REPARACIÓN DE LAS LESIONES GENÓMICAS INDUCIDAS POR LOS VENENOS DE LA TOPOISOMERASA II. M. de Campos Nebel, M.E. Elguero, I. Larripa, M. González-Cid.

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1 REPARACIÓN DE LAS LESIONES GENÓMICAS INDUCIDAS POR LOS VENENOS DE LA TOPOISOMERASA II M. de Campos Nebel, M.E. Elguero, I. Larripa, M. González-Cid. Depto. de Genética, I.I.HEMA. Academia Nacional de Medicina. LOGO 1

2 Topoisomerasa II dos isoformas, α y β, codificadas por diferentes genes enzima dependiente de ATP, cataliza cambios en la topología del ADN, expresión fuertemente regulada durante el ciclo celular, rol en la condensación y separación cromosómica, participa en la organización de la cromatina y en transcripción, blanco de acción de muchos agentes quimioterapéuticos. 2

3 Venenos de Topoisomerasa II Idarubicina Etopósido Blanco principal para inducir daño Droga Blanco daño al ADN Idarubicina Topoisomerasa II α DSB Síntesis de ADN DSB Topoisomerasa I (in vitro) SSB Etopósido Topoisomerasa II α DSB Topoisomerasa II β DSB 3

4 Envenenamiento de la Topoisomerasa II Droga DSB persistente Complejo ternario (ADN-enzima-droga) Etopósido 2h 4

5 Reparación de las DSB generadas H2AX γh2ax Procesado de extremos Reparación por HR Reparación por c-nhej Focos Rad51 ps2056dna-pkcs 5

6 Venenos de Topoisomerasa II Idarubicina: primera y segunda línea de tratamiento en leucemia mieloide aguda, segunda línea en leucemia linfoblástica aguda, cáncer de mama, leucemia mieloide crónica y linfoma No-Hodgkin. Etopósido: primera línea de tratamiento de tumores testiculares y carcinoma de pulmón de células pequeñas, tratamiento de linfomas de Hodgkin y No-Hodgkin y leucemia mieloide aguda, tratamiento de varios carcinomas, hepatoblastoma, leucemia linfoblástica aguda, linfomas de células T cutáneos, mieloma múltiple, neuroblastoma, sarcomas de tejidos blandos, tumores cerebrales primarios, tumores trofoblásticos gestacionales, y carcinomas de pulmón de células no pequeñas. 6

7 Tumores relacionados a la terapia Frecuentes (1-15% de los pacientes, dependiendo de la terapia). Agentes que envenenan a la Topoisomerasa II: 5-15% de los pacientes con neoplasias desarrollan LMA-t luego de un corto período de latencia. LMA: - 70% presentan translocaciones que involucran al gen MLL. Nat. Rev. Cancer (2005), 5:

8 OBJETIVO - Evaluar el rol de las vías c-nhej y HR en impedir la propagación de inestabilidad genómica inducida por ETO e IDA en fibroblastos humanos normales y en líneas celulares de Hámster chino proficientes y deficientes en estos mecanismos. 8

9 Esquema experimental (I) Fibroblastos humanos diploides (PTP) 28h 38h 50h 52h 74h t=0 2h 26h -Evaluación de muerte celular por Anexina V (Cit. Flujo) Cultivos sincronizados -Focos de reparación por HR (Rad51) y NHEJ (ps2056dna-pkcs) 9

10 Esquema experimental (II) Fibroblastos de Hámster chino: -CHO9 (wt) y XR-C1 (DNA-PKcs mut ) -V79 (wt) y V-C8 (BRCA2 mut ) Cultivos asincrónicos: Daño residual (γh2ax), aberraciones cromosómicas y MN Cultivos sincronizados: Tratamiento c/ IDA o ETO G1 S G2 M Interfase t=0 Formación de MN Análisis de aberraciones cromosómicas 10

11 Efecto de ETO e IDA sobre la inducción de muerte celular IDA 2h ETO 2h PLoS ONE 2010, 5(9): e

12 Cinética de reparación de DSB 20 µm PLoS ONE 2010, 5(9): e

13 Reparación por c-nhej PLoS ONE 2010, 5(9): e

14 Reparación por HR PLoS ONE 2010, 5(9): e

15 C-NHEJ y HR actúan con especificidad de fase en el ciclo celular PLoS ONE 2010, 5(9): e

16 Eventos de reparación residual por c-nhej frente al daño inducido por los venenos de Topoisomerase II ETO: MN= 5-17% ps2056+ ; Ap=14-56% ps2056+ IDA: MN=12-28% 28% ps2056+ ; Ap=40-63% ps2056+ Ampliación: ETO 38 h PLoS ONE 2010, 5(9): e

17 Daño remanente en células deficientes en c-nhej o HR Cultivos asincrónicos: 17

18 Aberraciones cromosómicas en primera mitosis Cultivos sincronizados: 18

19 Aberraciones cromosómicas inestables XR-C1: 19

20 Conclusiones. c-nhej y HR actúan con especificidad de fase en el ciclo celular en respuesta al daño inducido por los venenos de Topoisomerasa II,. Las actividades residuales de reparación por c-nhej mediadas por DNA-PKcs pueden contribuir a la generación de inestabilidad cromosómica,.tanto c-nhej como HR son importantes para impedir la propagación de inestabilidad genómica inducida por los venenos de Topoisomerasa II,. Si bien alteraciones en c-nhej o HR resultan en frequencias aumentadas de aberraciones cromosómicas inducidas id por ETO e IDA, la vía c-nhej mediada por DNA-PKcs en S/G2 preserva la integridad cromosómica y promueve la progresión de células aberrantes. 20

21 LOGO 21

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