INMUNOFENOTIPIFICION CELULAR T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N.

Tamaño: px

Comenzar la demostración a partir de la página:

Download "INMUNOFENOTIPIFICION CELULAR T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N."

Ángel Botella Soto
hace 8 años
Vistas:

1 INMUNOFENOTIPIFICION CELULAR T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N. Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda. Laboratorio de Citometría de Flujo Hospital del Trabajador, Concepción, Chile.

Laboratorio de Citometría de Flujo Hospital del

2 Fenotipo Genotipo

5 Fenotipo: Caracterización Microscopio óptico

6 Peripheral Blood Film Magnification x100

7 Myeloid maturation myeloblast promyelocyte myelocyte metamyelocyte band neutrophil MATURATION

8 Hematopoiesis PLURIPOTENT STEM CELL MIXED PROGENITOR CELL COMMITTED PROGENITOR CELL RECOGNIZABLE BONE MARROW PRECURSOR CELL MATURE BLOOD CELL BFU-E/CFU-E CFU-GM pronormoblast myeloblast monoblast red cell neutrophil monocyte CFU-Eos eosinophil myeloid progenitor cell CFU-Baso CFU-Meg megakaryocyte basophil platelet pluripotent stem cell pre-t lymphoblast T-cell lymphoid progenitor cell pre-b lymphoblast B-cell & plasma cell

neutrophil monocyte CFU-Eos eosinophil myeloid progenitor cell CFU-Baso CFU-Meg megakaryocyte basophil

9 USE OF HISTOCHEMISTRY TO DETECT INFECTIOUS ORGANISMS Gram s stain to detect bacteria in tissue (oil immersion x1000) Silver stain (GMS) to detect presence of fungal hyphae in tissue x200

10 MORE EXAMPLES OF HISTOCHEMISTRY Luxol Fast Blue for myelin Fontana-Masson for melanocytes

11 Mucin stained and H&E stained colon

12 Fenotipo: Caracterización Microscopio electrónico

19 Antibodies Polyclonal Antibodies that are collected from sera of exposed animal recognize multiple antigenic sites of injected biochemical. Monoclonal Individual B lymphocyte hybridoma is cloned and cultured. Secreted antibodies are collected from culture media recognize ONE antigenic site of injected biochemical

Monoclonal Individual B lymphocyte hybridoma is cloned and cultured.

20 Typing Blood: An Example of Agglutination Anti A Antibody Anti B Blood Type A B AB O

21 Type Bacteria by Agglutination E. coli and Salmonella O antigens = LPS H antigens = flagella Example: E. coli O157:H7

22 Hybridoma 1975 Kohler and Milstein Fusions generated by Sendai virus or PEG Multiple myeloma (human disease) Bence Jones proteins in urine

23 R e la t iv e I n t e n s it y Wavelength 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Fluorescein (FITC) Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Protein

24 R e la t iv e I n t e n s it y 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Propidium Iodide Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm DNA

25 Fenotipo: Caracterización Microscopio epifluorescencia

26 Immunofluorescence Antibody binds to slide at site of antigen.. Adding of a suppressed fluorescent flag or secondary antibody. light

27 Immunofluorescense IFA of Ehrlichia chaffeensis in DH82 cells, 400X Bullous pemphgoid with linear deposits of IgG at dermal-epidermal junction Very good rapid diagnostics skin.html

29 About 25-30% of women who have metastatic breast cancer overexpress HER-2 (EGF) receptor Determination of HER2-protein overexpression (semiquantitative DAKO Hercep Test ) Fluorescence in situ hybridisation (FISH) of HER2 amplification facets/9/herc.htm

30 Fenotipo: Caracterización Microscopio óptico Microscopio electrónico Microscopio epifluorescencia Anticuerpos

32 ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) to Detect Antibody Antigen Sample Substrate 2 Antibody Enzyme Linked Detection

33 ELISA to Detect Antigen 1 Antibody Sample Substrate 2 Antibody Enzyme Linked Detection

35 FLOW CYTOMETRY

36 CITOMETRIA DE FLUJO: APLICACIONES Hematología Inmunología Patología Transplantes Farmacología Biología Toxicología Microbiología Parasitología Citogenética Virología

37 CITOMETRIA DE FLUJO: Aplicaciones Clínicas más Frecuentes Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular Estudio de macrófagos intestinales (EII). Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio, fagocitosis, etc.) Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.) Cuantificación de moléculas Estudio de Células Progenitoras (CD34) Estudios de Función Plaquetaria Estudios de Resistencia a Drogas Estudio de Citokinas Intracelulares

38 Fenotipo: Caracterización Microscopio óptico Microscopio electrónico Microscopio epifluorescencia Anticuerpos ELISA Citometría de Flujo

39 Southern Blot DNA DNA es extraído desde las células y es localizado en pocillos haciéndose migrar como un gel de electrofóresis. El ADN es transferido a una membrana (nitrocelulosa), para luego ser teñido.

40 Southern Blot: Resultados

41 Western Blot Protein Proteínas extraídas desde células, son dispuestas en pocillos, haciéndose migrar como un gel de electrofóresis. La proteína es transferida desde el gel a una membrana (nitrocelulosa). Finalmente se adicionan anticuerpos contra la proteína, los cuales luego son evidenciados (anticuerpo secundario conjugado, enzima, molécula radioactiva o fluorescente).

42 Western Blot

43 Western Blot Results

44 Northern blot RNA RNA extraído desde células se dispone en pocillos, haciéndose migrar como un gel de electrofóresis. El RNA es transferida desde el gel a una membrana (nitrocelulosa) para luego ser teñido.

45 Northern Blot

46 PCR Polymerase Chain Reaction Secuencias génicas específicas (DNA o RNA) son replicadas y amplificadas para una posterior secuenciación u otro análisis.

