10 μm

7 Integración de mapas genéticos y mapas físicos

8 Identificación de clones BAC conteniendo secuencias de interés Distribución de los arreglos por duplicado del total de los clones que componen la genoteca. Autorradiografía de un filtro de BAC de alta densidad (Clemson, CUGI, HA_HBa), hibridado con un grupo de diez sondas overgo. Las flechas indican ejemplos de clones positivos con señales duplicadas.

9 BAC-FISH: Bacterial Artificial Chromosomes- Fluorescence in situ Hybridization Búsqueda en librerías de clones de BACs Tradicional Overgos (overlaping oligonucleotide probes) Método para diseñar overgos Foto: Meksem et al. (2005)

10 BAC-FISH: Bacterial Artificial Chromosomes -Fluorescence in situ Hybridization 16 Foto grupo de ligamiento 16 del mapa genético de girasol E41M59_2 SSL20_2 ORS333 ORS418_2 TC24343 HA3582 TC26869 ORS899 E37M47_26 E41M48_6 ORS303_1 ORS5_2 SSL22_3 ORS126_2 E35M61_4 TC25054 E32M47_1 E33M48_25 ORS656 E40M62_5 E32M49_29 E40M50_1 E37M47_10 E37M47_9 E37M61_8 E37M47_5 E37M61_1 E38M48_2 ORS128 ORS31_1 SSL22_1 ORS126_1 E41M48_4 ORS303_2 HA3683 HA2191 HA4222 ORS455 ORS665 HA2193 ORS788 ORS993 iub_6 E38M60_11 ORS495_1 ORS407 HA360 ORS495_2 E38M48_13 E38M48_7 E40M47_16 Metafase mitótica: las flechas indican señales de hibridación en cromosomas homólogos en un ensayo de BAC-FISH utilizando como sonda el clon de BAC3 conteniendo al microsatélite HA4222 (GL 16). La contratinción fue realizada con DAPI. Relación ADN marcado: ADN bloqueante 1:20. La barra indica 10 µm.

11 Identificación y caraterizacion de BACs BAC Clone SSR Repeat type Repeat LG Accession name ID marker motif number BAC1 131-J09 HA928 (Di Trinucleotide) GT-ATT 10 BV BAC2 132-N05 HA928 (Di Trinucleotide) GT-ATT 10 BV BAC3 50-A15 HA4222 Trinucleotide ATT 16 BV BAC4 20-J02 HA2063 (Di-Dinucleotide) GA-GT 9 BV BAC5 49-K06 ORS805 Dinucleotide GA 9 BV BAC6 236-E09 HA2600 Dinucleotide GA 10 BV728055

12 Localización de secuencias únicas mediante BAC-FISH en girasol

13 Análisis e interpretación de imágenes FISH y GISH - En plantas: The genomic composition of Tricepiro, a synthetic forage crop. Ferrari y col. (2005) Genome 48: (2005) Integration of the FISH pachytene and genetic maps of Medicago truncatula Kulikova y col 2001 The Plant Journal 27(1), En Humanos Un caso clínico de un paciente malformado. Guze ycol. (2004) American Journal of Medical Genetics 124A: En insectos: Characterization and evolution of two bacteriome-inhabiting symbionts in cixiid planthoppers (Hemiptera: Fulgoromorpha: Pentastirini). Bressanl y col. (2009) Environmental Microbiology 11(12),