IMPACTO CLINICO DE LA INMUNOFENOTIPIFICION CELULAR IV: Ciclo celular en estados neoplásicos y preneoplásicos. T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N.

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1 IMPACTO CLINICO DE LA INMUNOFENOTIPIFICION CELULAR IV: Ciclo celular en estados neoplásicos y preneoplásicos. T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N. Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda. Laboratorio de Citometría de Flujo Hospital del Trabajador, Concepción, Chile. Caracterización fenotípica Microscopio óptico Microscopio electrónico Microscopio epifluorescencia Anticuerpos ELISA Citometría de Flujo Southern blot Northen blot Western blot PCR Utilidad clínica Caracterización genotípica

2 CICLO CELULAR CICLO DE VIDA DE UNA CELULA (24HRS) MITOSIS M G2(4n) 1 hr G0 (2n) Post Síntesis DNA 4 hr 10 hrs Síntesis ADN S 9 hr G1 (2n) Pre-síntesis ADN Los tiempos de cada fase varían según el modelo celular evaluado Comparison of a typical normal (A) and malignant (B) cell. CEA, carcinoembryonic antigen, AFP, alpha-fetoprotein Comparison of a typical normal (A) and malignant (B) cell. CEA, carcinoembryonic antigen, AFP, alpha-fetoprotein

3 Células cancerosas difieren de las normales 1. Pérdida de funciones diferenciadas. 2. Expresión de neo antígenos no típicos del estado diferenciado. 3. Capacidad de invadir tejidos no nativos. 4. Metabolismo diferente. 5. Inestabilidad genética elevada. 6. Morfología anormal. 7. Progresión hacia malignidad. Cáncer Alteraciones fenotípicas y genotípicas Histología Inmunohistoquímica Inmunofenotipíficación Ciclo celular (CF) Genéticas Citogenéticas Análisis citogenético Análisis citogenético Hibridización in situ fluorescente Cariotipo espectral

4 Análisis de ADN polimórfico de un tumor mediante PCR Microarray Information Figure from: David J. Duggan et al. (1999) Expression Profiling using cdna microarrays. Nature Genetics 21: Micro Array assay RNA CF HISTOLOGIA PROTEINAS DNA CANCER FISH IHQ SKY CICLO CELULAR MICRO ARRAY

5 Múltiples eventos se requieren para la expresión de un cáncer humano: modelo de carcinogénesis de colon. Genes supresores Oncogenes Genética del cáncer: Clases de genes implicados en el cáncer Oncogenes Genes supresores Genes reparadores de DNA Genes reparadores de ADN

6 Genes supresores actúan como frenos Tumor suppressor p53: guardian of the genome (Inactivado en la mayoría de los tumores por mutación y LOH) Oncogenes accionan el acelerador (apoptosis) Tumor suppressor p53 Modelo de progresión de eventos para el desarrollo de cáncer de mama Molecular Cancer 2004, 3:9

7 Modelo de progresión de eventos para el desarrollo de cáncer de próstata Modelo de progresión de eventos para el desarrollo de cáncer colorectal Molecular Cancer 2004, 3:9 Molecular Cancer 2004, 3:9

8 ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR INDICE ADN (ID): Medición de Ploidia de ADN. ID: Razón de la Cantidad de ADN de la Muestra v/s el control. ID = Contenido ADN Células Muestra Contenido ADN Células Control ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR INDICE ADN (ID): Medición de Ploidia de ADN PLOIDIA INDICE ADN ADN Diploide ADN Aneuploide ADN Hiperdiploide ADN Hipodiploide = 1 = 1 > 1 < 1 Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov DNA Analysis DNA Analysis Counts Counts DNA index 1.21 Aneuploid peak N 4N PI Fluorescence PI Fluorescence Purdue University Cytometry Laboratories Purdue University Cytometry Laboratories

9 Transbordador espacial Challenger, 28 enero 1986 D. Hansemann (Virchows Arch Pathol Anat 119: ;1890) Descubrió el balance anormal de cromosomas en células cancerosas Por qué? Theodor Boveri (Alemania, 1914) Transbordador espacial Challenger, 28 enero 1986 Mitosis multipolar causa aneuploidía, un balance anormal de cromosomas, y que ésta produce cáncer

