ANÁLISIS CITOGENÉTICO

Transcripción

1 ALTERACIONES CROMOSÓMICAS MICAS NUMÉRICAS ANÁLISIS CITOGENÉTICO TICO Dra. Graciela González Laboratorio de Citogenética tica y Evolución Depto.. de Ecología, Genética y Evolución Fac.. de Ciencias Exactas y Naturales, UBA

2 ALTERACIONES CROMOSÓMICAS MICAS NUMÉRICAS Cambios en el número cromosómico de una especie Nulisómicos (2n - 2) Aneuploides Monosómicos (2n - 1) Trisómicos (2n + 1) Tetrasómicos (2n + 2) Euploides Haploides (n) Poliploides (3n, 4n, 5n )

3 Aneuploides El número de cromosomas difiere del tipo silvestre debido a uno o más cromosomas extras o ausentes,

4 Causas de la Aneuploidía - Por retraso de cromosomas en meiosis o mitosis que conlleva a su pérdida en Anafase. Estos cromosomas se pierden (micronúcleos). Zea Allium cepa - Por No disyunción de cromosomas homólogos (meiosis) o de cromátidas hermanas (mitosis o meiosis II) que migran juntos hacia un polo. Segregación anormal. - Por Translocación Robertsoniana - Por Pérdida de centrómero

5 Aneuploidías La Aneuploidía se puede observar frecuentemente en células cancerosas. - Las nulisomías (2n-2) 2) en general en animales son letales. - Las monosomías (2n-1) son generalmente letales. En humanos: Síndrome de Turner, la monosomía para el X es viable (mujeres talla baja, cuello corto, gónadas rudimentarias, ausencia de menstruación y son estériles). - Las trisomías (2n+1) son, en general, más viables. Trisomías autosómicas. En humanos, la del cromosoma 21 Síndrome de Down

6 Aneuploidías Trisomías autosómicas micas: La del cromosoma 18 (síndrome de Edwards) y la del cromosoma 13 (síndrome de Patau), quienes las poseen presentan múltiples malformaciones congénitas y, en general, no sobreviven más allá del año de edad. Las trisomías de los cromosomas sexuales (más toleradas) El síndrome triple X: X en 1/1.000 mujeres vivas que son fenotípicamente normales. El síndrome de Klinefelter XXY: en 1/1.000 varones vivos Fenotipo: talla alta, extremidades muy largas, valores de testosterona bajos, vello escaso, caderas anchas y son estériles. El síndrome XYY: en 1/1.000 varones, son fértiles. Pueden existir combinación de varios tipos de aneuploidías como doble monosómico, mono-trisómico, etc.

7 Euploidía Variación en el número del complemento completo de cromosomas. Haploidía (n). Poliploidía (3n, 4n, 5n, 6n, etc.) X=4 Número básico (x): Es el número menor de cromosomas con la información necesaria para que el organismo sea viable.

8 Euploidía: Haploides (n) Un individuo haploide sólo tiene un complemento cromosómico completo y su contenido en ADN es igual al valor C de su especie. En la meiosis todos los cromosomas estarán en forma de univalentes y sus gametas serán inviables. Los haploides pueden aparecer de forma natural (partenogénesis o eliminación cromosómica de un juego entero en híbridos) o generarlos artificialmente (cultivo de antera y de microsporas). Meiosis de Maíz Haplóide Diacinesis Metafase I Metafase II Tetrada En la naturaleza la haploidía es un estado normal en los hongos, en la fase gametofítica de las plantas inferiores y en animales en los machos de las especies con determinismo sexual por haplodiploidía (abejas, hormigas, peces).

