Técnicas de hibridación Concepto, modalidades y tipos de sondas Aplicaciones principales. Federico Rojo Fundación Jiménez Díaz

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1 Técnicas de hibridación Concepto, modalidades y tipos de sondas Aplicaciones principales Federico Rojo Fundación Jiménez Díaz

2 Guión de la presentación Alteraciones estructurales del DNA y cáncer Hibridación in situ: concepto y tipos de sondas Aplicaciones: diagnóstico, pronóstico y predicción Tres ejemplos de estudio de traslocaciones y de alteraciones numéricas

3 Guión de la presentación Alteraciones estructurales del DNA y cáncer Hibridación in situ: concepto y tipos de sondas Aplicaciones: diagnóstico, pronóstico y predicción Tres ejemplos de estudio de traslocaciones y de alteraciones numéricas

4

5 Alteraciones estructurales del DNA en cáncer Cell extrinsic mechanisms: Radiation Topoisomerase inhibitors Oxidative stress Toxic agents Viruses Proto-oncogene / Supressor gene Chromosome Cell intrinsic mechanisms: Aberrant DNA-repair mechanisms Non-canonical DNA Fragile sites Transcriptional stress

6 Unbalanced translocation Balanced translocation Point mutation Gene gain, amplification Proto-oncogene / Supressor gene Chromosomal translocation Chromosome Local rearrangement Deletion Local rearrangement Inversion Isochromosome, ring chromosome

7 Alteraciones estructurales del DNA en cáncer Holland, AJ & Cleveland, DW. Nat Med 2012

8 Guión de la presentación Alteraciones estructurales del DNA y cáncer Hibridación in situ: concepto y tipos de sondas Aplicaciones: diagnóstico, pronóstico y predicción Tres ejemplos de estudio de traslocaciones y de alteraciones numéricas

9 Concepto de la hibridación in situ Hibridación con sondas radiactivas (John, 1969) Hibridación fluorescente (Pinkel, 1986) para marcado de cromosomas y de cambios en genes

10 La base de las técnicas de hibridación de DNA

11 Estrategias para el estudio de alteraciones cromosómicas: Hibridación in situ de DNA 1. Desnaturalización de las sondas de DNA 2. Desnaturalización del molde de DNA (cromosoma) 3. Annealing (renaturalización, hibridación de las pruebas) 4. Lavado de posthibridación, astringencia (SCC, formamida) 5. Contratinción de los núcleos (DAPI, PI)

12 Hibridación in situ de fluorescencia

13 Sondas específicas de locus, centroméricas y teloméricas Gene-specific probes Normal Centromeric probes Abnormal Telomeric probes

14 Sondas de fusión (fusion-probes) y de separación (break-apart / split-probes)

15 Estrategias para el estudio de alteraciones cromosómicas: Hibridación in situ FISH CISH SISH Rhodamine / Texas redlabeled DNA probe FITClabeled DNA probe Texas redlabeled DNA probe FITClabeled DNA probe DNPlabeled DNA probe DNPlabeled DNA probe Anti-Texas red conjugated with AP Anti-FITC conjugated with HRP Anti-DNP conjugated with HRP Anti-DNP conjugated with AP Chromogenic detection Chromogenic detection Silver acetate detection Chromogenic detection Hoff, K et al. Anat Pathol 2010

16 Estrategias para el estudio de alteraciones cromosómicas: Hibridación in situ de DNA Aplicaciones Detección de aneuploidia Análisis de centrómeros Estudio de cromosomas Análisis de genoma completo (pintado cromosómico) Identificación de traslocaciones Detección de genes Estudio de microdeleciones Determinación de amplificación y deleción génica Cromosomas en metafase Núcleos en interfase Tejidos fijados Células en cultivo

17 Estrategias para el estudio de alteraciones cromosómicas: Hibridación in situ de RNA (mrna y mirna)

18 Estrategias para el estudio de alteraciones cromosómicas: Cariotipo espectral, m-fish X 14 1 X 9 der(1)t(1;5) der(2)t(1;2) der(3)t(x;3) der(5)t(5;13) der(6)t(6;14) der(6)t(x;6;9) B6-15 B6-1, B6-15 HT29, C7-1, C7-15 HT29, C7-1, C7-15 HT29, C7-1, C7-15 B6-1, B X X ins(x;9) der(9)t(x;6;9) der(12)t(7;12) der(13)t(5;13) der(14)t(6;14) dup(19p) HT29 C7-15 B6-15 HT29, C7-1 HT29, C7-1, C7-15 C7-1, C7-15

