LEUCEMIAS AGUDAS CLASIFICACION, DIAGNOSTICO, TRATAMIENTO Y APORTACION DE LAS NUEVAS TECNICAS DIAGNOSTICAS

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1 LEUCEMIAS AGUDAS CLASIFICACION, DIAGNOSTICO, TRATAMIENTO Y APORTACION DE LAS NUEVAS TECNICAS DIAGNOSTICAS Carolina Martínez Laperche FIR 3 Año de Análisis Clínicos

2 LEUCEMIAS AGUDAS EN LA INFANCIA

3 NUEVAS TECNICAS DIAGNOSTICAS CITOMETRIA DE FLUJO CITOGENETICA BIOLOGIA MOLECULAR

4 CITOMETRIA DE FLUJO FUNDAMENTOS: Análisis celular multíparamétrico. Complejidad(SSC) Tamaño(FSC)

5 Se analizan dos tipos de parámetros: 1.Características intrínsecas de la célula: tamaño y complejidad de núcleo y citoplasma, mediante dispersión.

6 2.Características antigénicas de cada célula (inmunofenotipo): Se determina mediante fluorescencia, esta procede de uniones Ag-Ac unido a un fluorocromo fluorescente anti- CD 10 CD 10

7 IMPORTANCIA DE LA CFM EN LAS LEUCEMIAS Permite el diagnostico mas completo y una mejor tipificación de las leucemias. Permite predecir determinadas alteraciones genéticas. Identifica marcadores que implican peor pronóstico. Identifica fenotipos patológicos que permiten seguimiento y detección de enfermedad mínima residual.

8 CFM: LEUCEMIA AGUDA POBLACION MIELOIDE MONOCITOS BLASTOS LINFOCITOS

9 VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO Análisis de múltiples parámetros en una misma célula. Rapidez: 5000 células /segundo. Específico: distingue distintas poblaciones celulares. Cuantifica la intensidad antigénica. Sensible ( 1 célula / 10000) y objetivo.

10 APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA: 1.Detección y cuantificación de Ag celulares: Estudio de subpoblaciones linfocitarias Inmunofenotipaje de leucemias y linfomas. Inmunodeficiencias. Trasplante: subpoblaciones de linfocitos y recuento de progenitores hematopoyéticos (CD34). Inmunofenotipaje de plaquetas. Enfermedades autoinmunes. 2.Cuantificación de ácidos nucleicos.

11 Cuantificación del número de linfocitos T CD4 en pacientes con HIV CD4 T cells CD8 T cells

12 CITOGENÉTICA Estudio de los cromosomas y las enfermedades relacionadas Causadas por una alteración en el número y/o estructura de los cromosomas Tiene interés diagnóstico y pronóstico

13 ANALISIS CITOGENETICO Citogenética convencional: Estudio de alteraciones cromosomicas en las metafases de las células tras el cultivo in vitro Se suele teñir con Banda G ( Tripsina- Giemsa) Detecta alteraciones en todo el genoma Citogenética molecular : FISH Hibridación de una sonda de DNA marcada con una sustancia fluorescente sobre la secuencia complementaria del genoma Metafase poca calidad o alteraciones cromosomicas crípticas

14 CITOGENETICA CONVENCIONAL Y FISH Citogenética convencional Ventajas Permite análisis de todo el genoma Técnicamente sencillo Bajo coste Inconvenientes Cromosomas metafasicos Requiere material fresco Interpretación personal experimentado FISH Ventajas Permite la localización de secuencias especificas Técnicamente sencillo No necesita material fresco No necesita metafases, puede analizar nucleos en interfase Detecta alteraciones pequeñas con cromosomas de mala calidad Inconvenientes Coste Solo aporta información de la región estudiada, no sirve como técnica de screening

15 PRINCIPALES ALTERACIONES CROMOSOMICAS EN LAL numéricas 50 cromosomas NUMERICAS Mas frecuente Pronostico favorable estructurales ESTRUCTURALES

16 GENES INVOLUCRADOS EN ANOMALIAS CROMOSOMICAS Pronostico desfavorable Mas frecuente Pronostico desfavorable

17 LEUCEMIA AGUDAS LINFOBLASTICAS FAVORABLE INTERMEDIO DESFAVORABLE HIPERPLOIDIA (>50) t (12;21) y del (12p) en niños HIPERPLOIDIA (47-50) CARIOTIPO NORMAL del (6q) t (1;19) t (8;14), t (2;8), t (8;22) CASI-HAPLOIDE * t (9;22) t (4;11)

