Técnicas de hibridación. Fundamento teórico. Pedro L. Fernández Hospital Clínic/IDIBAPS/ Universidad de Barcelona

Transcripción

1 Técnicas de hibridación. Fundamento teórico Pedro L. Fernández Hospital Clínic/IDIBAPS/ Universidad de Barcelona

2 Hybris (latín).- Animal procreado por distintas especies. Hibridació.- Proceso de unión de dos cadenas complementarias de ADN, ARN o de ADN y ARN para formar una molécula de ácido nucleico de doble cadena

3 Pirimidinas: C, T, U (ARN) Purinas: A,G

4 Moduladores de la hibridación - secuencia: cualquier hibridación en la que la complementariedad sea inferior al 70% se considerará como no-homóloga. Ocurre en condiciones de baja astringencia. El híbrido es poco estable C-G ( triple puente H), A-T (doble puente H) - temperatura: la alta temperatura aumenta la energía cinética de la cadena, la cual se separa (desnaturaliza) alrededor de los 90º C. Esto es reversible al bajar la temperatura. - ph y productos químicos: el ph alto (ph>11 ) rompe los puentes de hidrógeno, por lo que se produce desnaturalización. La concentración baja de sales en una solución donde se produce una hibridación impone una condición de alta astringencia, permitiendo sólo uniones de gran complementariedad a/la-molecula-de-adn/molecula-adn.html

5 Técnicas basadas en la hibridación - ELECTROFORESIS y BLOTTING: Southern blot, Northern blot - PCR - CGH - MICROARRAYS DE ADN - ISH: FISH, CISH, SISH

6 I. ELECTROFORESIS Y BLOTTING Electroforesis: Técnica de separación de moléculas basada en la diferente capacidad migratoria en un campo eléctrico según su peso molecular y carga eléctrica. -Blotting: transferencia de ácidos nucleicos o proteinas desde un gel a una membrana conservando su posición espacial relativa Suthern blot: ADN Northern blot: ARN Western blot: proteínas

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9 SOUTHERN BLOT

10 NORTHERN BLOT 1. Extracción del RNA 4. Generación de una sonda marcada datp dttp dgtp dctp pgem-t 2. Electroforesis del RNA 5. Hibridación 6. Visualización 3. Transferencia a membrana

11 NORTHERN BLOT ELECTROFORESIS DEL RNA En geles de agarosa En condiciones desnaturalizantes (formaldehido/formamida) 28S 4,8 Kb 18S 1,8 Kb El gel es teñido con bromuro de etidio y el RNA visualizado en un transiluminador UV Integridad del RNA: presencia y proporcion de los RNA (28 y 18S)

12 Southern Blot Northern blot

13 Ciclina D1 ADN ARN

14 PCR desnaturalización hibridación extensión Técnicas derivadas de PCR: RT-PCR SSCP PCR-tiempo real Secuenciación

15 II. Hibridación genómica comparada Técnica citogenética para detectar regiones cromosómicas que están amplificadas o delecionadas en una muestra por medio de una hibridación competitiva sobre una extensión de cromosomas o sondas

16 HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARADA

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18 -OMICAS - Genómica - Transcriptómica - Proteómica - Metabolómica -...

19 Avances en la Biología Molecular Avances en la micro y nanotecnología TÉCNICAS DE ALTO RENDIMIENTO (high throughput) Avances en la biocomputación Medicina traslacional

20 III. Microarrays de ADN

21 DEFINICIÓN de ARRAY ( MATRIZ ): conjunto de elementos similares dispuestos de forma ordenada El término microarray o micromatriz en biología molecular se suele hacer sinónimo de microchip de ADN

22 TIPOS ADN Tejido Células proteínas anticuerpos

23 MICROARRAYS DE ADN Concepto: Conjunto de miles de detectores compuestos de ADN que se colocan sobre un soporte sólido Tipos: cdna, oligonucleótidos Finalidad: detectar niveles de expresión de ARN de miles ( o todos) los genes - Arrays para CGH - SNP arrays Analizan ADN

24 Microchips de cdna Sondas de ADN Microchips de oligonucleótidos Affymetrix

25 Sondas de ADN Microchips de cdna

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27 Basic Tools of the Axon GenePix 4000 Scanner image circle selections undo zoom zoom mode brightness/ contrast view scan area preview scan high res scan stop scan save images signal ratio (per pixel) hardware settings signal intensities (per pixel)

28 UTILIDAD DE MICROARRAYS DE ADN los microarrays de ADN son un método de screening para estudiar miles de genes a la vez, en vez de uno a uno - Detección de mecanismos o vías estimulados o reprimidos en el metabolismo celular (neoplasias o no neoplasias) - Detección de marcadores tumorales útiles para el diagnóstico y clasificación de las neoplasia - Detección de marcadores tumorales útiles para el pronóstico y predicción de respuesta terapéutica de las neoplasia. - Detección de dianas terapéuticas

29 IV. Hibridación in situ Técnica de hibridación que se realiza directamente sobre tejido, células o cromosomas localizados sobre un soporte sólido, habitualmente un portaobjetos. La visualización puede realizarse por medios isotópicos, enzimáticos o con fluorescencia, siendo evaluada en un microscopio. Permite identificar las células donde se produce la hibridación que detecta la alteración genómica o transcripcional

30 ISH isot. FISH CISH Sondas: ADN (oligonucleótidos), ARN.

31 RNA-FISH CISH HPV

32 (Artist Darryl Leja) FISH

33 FISH: Contratinción y reporter Contratinción: DAPI IP Reporter: FITC Spectrum Green Texas Red Spectrum Orange Rodamina Cyanine (2,3,5,7)

34 Tipo de sondas CEP: Chromosome Enumeration Probes: Secuencias de DNA repetidas en tándem (DNA satelite), específicas de cromosoma Marcan la región centromérica del cromosoma Utilidad: Valorar la ploidía TEL: Sondas teloméricas: Marcan la región telomérica Utilidad: Detectar delecciones o reordenamientos cromosómicos LSI: Locus Specific Identifier Marca secuencias especísicas de DNA Utilidad: Amplificación, delección de genes específicos y traslocaciones Subtipos: Split o Brake a part/fusion WCP: Whole Chromosome Painting

35 Tipos de sondas telomere centromere locus specific Whole chromosome paint

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37 FISH Traslocación: Sondas Fusión Cr A Cr B t(a;b)

38 FISH Traslocación: Sondas Break Apart Cr A Cr B t(a;b)

39 Aneusomía/monosomia: Carcinoma de mama (CEP 17,8) GIST (CEP 17/8) Amplificación génica: Her-2/Neu (LSI HER-2/CEP 17) 8q24.2-q24.3 CMYC burkitt lymphoma 2p23-p24 NMYC neuroblastoma, rabdomiosarcoma Traslocaciones: Aplicaciones en AP de FISH Linfomas (manto, folicular..) Sarcomas (Ewing, alveolar..)

40 CISH (hibridación in situ cromogénica) SISH: silver in situ hybridization Muestras: Tejido parafinado Detección: enzimática Dianas: DNA genómico: Amplificación RNA mensajero: expresión génica detección infecciones víricas

41 SISH CISH

42 EBER In Situ Hybridization (DAB) (Nasopharyngeal Carcinoma)

43 Aplicaciones en AP de CISH-SISH Detección de virus: Epstein Bar: EBER Citomegalovirus Expresión genómica: Cadenas ligeras (Kappa,Lambda) Cadenas Pesadas (IgA, IgG, IgD, IgM) Amplificación de un gen: Her-2/Neu