19 Estrategias para el estudio de alteraciones cromosómicas: Hibridación Genómica Comparada (CGH) - muestra cambios del número de copias de secuencias de DNA (pérdidas, ganancias y amplificaciones), pero no detecta traslocaciones balanceadas. - puede utilizarse tanto tejido fresco como fijado en formol y su sensibilidad es afectada por el porcentaje de células tumorales de la muestra.

20 Estrategias para el estudio de alteraciones cromosómicas: Hibridación Genómica Comparada (CGH)

21 Guión de la presentación Alteraciones estructurales del DNA y cáncer Hibridación in situ: concepto y tipos de sondas Aplicaciones: diagnóstico, pronóstico y predicción Tres ejemplos de estudio de traslocaciones y de alteraciones numéricas

22

23 Traslocaciones en procesos linfoproliferativos

24 Traslocaciones en sarcomas Jain, S et al. Int J Clin Exp Pathol 2010

25 Síndromes hereditarios asociados a sarcomas en edad pediátrica Slater, O & Shipley, J. J Clin Pathol 2007

26 Guión de la presentación Alteraciones estructurales del DNA y cáncer Hibridación in situ: concepto y tipos de sondas Aplicaciones: diagnóstico, pronóstico y predicción Tres ejemplos de estudio de traslocaciones y de alteraciones numéricas

27 Sarcoma sinovial: Traslocación (X;18)(p11;q11)

28 Sarcoma sinovial: Traslocación (X;18)(p11;q11) Before translocation Chromosome X After translocation Chromosome 18 Jefferson T, D Mol Pathol, 2005

29 Sarcoma sinovial: Traslocación (X;18)(p11;q11)

30 Sarcoma sinovial: Traslocación (X;18)(p11;q11) Amary, MFC et al. Mod Pathol 2007

31 Sarcoma sinovial: Traslocación (X;18)(p11;q11) Normal Abnormal

32

33 SYT 3 SYT 5

34

35 Targetable genes in NSCLC Oxnard, GR et al. J Clin Oncol 2013

36

37 Traslocación de ALK en cáncer de pulmón Doebele RC et al. Clin Cancer Res 2012

38 Traslocación de ALK en cáncer de pulmón Doebele RC et al. Clin Cancer Res 2012

39 Traslocación de ALK en cáncer de pulmón - Evaluación de > 50 células - Separación de señales: la distancia entre ambas equivale al diámetro de una señal o se detecta únicamente la señal 3 - > 15% de las células con alteración ALK-3 ALK-5 Lindeman, NI et al. Arch Pathol Lab Med. 2013

40 Utilidad del FISH en el diagnóstico diferencial en lesiones melánicas cutáneas Gerami, P et al. Am J Surg Pathol 2009 Bastian, BC et al. Am J Pathol 2003 Bastian, BC et al. Cancer Res 1998 North, JP et al. Am J Surg Pathol 2014

41 Utilidad del FISH en el diagnóstico diferencial en lesiones melánicas cutáneas

42 Utilidad del FISH en el diagnóstico diferencial en lesiones melánicas cutáneas RREB1 CCND1 MYB CEP6

43 Número de células Utilidad del FISH en el diagnóstico diferencial en lesiones melánicas cutáneas % núcleos con incremento del gen RREB1: % núcleos con ganancia relativa del gen RREB1: % núcleos con incremento del gen CCND1: % núcleos con pérdida relativa del gen MYB: 57% (> 29%) 73% (> 55%) 6% (> 38%) 55% (> 40%) CEP6 MYB REBB1 CCDN Número de señales por núcleo

44 Mensajes finales Las técnicas de hibridación in situ permiten determinar alteraciones estructurales del DNA (y el estudio de RNA) Utilidad diagnóstica, pronóstica y predictiva de respuesta

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