18 UTILIDAD DE LA CITOGENETICA EN LA DIAGNOSTICO: 1. La clasificacion de la OMS(2001) incluye algunas anomalias geneticas PRONOSTICO: 1. Asociacion emtre anomalias citogeneticas y grupos pronosticos TRATAMIENTO: 1. Algunas anomalías genéticas condicionan el tratamiento LMA con t (15;17) ATRA LAL con t(9;22) GLIVEC

19 BIOLOGIA MOLECULAR Técnicas Aplicabilidad Coste Disponibilidad Uso clínica SOUTHERN BLOT - BAJO BAJA TRASLOCACION PCR convencional +++ BAJO ALTA TRASLOCACIONES Análisis cualitativos MUTACION PUNTUAL EXPRESION PCR TIEMPO REAL Análisis cuantitativos GRAN AVANCE DIAGNOSTICO DE LEUCEMIAS ++++ INTERME DIO ALTA CUANTIFICACION EXPRESION TRASLOCACION MUTACION PUNTUAL SECUENCIACION Investigación ++ ALTO INTERMEDIA NUEVAS MUTACIONES

20 TRATAMIENTO

21 CONDUCTA ANTES DE QUIMIOTERAPIA Tratamientos de soporte: para minimizar efectos tóxicos inmediatos del tto. -profilaxis y tratamiento de infecciones. -corrección de desequilibrios metabólicos. -prevención de síndrome de lisis tumoral (SLT) con hiperhidratacion con solución glucosalina para aumentar la diuresis. SLT -HIPERURICEMIA. -HIPERPOTASEMIA. -HIPERFOSFATEMIA -HIPOCALCEMIA -prevención y tratamiento de la nefropatia urática con Rasburicasa iv de 3-7 días con suero salino fisiológico. Solo excepcionalmente será necesario hemodiálisis.

22 PRIMEROS TRATAMIENTOS Antes años 50: supervivencia 5 meses Años 50: Mercaptopurina, Ciclofosfamida, corticoides 60-70: Antraciclicos, Asparraginasa, Epipodofilotoxinas 70: Skipper: Poliquimioterapia Se empezaron a aplicar protocolos de quimioterapia 80: Tratamientos cada vez mas individualizados (según el riesgo) Supervivencia: 70% a los 7 años

23 SITUACION ACTUAL Y el 30%????? Elegir tratamiento estándar o supraintensivo Nuevos tratamientos para las recaídas Analizar factores de peor pronostico Factores que conllevan alto riesgo: 10% No alcanzan RC tras 4-5 semanas de tto >25% blastos en MO +14 < 1 Año >200000/ul leucocitos Portadores de t (9;22) t (4;11) EMR > 1% en MO después 5 semanas de tratamiento Uso de tratamientos supraintensivos

24 PROTOCOLOS DE QUIMIOTERAPIA DOS PROTOCOLOS: PETHEMA Y SHOP. FASE DE INDUCCION: 3 drogas que intentan conseguir una remisión completa (< 5% blastos en MO). RC: Recuperacion de la actividad medular con: -Hb > 10 g/dl. -granulocitos > 1.5 x 10 9 /l. -plaquetas > 120 x 10 9 /l. -MO NORMOCELULAR o < 5% blastos. -LCR sin blastos. -EMR< 1 % después del tratamiento de inducción. -FASE DE CONSOLIDACION/INTENSIFICACION. -FASE DE MANTENIMIENTO. -QUIMIOTERAPIA INTRATECAL

25 TRASPLANTE DE PRECURSORES HEMATOPOYETICOS El TPH alogénico en LAL se reserva solo a pacientes de muy alto riesgo que: 1.Día +14 MO :> 10% blastos en el examen citomorfológico. 2.Día +35 MO : 5 % blastos y/o EMR (punto 1) 1% células de fenotipo leucémico. 3.Después 1 ciclo tratamiento CI si EMR (punto 2) >0.1%. 4.Después 2 ciclo tratamiento CI si EMR >0.01%. Hasta encontrar donante sigue una pauta de tratamiento: REINDUCCION CON INTENSIFICACION MANTENIMIENTO CON REFUERZO.

26 TRASPLANTE DE CPH 1.Pasos para decidir TCPH: Selección del receptor. Estudio D-R compatibilidad HLA. Tipo de trasplante y fuente de CPH. Régimen de acondicionamiento Ejecucción del trasplante. Seguimiento paciente trasplantado.

27 2.Tipos de trasplante Alogénico: HLA compatible familiar o no. Eliminar hematíes y plasma (ABO) y linfocitos T ( EICH). Singénico: donante y receptor gemelos homocigotos. Autólogo o autotrasplante MO.