9 En mejora genética: Obtención de Doble-haploides Al duplicar un haploide tenemos un individuo totalmente homocigota para todos los genes. Es de importancia en la mejora ya que obtener líneas isogénicas u homocigotas a partir de un híbrido lleva muchas generaciones. En maíz se obtienen plantas haploides por inducción de la división mitótica de la ovocélula (fertilizándola con una línea masculina inductora de haploidía). La colchicina (Colchicum autummnale L.) inhibe la formación del huso acromático y las cromátidas hermanas no migran hacia los polos. No se forma la membrana plasmática (entre las dos células hijas), dando lugar a la duplicación del complemento cromosómico completo. Las regiones meristemáticas de estas plantas haploides se tratan con colchicina para duplicar su número cromosómico. Los dobles haploides tienen dos juegos de cromosomas idénticos a los del haploide y pueden formar ovocélulas y núcleos espermáticos viables. Ej.: en cebada. centeno, sorgo, arroz, maíz, algodón, alfalfa, tabaco, girasol, etc.

10 Poliploides (organismos con más de dos juegos cromosómicos completos) Clase Origen Constitución Genómica Autopoliploide Alopoliploides Dentro de una misma población Individuos de especies distintas (relacionadas) AA AA AA BB Los Autopoliploides se originan: -Por fallas en la meiosis que llevan a la formación de gametas no reducidas. -Por la fecundación de un óvulo por dos gametas masculinas. - Por la formación de quimeras o mosaicos poliploides por problemas en la mitosis que, afectando a la línea germinal, originan gametas poliploides.

11 Autopoliploidía Especiación autopoliploide Autotetraploides Un autotriploide Gameta haploide X Gameta no reducida (n) Cigoto (3n) (2n) Un diploide X un tetraploide (gametas n) (gametas 2n) Cigoto (3n) Los autotriploides son estériles y algunos se propagan vegetativamente. Ejemplos de autotriplodes: la banana, la sandía sin semilla. Tetraploide 2n=4x=12 Fértil No disyunción Gametas 2n=6 2n=6 Autopolinización Ejemplos de autotetraploides: alfalfa, papa, algodón, café, maní.

12 En las plantas la poliploidía se encuentra muy extendida dentro de las angiospermas (aprox. un 70% de las especies vegetales son poliploides) Planta Nº cromosómico básico Número cromosómico Nivel de ploidía. avena x maní x caña de azúcar x banana 11 22,33 2x,3x papa x tabaco x algodón x manzana 17 34,51 2x,3x ALOPOLIPLOIDÍA: Hibridación entre 2 especies distintas y posterior duplicación cromosómica Especiación híbrida poliploide. Poliploides conviven con antecesores. Especies morfológicamente similares, con distintos nivel de ploidía, están aisladas reproductivamente. COMPLEJOS POLIPLOIDES Nivel de Ploidía Rango de variación en caracteres morfológicos

13 PALEOPOLIPLOIDE ZEA 2n=20 X=5 2n=10 Con genomas similares Extintos

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15 CITOGENETICA CITOTAXONOMÍA La citotaxonomía supone que a medida que más caracteres cariotípicos son compartidos por dos grupos, más estrechamente relacionados que deberían ser. El cariotipo es la expresión fenotípica más inmediata del genoma, independiente de efectos que puedan distorsionar la expresión de un carácter (medio ambiente, etapas del desarrollo, efectos epigenéticos, etc.). Por lo tanto, los caracteres citogenéticos deberían ser más fiables que otro tipo de carácter fenotípico. Aunque, el análisis del cariotipo esta sujeto a errores técnicos y de interpretación. El análisis citotaxonómico, empleando métodos clásicos y citomoleculares, demostró que el cariotipo puede proporcionar información esencial para la comprensión de la evolución y filogenia de ciertos grupos de plantas y animales.

16 Cariotipo Apariencia fenotípica de los cromosomas en metafase mitótica -Número básico (x), número gamético (n) y número somático (2n) -Tamaño absoluto y relativo de los cromosomas -Posición de los centrómeros (IC) -La simetría del cariotipo -Número y posición de las regiones organizadoras del nucleolo (NOR) -Cantidad y distribución de heterocromatina (bandeos cromosómicos) -Tamaño del genoma (contenido de ADN) - Localización física de secuencias (FISH) Si bien cariotipo es constante en las especies suelen ocurrir variaciones estructurales que cambian el tamaño y la posición centromérica de los cromosomas y así también la simetría del cariotipo Estas variaciones son dinámicas y no están relacionadas con complejidad genética u organísmica.