48 Polymerase Chain Reaction

49 Fenotipo: Caracterización Microscopio óptico Microscopio electrónico Microscopio epifluorescencia Anticuerpos ELISA Citometría de Flujo Southern blot Northen blot Western blot PCR

50 Caracterización fenotípica Microscopio óptico Microscopio electrónico Microscopio epifluorescencia Anticuerpos ELISA Citometría de Flujo Southern blot Northen blot Western blot PCR Utilidad clínica Caracterización genotípica

51 Caracterización fenotípica y genotípica Caracterización fenotípica y genotípica Utilidad clínica Utilidad clínica

53 Infección VIH-SIDA

54 CLASIFICACION INMUNOFENOTIPICA (LA) LLA-B : LLA-T : LMA : -BI-pro B: CD79a y/o CD22 Y/o CD19. -BII Común : CD10. -BIII Pre B: clg. -BIV Madura : slg -TI-proT: CD7 -TII-pre T: CD2 y/o CD5 y/o CD8 -TIII-Cortical: CD1a -IIV-Madura: CD1a y CD3mb -LMA-M6 : glicoforina A -LMA-M7 : CD61, CD41, CD42b -LMA-M3 : HLA-DR(-) -LMA-M4 : HLA-DR(+)

55 ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL Espectro de presentación. Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn Alteración de la inmunoregulación de mucosa intestinal Inflamación persistente y/o recurrente Congestión ulcerativa Granulomatosa Cáncer

56 Colon normal C.U. Crohn Crohn

57 ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn Estudios celulares de mucosa intestinal (CF): Células epiteliales Macrófagos Linfocitos: TCD4 C.P.A. Moduladores Perpetuación Induction and Modulation of Gastrointestinal Inflamation FALK Symposium 104, Amsterdam, 1999.

58 Marcadores de superficie en MI que se encuentran alterados en EII CD16 Receptor de IgG (Fc γ RIII) HLA-DR Se expresan en: LB Monocito CD54 Macrófago Receptor para ICAM-1 Células dendítricas CD80 y CD86 Interactúan con receptores de CD28 de LT

59 Fenotipo de MI Mediante Inmunohistoquímica Mucosa HLA-DR CD16 CD54 CD25 CD68 CD80, CD86 CD11b Normal 20-30% Ausente 7% Ausente Ausente Ausente 5% EII Presente Presente C.U. 70% Crohn 46% C.U. Presente Crohn ausente Presente Presente Presente Mahida YR et al. Gut.1989;30: Roggler G. et al. In:Innovative Concept in IBD.Kluwer Acad. Publishers 1999 pps.:

60 Cambios en células neoplásicas Transformación 1. Cambios morfológicos 2. Transplantabilidad 3. Disminución de la inhibición por contacto 4. Capacidad proliferativa infinita 5. Tumorgenicidad

61 Cambios en células neoplásicas Cambios en membrana 1. Comunicación celular 2. Alteraciones en el transporte 3. Enzimas de superficie 4. Antígenos de superficie Cambios bioquímicos Cambios en el cariotipo

62 Comparison of a typical normal (A) and malignant (B) cell. CEA, carcinoembryonic antigen, AFP, alpha-fetoprotein Comparison of a typical normal (A) and malignant (B) cell. CEA, carcinoembryonic antigen, AFP, alpha-fetoprotein

63 Changes in tumor marker concentration during the course of disease MAbs to serum Tumor marker Disease monitoring : cancer_tm_overview_lg.html

64 Genética del cáncer: Clases de genes implicados en el cáncer Oncogenes Genes supresores Genes reparadores de DNA

65 Genes supresores Oncogenes Genes reparadores de ADN

66 Oncogenes accionan el acelerador Genes supresores actúan como frenos

67 LOH (Loss of Heterozygosity) Pérdida de heterozigocidad. Pérdida de una copia normal de un gen (puede dejar sólo una copia mala )

68 Tumor suppressor p53: guardian of the genome (Inactivado en la mayoría de los tumores por mutación y LOH) (apoptosis)

69 Tumor suppressor p53

70 La inestabilidad genómica puede ser identificada por citometrái de flujo. Numero de células Normal Tetraploide Aneuploide Diploide < 6% > 6% 2N 4N 2N 4N 2N DNA/Célula

71 Tetraploidía predispone a la Aneuploidía en EB Citometría de flujo Normal N= 90 pacientes Progresando a aneuploidía 8/74 (11%) Tetraploide P < /16 (69%) Intervalo promedio entre tetraplodía y aneuploidía: 17 meses Galipeau et al, Proc Nat Acad Sci USA 1996; 93:

72 INMUNOFENOTIPIFICION CELULAR Caracterización Morfológica celular: Conceptos generales de células eucariontes y procariontes. Alcances históricos. Microscopia luz, epifluorescencia, electrónica. Tinciones y marcadores celulares de estructuras. Caracterización morfofuncional celular: Anticuerpos monoclonales. Técnicas ópticas (láser). Marcadores proteicos/enzimáticos. Expresión génica. Alcances clínicos: Inmunodeficiencias. Enfermedades crónicas inflamatorias. Pre neoplasias y neoplasias.

73 INMUNOFENOTIPIFICION CELULAR T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N. Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda. Laboratorio de Citometría de Flujo Hospital del Trabajador, Concepción, Chile.

Documentos relacionados

QUE ES LA CITO / METRIA DE FLUJO?

QUE ES LA CITO / METRIA DE FLUJO? Inmunofenotipificación Celular: Leucemias y Linfomas por Citometría de Flujo Juan Luis Castillo N., T.M. MsC Laboratorio de Citometría de Flujo Hospital del Trabajador Concepción. Departamento de Especialidades