28 3.Fuentes de CPH. Medula ósea Cordón umbilical Hígado fetal Sangre periférica EN 90% T AUTOLOGOS EN 30% T ALOGENICOS. Ventajas de SP como fuente de CPH: -Disminuye morbilidad y mortalidad. -Recuperación hematológica mas precoz. -Coste económico menor.

29 AFERESIS: Recolección de CPH Administración de fármacos al donante que movilicen precursores a la circulación (G- CSF) 5 días Pre-Aféresis: contaje CD34 en SP Aféresis: Se usan separadores celulares de flujo continuo por selección positiva de CD34+ usando AC monoclonales contra Ag CD34+.

30 LABORATORIO: CONTAJE CD34 POR CITOMETRIA Recuento rápido y reproducible de (CD34). Mínimo de células CD34+ que garantice repoblación de MO 2 x 10 6 /Kg células CD34: injerto estable. Relación directa CD34+ infundidas y recuperación hematológica postrasplante.

31

32 PERSPECTIVAS FUTURAS: Detectar resistencias celulares a citostáticos Características farmacológicas de citostáticos Disminuir toxicidad de transplantes de progenitores hematopoyéticos Disminuir toxicidad de quimioterápicos sin perder eficacia Nuevos tratamientos biológicos

33 ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL Persistencia de un clon anormal de células en niveles bajos, durante o tras finalizar tratamiento de inducción, consolidación o mantenimiento. Estas células residuales deben tener un inmunofenotipo y/o citogenética igual al de las células al diagnostico. Esto ha llevado a un cambio en el concepto de remisión completa la cual se realiza en función de EMR y no de el numero de blastos en MO. La presencia de EMR postinducción es uno de los factores pronósticos mas importantes por su asociación a las recaídas.

34 EMR. TECNICAS Sensibilidad: 1-5/10 2 Morfología Citogenética convencional Sensibilidad: 1/10 3 FISH Sensibilidad: 1/10 4-1/10 5 PCR : Reordenamientos específicos TCR/ IgH (LLA) CFM (Citometría de flujo multiparamétrica)

35 EMR. CITOMETRÍA A DE FLUJO PASOS: MULTIPARAMÉTRICA TRICA En el momento del diagnóstico: 1. Inmunofenotipos Leucémicos (IFL) 2. Diseñar paneles de seguimiento específicos Durante el seguimiento: 3. Obtención de muestras adecuadas 4. Aplicación de los paneles de seguimiento 5. Adquisición: Live gate

36 EMR. CFM Características de la muestra Aspirado medular Debe ser representativo de médula ósea aspirado enérgico 1,5 ml de muestra evitar la dilución con sangre medular Procesar en < 24 horas Evitar pérdidas selectivas de células

37 EMR. CMF Inmunofenotipo leucémico al diagnóstico: CD19+CD34+CD10- y CD19+CD20-CD10-

38 EMR.CMF Post-Inducción: 0,14% de células CD19+CD13+ (histogramas 1 y 2). Post-Consolidación: EMR no detectable (histogramas 3 y 4). Inmunofenotipo leucémico al diagnóstico: CD19+CD13+.

39 EMR. LLA-B B MLL+ CD19-PC5 CD20-PC5 CD20-PC5 Normal SSC CD10-FITC CD10-FITC IFL: CD19+ CD20- CD10- (LAL Pro-B) EMR: 1,43%

40 PROTOCOLO LAL-RA Inducción TCPH? DIA + 14 MO >10% BLASTOS MO < 10% BLASTOS TCPH? MO >5% Y EMR >1% MO< 5% y EMR <1% DIA + 35 Consolidación Intensificación 1 ciclo No RC O EMR>0,01% C+I 2 Ciclo TCPH? EMR<0,01% EMR>0,01% RC Y EMR< 0,01% Consolidación Intensificación 2 ciclo Reinducción Mantenimiento

41 Estudio EMR 2 objetivos: 1. Conocer velocidad de destrucción de la masa leucémica, factor pronostico fundamental para cambiar decisiones terapéuticas 2. Predecir cualquier recaída antes de la aparición de manifestaciones clínicas

42 EMR en LLA. Conclusiones La persistencia de EMR durante el tratamiento tiene un valor pronóstico adverso independiente de otras variables Cantidad de EMR significativa: Post-tratamiento de Inducción: 0,1% Durante el resto del tratamiento: 0,01% Muy mal pronóstico: Pacientes con EMR 1% post-inducción EMR persistente Muy buen pronóstico: EMR- post-inducción y post-consolidación EMR- precozmente (d. 19)

43 EVOLUCION DE LA EMR Día Día + 1

44 MUCHAS GRACIAS

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