TESIS DOCTORAL. Regulación transcripcional durante la activación de los linfocitos T por la enzima Poli-ADP-ribosa polimerasa-1.
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- Andrés Navarrete Ruiz
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1 Unidad de Cirugía Experimental. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. Universidad de Murcia Dpto. Bioquímica, Biología Molecular B e Inmunología, Facultad de Medicina TESIS DOCTORAL Regulación transcripcional durante la activación de los linfocitos T por la enzima Poli-ADP-ribosa polimerasa-1 Luis Sáenz Mateos
2 Introducción El sistema inmune Innata o Natural Sistema inmune Específica o Adaptativa Linfocitos B Linfocitos T
3 Introducción Activación del Linfocito T A B APC APC p-mhc CD80 o CD86 Co-estimulador TCR CD28 Co-receptor CD28 Co-receptor CD3 Linfocito T Linfocito T 1ª señal sola 2ª señal sola Inactivación Anergia NO efecto Activación Ganancia de función efectora TCR
4 Introducción Activación del Linfocito T Señalización a nivel nuclear A Célula presentadora de antígeno CD80 o CD86 B Célula presentadora de antígeno pmhc pmhc Medio Extracelular Célula T Célula T Citoplasma Vía MAPK-RAS Calcineurina Calmodulina Calmodulina Calcineurina Núcleo Respuesta Efectora Anergia
5 Introducción Poli-ADP-ribosa polimerasas Proteína (e) ADP-ribosa Liasa (d) PARG ADP-ribosa (d) PARG: Poli-ADP-ribosa Glicohidrolasa
6 Introducción Poli-ADP-ribosa polimerasa-1 (PARP-1) Estructura Caspasas 3, VKSEGKRKGDEVDGVDEVAKKKSKKEKDKDSKLEALKA-240 DBD NLS A Nt 1 FI B FII HTH BRCT LZ E E D C 373 Sitio activo 525 F 656 Ct
7 Introducción Poli-ADP-ribosa polimerasa-1 (PARP-1) Regulación Hormonas esteroides Estrés Infecciones Señales transducción Reconocimiento de estructuras y secuencias del DNA
8 Introducción PARP-1 - Herramientas para el estudio de su función biológica Respuesta celular frente al daño en el DNA Ratones deficientes en PARP-1 Inhibidores farmacológicos de PARP Inhibición trans-dominante División celular Muerte celular Procesos inflamatorios
9 Introducción PARP-1 - Ratones Parp-1-/ Wang y col. Genes and Development 1995 (exon 2) de Murcia y col. Pro Natl Acad Sci USA 1997 (exon 4) Masutani y col. Mol. Cell Biochem (exon 1) Fenotipo común Viables, fértiles y con desarrollo normal 20% más pequeños que los controles, retraso del crecimiento Alta inestabilidad genómica en respuesta a gamma-radiación y agentes alquilantes Protección frente a diabetes, artritis, Parkinson y pancreatitis Resistente a isquemia cerebral, shock séptico
10 Introducción PARP-1 Funciones Biológicas Reparación del daño en el DNA División celular Longitud telómeros Replicación del DNA Muerte celular Proceso de reparación de escisión de bases (BER) Proceso de reparación de roturas de cadena sencilla (SSBR) Proceso de reparación de roturas de cadena doble (DSBR) Modifica a proteínas centroméricas regulando el sistema de control del huso mitótico y la relajación de la cromatina condensada del centrómero Mantiene la integridad genómica de los telómeros en cada división celular Interacciona con proteínas del complejo de replicación multiproteico Apoptosis y necrosis
11 Introducción PARP-1 Funciones Biológicas Alteración cromatina Transcripción génica de la estructura de Interacción física o funcional factores de transcripción la con Interacción con secuencias reguladoras Complejo de transcripción dependiente de Parp-1
