Historia. Hibridación in situ Fluorescente

Transcripción

1 Fluorescent in situ Hybridization

2 Historia Hibridación in situ Desarrollada por Pardue & Gall (1969) -Muy pocas secuencias de DNA disponibles -Radioisótopos Alto entrenamiento Seguridad Tiempo Hibridación in situ Fluorescente Pinkel & Gray (1984) Detección de secuencia blanco por fluorescencia Método rápido Discriminativo Inofensivo Relativamente fácil

3 Fundamentos Desnaturalización 37ºC 95ºC

4 Desnaturalización de la sonda Metodología Desnaturalización del DNA Cromosómico Hibridación Sonda-DNA Cromosómico

5 Hibridación in situ Fluorescente FISH (Clásico) Multicolor Karyotyping Spectral Karyotyping Multicolor banding FISH Fiber FISH Q-FISH Flow-FISH Chromosome combing Padlock FISH CGH Array-CGH etc.!!

6 Sondas

7 Sondas Definición Fragmentos de DNA homólogos a la secuencia blanco, marcados con una molécula detectable directamente o mediante una reacción inmunoquímica Estos fragmentos deben cubrir una región de por lo menos 70 kb para poder ser detectados al microscopio.

8 Sondas: Sondas región específicas: Sondas gen-específicas: Sondas de pintado cromosómico total:

9 Hibridación in situ Fluorescente en diagnóstico oncológico

10 Genética Clínica Citogenética Clásica Genética Molecular Citogenética Molecular

11 Análisisde Metafases Translocaciones Cromosomas Marcadores Inversiones (pericéntricas) Anomalías numéricas Microdeleciones

12 Análisisde Metafases

13 Citogenética de interfase Diversidad de sondas específicas (proyecto genoma) Simplificación de protocolos Disminución del tiempo de análisis Mejora notable en los métodos de marcado de sondas Mejora en los sistemas de tomas de imágenes y software Información valiosa en núcleos interfásicos FISH en interfases HERRAMIENTA CLÍNICA

14 Citogenética de interfase Algunos usos específicos Estudio de mosaicismos Células tumorales Muestras pequeñas Células inactivas

15 FISH en interfases Se obtiene información de una gran variedad de muestras Permite obtener información específica en muestras pequeñas Independiente de la presencia de células metabólicamente activas Es necesario establecer criterios propios Sujeto a variaciones técnicas importantes Debido a: Calidad de la sonda Calidad de la fijación Background Reactivos de detección Interpretación de las señales Especificidad de la sonda Temperatura de desnaturalización Variabilidad entre reacciones

16 Diseño o de sondas 22qter (C+) HIRA (Tuple1) PPM1F TOP3B Cent.

17 Diseño o de sondas Para aplicación en Oncología

18 Diseño o de sondas Para aplicación en Oncología Sondas Locus específicas Sondas Break Apart Sondas Doble fusión Sondas Tumores sólidos

19 Sondas Oncológicas Locus Específicas 17p13.1 (TP53) FXR2 17p13.1 SHBG SAT2 150Kb TP53 (20Kb) WDR79 EFNB3 DYH2 Izq, Normal. Der, P53-17q25.3 Isocromosoma 17q

20 Sondas Oncológicas Locus Específicas 1p36 (TP73) 1p Kb TP73 Control 1q44

21 Sondas Oncológicas Locus Específicas 5q15-q31 (SHGC85191/EGR1) Control 5q11.2 SHGC85191 EGR1

22 Sondas Oncológicas Tumores sólidos CANCER DE MAMA: Her 2/neu (erb2) Es un oncogen que se encuentra en la célula normal en dos copias únicamente Enumeración 17 (17p11.2) (C+) Her 2/neu Distintos mecanismos pueden llevar a la amplificación de este gen, desencadenando la enfermedad.

23 Sondas Oncológicas Tumores sólidos Procesado: Microtomo Tacos de parafina Cortes de 4-6 µ Señal al microscopio

24 Sondas Oncológicas Tumores sólidos Celula normal: dos copias de Her 2/neu dos señales verdes representan dos cromosomas 17 dos señales rojas representan dos copias del oncogen Celulas con amplificaciones Las señales verdes representan los cromosomas 17, las señales rojas representan del oncogen amplificado

25 Células normales Sondas Oncológicas Tumores sólidos Células anormales

26 Diseño o de sondas Translocación BCR-ABL

27 Diseño o de sondas Cromosoma Philadelphia en Leucemia Mieloide Crónica 95 % de los pacientes tiene esta fusión Su presencia activa una tirosina kinasa requerida para su función transformante La evolución es seguida a través del porcentaje de células con cr. Phi en sangre El método más apropiado para esto es FISH

28 Diseño o de sondas Translocación BCR-ABL Porqué FISH? Los métodos moleculares (PCR) dan la respuesta: SI ó NO FISH: respuesta cuantitativa (%) Los métodos moleculares (PCR) pueden contaminarse con falsos positivos FISH: no es pasible de contaminación intermuestras

29 Translocación BCR-ABL (Sonda Fusión Simple) 140Kb 52Kb Crom. 22 BCR Crom. 9 ABL 350Kb 421Kb BCR-ABL - Falsos positivos 5-13% BCR-ABL +

30 Sondas de Doble Fusión Translocación BCR-ABL (Sonda Doble Fusión) 140Kb 52Kb Crom. 22 BCR Crom. 9 ABL 1300Kb 876Kb BCR-ABL - Falsos positivos 0.5% BCR-ABL +

31 Diseño o de sondas MLL (myeloid/lymphoid or mixed leukemia)

32 Sondas Break Apart MLL (myeloid/lymphoid or mixed leukemia) (Sonda Break apart) Crom. 11 MLL MLL normal MLL translocado

33 Conclusiones Finales Simple de aplicar Resultados obtenidos en corto tiempo Fácil de interpretar Funciona en casi cualquier célula o tejido Herramienta en investigación Herramienta diagnóstica

34 MUCHAS GRACIAS