17 Tamaño del genoma El valor C es la cantidad de ADN por genoma haploide no replicado (en fase G1). Valor C: AA AAAA A AA Valor Cx: contenido de ADN del genoma básico AAAA A El valor C, en un contexto filogenético, permite analizar los mecanismos involucrados en la evolución cromosómica. Se mide por microdensitometría (Feulgen) o citometría de flujo 1 pg= 10-12gr 1Mb=10 6 pares de nucleótidos 1pg= 965 Mb La paradoja del valor C No existe relación entre el contenido en ADN (valor C) y la posición que una especie tiene en la escala evolutiva. Existen especies con una complejidad evolutiva semejante que presentan una enorme variación en la cantidad de ADN.

18 EL TAMAÑO DEL GENOMA NO AUMENTA CON LA COMPLEJIDAD EVOLUTIVA Arabidopsis Moss Rice Tomato Soy Human Una pequeña porción del genoma posee genes funcionales DNA repetido Menor Complejidad Canola Potato Mayor Complejidad Grass Corn Genes funcionales Wheat En las plantas, el tamaño del genoma está relacionado con diversas características fenotípicas y fenológicas (volumen cromosómico, tamaño nuclear, diámetro del grano de polen, etc.), y en varios grupos se lo ha relacionado con: la longitud del período vegetativo, biomasa, posibilidades de crecer en condiciones ambientales adversas, etc.

19 TASA METABOLICA TAMAÑO CORPORAL COMPLEJIDAD ORGANISMICA TASA DE DESARROLLO TAMAÑO CELULAR DIVISIÓN CELULAR TAMAÑO DEL GENOMA MUTACIONES CROMOSOMICAS DUPLICACIONES INSERCIONES DELECIONES ELEMENTOS TRANSPONIBLES OTROS MECANISMOS MOLECULARES

20 En Angiospermas se ha encontrado un amplio rango de variación independientemente del nivel de ploidía (0,1-128 pg) Diversidad intergenérica, interespecífica e intraespecífica. Esta variación no está relacionada con la complejidad organísmica, ni es explicable por diferencias en el número de genes funcionales PARADOJA O ENIGMA DEL VALOR C 2x (0,7 pg) Bulnesia sarmientoi 8x (2,9 pg) Bulnesia bonariensis Arabidopsis thaliana 125 Mb 0.5 pg Fritillaria assyriaca Mb 2x (4,5 pg) Bulnesia retama 128 pg

21 Incremento en Valor C (Obesidad Genómica) Disminución del Valor C Cromosomas B Aumento en el numero de copias de secuencias Repetidas (TE) Poliploidia Recombinacion homologa desigual Recombinacion ilegitima

22 La eucromatina y la heterocromatina En los núcleos interfásicos, la eucromatina se tiñe menos que la heterocromatina debido a su menor grado de enrollamiento. Diferencias en la actividad genéticas: En la eucromatina están la mayoría de los genes activos. La heterocromatina, que casi no contiene genes activos, se localiza en regiones pericéntromericas, teloméricas, incluso hay cromosomas completos heterocromáticos (cromosoma Y de D. melanogater, cromosomas B de maíz). Diferencias citológicas: En los núcleos interfásicos, existe un mayor grado de enrollamiento en la heterocromatina que en la eucromatina. Alociclia: la heterocromatina sigue un ciclo de condensación y descondensación distinto a la eucromatina. La heterocromatina se replica más tarde que la eucromatina.