12 Introducción PARP-1 Transcripción génica Efecto sobre la cromatina A Transcripción reprimida Transcripción activa A Núcleo de histonas B Unidades poli(adp-ribosa) Histonas B Transcripción reprimida Transcripción activa C
13 Introducción PARP-1 Transcripción génica Factores de transcripción ON Factor de transcripción modificado PARP-1 NFκB Regulación de la estabilidad y la capacidad de unión al DNA OFF Interacción física con Factor de transcripción NFA T
14 Introducción PARP-1 Transcripción génica Interacción con secuencias reguladoras Silenciamiento por interacción con el promotor Transcripción de Reg T GC C C C T C C C AT Complejo iniciador de la transcripción In hibid ores Parp T GC C C C T C C C AT Poli(ADP-ribosa) Complejo iniciador de la transcripción
15 Hipótesis y objetivos PARP-1 Regulador de la expresión génica en la activación de linfocitos T Hipótesis PARP-1 desempeña un papel importante en la regulación de la expresión génica temprana durante la activación de los linfocitos T 1. Análisis de los patrones de expresión génica diferencial en células T Parp-1 / y Parp-1 -/- en condiciones basales y en respuesta precoz a la estimulación del receptor antigénico en ausencia y presencia de coestimulación Objetivos 2. Identificación de genes dependientes de PARP-1 en respuesta a la activación vía TCR con anti-cd3 o en combinación con anti-cd28 3. Determinación de los procesos o funciones celulares en los que están involucrados los genes dependientes de PARP-1 identificados en la activación de los linfocitos T 4. Efecto de la deficiencia de PARP-1 en la capacidad proliferativa de los linfocitos T in vitro.
16 Material y métodos Material y métodos Biopsia de cola Ratones en fondo genético C57BL/6J Aislamiento DNA genómico Citometría de flujo Extracción del Bazo Aislamiento de linfocitos T RT PCR a tiempo real Microarrays Genotipaje % linfocitos T Nivel apoptosis in vitro Activación celular Aislamiento RNA PCR Proliferación celular ELISA Nivel de expresión de citoquinas Actividad enzimática PARP
17 Resultados Análisis del número de esplenocitos Parp-1 / Parp-1 -/ nº de células (x 10 ) ratones silvestres 87 ratones Parp-1 -/6-8 semanas de edad p > Parp-1 / Parp-1 -/-
18 Resultados Análisis de las poblaciones celulares del bazo / Parp-1 Parp-1 / 60 Parp-1 -/- -/Parp-1 nº de células (x 10 6 ) ratones silvestres 23 ratones Parp-1 -/6-8 semanas de edad p > CD4 CD8 B220
19 Resultados Análisis de la actividad enzimática PARP 3000 Parp-1 / 2500 CPM ratones silvestres 6-8 semanas de edad * α CD3 α CD28 PMA Ionomicina H2 O minutos
20 Resultados Análisis de la expresión génica diferencial en células T silvestres y Parp-1 -/Expresión génica diferencial en condiciones basales y de estimulación Expresión génica diferencial en condiciones basales Expresión génica diferencial en respuesta a estimulación Anti-CD3 Anti-CD28 Anti-CD3 755 genes Parp-1 / 1168 genes genes 1085 genes 413 genes 363 genes 656 genes 669 genes genes Parp-1 -/- 958 genes 1137 genes 302 genes 468 genes
21 Resultados Análisis de la expresión génica diferencial en células T silvestres y Parp-1 -/Identificación de genes dependientes de PARP-1 durante la activación temprana de los linfocitos T Tratamiento Reposo Número de Genes A Total Regulados positivamente Regulados negativamente B Anti-CD3 182 Anti-CD3 Anti-CD B