10 Década 60s Las investigaciones se centraron en entender las alteraciones de genes específicos que conducen al cáncer: p53 mutante Genes reguladores de la mitosis Sobre expresión de proteínas asociadas al centrosoma Células cancerosas difieren de las normales 1. Pérdida de funciones diferenciadas. 2. Expresión de neo antígenos no típicos del estado diferenciado. 3. Capacidad de invadir tejidos no nativos. 4. Metabolismo diferente. 5. Inestabilidad genética elevada. 6. Morfología anormal. 7. Progresión hacia malignidad. Science 271:1744 (1996) Nature Genet 20:189 (1998) Science 284: 2089 (1999) El cáncer es producido por mutaciones de genes específicos, llamados oncogenes y genes supresores de tumores. Un gen mutado o la combinación de ellos no es suficiente para transformar una célula normal en neoplásica Science 194:23-28 (1976) Nature 289: (1981) Science 285: (1999) Science 285: (1999) Science 267: (1995) Biochem J. 340: (1999) Cell cycle 3: (2004) Nature Biotechnol 21:13-14 (2003) Science 284:2089 (1999) Science 297: (2002)

11 Algunos ejemplos P53 mutado se ha encontrado en menos de la mitad de los cánceres de colon inestables genéticamente. Nature 392:300 (1998) Sólo 12% de los cánceres de mama primarios contiene kinasas mutadas. Casi todos lo cánceres son aneuploides y tienen centrosomas anormales Cell Motil Cystoskel 41:281 (1998) Cancer Res 58:3974 (1998) Cell cycle 3: (2004) Science 284:2089 (1999) Nature Genet 20:189 (1998) Sólo 2 de 19 cánceres de colon aneuploides contienen el gen checkpoint mutado. Nature 392:300 (1998) The Aneuploidy-Cancer theory The Aneuploidy-Cancer theory Aneuploidía al azar Propone que el cáncer es causado por la dosificación anormal de miles de genes normales Estado de Aneuplodía Esta dosificación anormal de genes es generada por la ganancia o pérdida de cromososmas específicos o segmentos de cromosomas, alias aneuploidía Desestabiliza genes y cromosomas Des balance en grupos de proteínas que segregan, sintetizan y reparan cromosomas Proc Natl Acad Sci USA 94: (1997) Biochem J 340: (1999) Proc Natl Acad Sci USA 97: (2000) Cell Motil Cystoskel 47: (2000) Cell cycle 2: (2003) IUBMB life 56:65-81 (2004) Nature Biotechnol 21:13-14 (2003) GENES VII (Lewin B.) Near diploid (2n) Baja inestabilidad Cell cycle 3: (2004) Reordenamientos y acortamientos cromosómicos Near triploid (3n) Alta inestabilidad y adaptabilidad Muerte celular por aneuplodía: Nulisomias Acortamientos cromosómicos no viables Mutaciones letales

12 The Aneuploidy-Cancer theory Cuál es el origen de la aneuplodía? The Aneuploidy-Cancer theory Hipodiploidía Indice de ADN Ganancia o pérdida cromosómica durante la división celular: Espontánea Inducción química Mutat Res. 410:3-79 (1998) Biochem J. 340: (1999) La hiperdiploidía prima sobre la hipodiploidía Hiperdiploidía Límite para viabilidad Indice de ADN mayor a = triplodía 2.0 = tetraploidía Cytometry 22: (1995) Biochem J. 340: (1999) The Aneuploidy-Cancer theory Relevancia Clínica de la Aneuploidía en cáncer Aneuploidía Aneuploidía Célula no cancerosa Bajo el límite para el cáncer Célula cancerosa Se alcanza o sobre pasa el límite para el cáncer (en forma gradual o abrupta) 1. Malignidad es proporcional al grado de aneuplodía 2. Aneusomias cáncer específico 3. Terapia y prevención del cáncer basada en a neuploidía precancerosa. Cytometry 22: (1995) Biochem J. 340: (1999)

13 INMUNOFENOTIPIFICION CELULAR Caracterización Morfológica celular y funcional: Conceptos generales de células eucariontes y procariontes. Microscopia luz, epifluorescencia, electrónica, anticuerpos monoclonales, Técnicas ópticas (láser). marcadores proteicos/enzimáticos. Cáncer: Secuencia de mutaciones Teoría de la aneuploidía Caracterización fenotípica Microscopio óptico Microscopio electrónico Microscopio epifluorescencia Anticuerpos ELISA Citometría de Flujo Southern blot Northen blot Western blot PCR FISH Sky Microarray Utilidad clínica Próxima reunión: Relevancia clínica de la aneuploidía en cáncer Ejemplos clínicos Caracterización genotípica IMPACTO CLINICO DE LA INMUNOFENOTIPIFICION CELULAR IV: Ciclo celular en estados neoplásicos y preneoplásicos. T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N. Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda. Laboratorio de Citometría de Flujo Hospital del Trabajador, Concepción, Chile.

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