23 El análisis de la variación cariotípica Tinción convencional (hematoxilina acética, carmín acético, orceína, etc.) Cariogramas -Conteos cromosómicos -Morfología de los cromosomas - Determinación de las asimetrías del cariotipo Confección n de idiogramas - Valores medios de brazos e índices centroméricos (IC) de cada par de cromosomas homólogos (al menos 5 metafases) - Morfología de los cromosomas: M, SM, ST, T (Levan et al.,1964)

24 Identificación cromosómica Técnicas de Bandeo Cromosómico: tratamientos y tinciones de los cromosomas para obtener un bandeo transversal característico sobre los cromosomas. Además, permiten distinguir anomalías cromosómicas (translocaiones, deleciones, etc). Bandeos Clásicos: C, G, R, Q o fluorescentes (DAPI-CMA) Localizan secuencias de ADN altamente repetidas (heterocromatina constitutiva y de regiones NOR) Zea Scilia sp. Técnicas de citogenética molecular FISH Hibridación In Situ Fluorescente Revela la constitución de secuencias de una determinada porción cromosómica.

25 Bandeo C-C cariograma Zea mays ssp. mexicana Bandeo DAPI- idiograma

26 Citogenética tica Molecular (ISH: In situ hybridization) Combinación de la citogenética clásica y la genética molecular Permite conocer la composición de secuencias de una región cromosómica, mapear una secuencia determinada sobre los cromosomas, y revelar las homologías entre las especies a nivel de ADN repetido (heterocromatina constitutiva) Hibridar secuencias de ADN marcado sobre cromosomas o interfases, según su homología. Útil en estudios: Sistemático-taxonómicos Filogenéticos Evolutivos Mejoramiento Genético Biotecnológicos

27 En qué se basa? Entonces. GISH (Hibridación in situ Genómica) Pintado de cromosomas o de parte de ellos, según su homología, con una sonda de ADN genómico total marcado. FISH (Hibridación in situ Fluorescente) Localización de sondas marcadas (de secuencias conocida o no) sobre cromosomas o interfases.

28 GISH: para estudiar las homologías genómicas entre especies - Muestra similitudes entre los genomas a nivel de ADN repetitivo - La distribución n física f de las secuencias repetidas que comparten Afinidades genómicas del maíz con los teosintes (GISH) Z.m.mexicana Z.m.parviglumis Z.m.huehuetenanguensis Z. diploperennis Z. luxurians Z. perennis Metafases mitóticas ticas de Maíz

29 Aplicaciones del GISH En híbridos y poliploides naturales o artificiales: Conocer del origen de un híbrido interespecífico Reconocer los cromosomas de cada especie parental Establecer las relaciones genómicas entre las especies parentales. Estudiar los dominios cromosómicos de los genoma parentales. Detectar cromosomas introgresados y translocaciones. Elymus scabrifolius Solanaceas Hordeum x Secale Croccus DAPI Milium vernale Nicotiana Gibasis GISH

30 Aplicaciones del FISH Localización n física f de secuencias particulares: Mapeos cromosómicos micos Multi-FISH Localización de las secuencias repetidas de los knobs heterocromáticos de maíz y teosintes Azul: Tinción DAPI Rojo: Secuencia knob 180-bp Verde; Secuencia knob TR-1

31 Aplicaciones del ISH: Mejoramiento genético - Localización n física f y genómica de loci transgénicos nicos (FISH + GISH) Transgenes en tabaco - Detección n de introgresiones cromosómicas micas y translocaciones Introgresión de Leymus en Triticum Translocacion intergenómica

32 Aplicaciones del FISH: Clínica: Detección n de Aneuploidías Célula en interfase de líquido amniótico. Trisomía para el crom. 21 (rojo) y par 13 (verde). Detección n de Deleciones Metafase hibridada con una sonda para la Deficiencia de esteroide-sulfatasa, causada por una microdeleción en el X y una sonda de centrómero (control).

33 Multi-GISH Se combinan las marcas de las sondas, los fluorocromos empleados para la detección y los filtros para la observación.

34 DNA FIBER FISH EXTENDIDOS DE HEBRAS DE ADN Se extienden las fibras de ADN sobre portaobjetos. Se hibridan con clones de parte de genes o secuencias específicas muy cortas. Fibras de ADN de trigo hibridadas con los fragmentos EcoRI: HMW-1Dx5 (8.7 Kb) y HMW-1Ax1 (7.0 Kb)

35 Graciela González