22 Resultados Análisis de la expresión génica diferencial en células T silvestres y Parp-1 -/Identificación de genes dependientes de PARP-1 durante la activación temprana de los linfocitos T PCR a tiempo real Anti-CD3 Anti-CD3 A Parp-1 / Cambio de expresión relativo (Reposo vs Activado) Parp-1 / BAnti-CD28 -/Parp-1 Parp-1 -/ Egr2 Prnp Nr4a1 IL-12rb1 Egr2 Prnp Nr4a1 IL-12rb1
23 Resultados Análisis de la expresión génica diferencial en células T silvestres y Parp-1 -/La deficiencia de PARP-1 afecta la expresión de genes involucrados en la respuesta inmune Software Ingenuity anti-cd3 anti-cd28 anti-cd3 Genes observados/genes esperados Activación del linfocito T Respuesta inmune Cascada de protein-quinasas Transcripción Cascada de señalización intracelular Metabolismo Anti-CD3 Anti-CD3 Anti CD28
24 Resultados Análisis de la expresión génica diferencial en células T silvestres y Parp-1 -/- 3,12 2,51 3,07 1,73 1,38 1,75 1,97 1,24 1,56 1,18 1,51 1,14 1,60 1,12 1,55 1,02 1,11 1,01 1,75 1,15 2,70 1,46 2,70 1,36 2,67 2,12 2,32 1,97 2,04 1,70 1,58 2,18 1,26 1,80 1,09 1,12 1,17 1,19 1,00 1,13 1,33 2,02 1,44 1,52 1,67 1,51 1,15 1,04 1,15 1,16 1,18 1,06 1,77 1,98 2,09 1,69 2,07 1,84 1,63 2,96 2,04 2,08 1,75 Cambio de expresión relativo (Reposo vs Activado) 1,83 Cambio de expresión relativo (Reposo vs Activado) tia -C n 3 D ti -C n a 8 2 D ti -C n A 3 D La deficiencia de PARP-1 afecta la expresión de genes involucrados en la respuesta inmune Parp-1 / Anti-CD IL PARP-1 / Rel Ccl4 Anti-CD3 Anti-CD28 -/Parp-1 PARP-1 -/- Slamf1 Gbp7 / Parp-1 PARP-1 / 14 PARP-1-/- -/Parp Ccl IL-4 Ccl4 Rel Slamf1 Gbp7 Ccl9
25 Resultados Análisis de la expresión génica diferencial en células T silvestres y Parp-1 -/La deficiencia de PARP-1 afecta la expresión de genes involucrados en la respuesta inmune IL4 PCR a tiempo real IL-4 ELISA * * 20 Parp-1Parp-1 / Parp-1Parp-1 -/-/- / B Pg/mL Cambio expresión relativo (Reposo vs Activado) A * * horas α CD3 - α CD
26 Resultados Análisis de la expresión génica diferencial en células T silvestres y Parp-1 -/Efecto de la deficiencia de PARP-1 en la capacidad proliferativa de los linfocitos T in vitro 36 ratones silvestres 48 ratones Parp-1 -/6-8 semanas de edad p < 0.05 Proliferación Celular 5 ratones silvestres 5 ratones Parp-1 -/6-8 semanas de edad p > 0.05 Análisis Supervivencia Parp-1 / PARP-1 / -/Parp-1 PARP-1 -/- 48 horas * * % de supervivencia CPM A24 horas α CD3 - α CD3 - α CD α CD Parp-1 / B48 horas PARP-1-/-/ Parp-1 PARP-1 -/
27 Conclusiones
28 Conclusiones
29 Conclusiones
30 Conclusiones
31 La depleción o inhibición química de PARP-1 reduce la supervivencia celular en células BRCA1 o 2 no funcionales.
32 Tumores sólidos, linfomas y cáncer de mama
33 Inhibidor oral de PARP-1 actividad antitumoral en cáncer pancreático
34 Trasplante renal
35 Golpe de calor
36 Cancer de ovario Inhibición de PARP-1 ralentiza la progresión de la esclerosis múltiple
37 Inhibición de PARP-1 ralentiza la progresión del hepatocarcinoma
38 Cáncer de mama y ovario >>>>PARP-1
39 Influencia de los polimorfismos de PARP-1 después de un daño cerebral traumático
40 Nuevos inhibidores de PARP-1 para ayudar al tratamiento de nuevos cánceres
41 FIN
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