Ultrasonido para la detección de Chagas Resumen 1. Introducción

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1 Ultrasonido para la detección de Chagas Mariana, Canton Natalia, Royon Maria Noel Oliva Facultad de Ingenieria, UNSJ Av. Libertador 1109 (Oeste) Capital, San Juan, Argentina Resumen Se presenta el trabajo de investigación sobre el uso de ultrasonido en la detección del Chagas, estudiando y analizando cuales son las características morfológicas y del tejido sanguíneo por el cual decidir si es posible divisarlo mediante técnicas de ultrasonido. Como resultado se descubre que la factibilidad de la utilización de esta técnica esta limitada debido a la elevada frecuencia que se debería utilizar (100mhz). Pero en el trascurso de la investigación se instruye sobre las características del parasito, sus fases intra y extra celulares, su tamaño, su movimiento en el flujo sanguíneo y sobre las técnicas actualmente utilizadas; lo que inducen a seguir avanzando en investigación sobre la posible aplicación de ultrasonido -teniendo en cuenta particularmente el movimiento característico del parasito. 1. Introducción La enfermedad de Chagas, es una enfermedad parasitaria, generalmente crónica, causada por el protozoo flagelado Tripanosoma Cruzi. Se considera que la enfermedad de Chagas es endémica de América. Se estima que son infectadas por la enfermedad de Chagas entre 15 y 17 millones de personas cada año, de las cuales mueren unas La enfermedad tiene mayor prevalencia en las regiones rurales más pobres de América Latina. Reconocida por la OMS como una de las 13 enfermedades tropicales más desatendidas del mundo, y por la OPS como una enfermedad de la pobreza, la enfermedad de Chagas ha sido un azote para la humanidad desde la antigüedad, y sigue siendo un problema relevante social y económico en muchos países de América Latina. En Argentina se han realizado apreciaciones sobre la incidencia de la infección y se han señalado 2.5 millones de personas infectadas con 10 millones de personas expuestas. Debido a esta gran incidencia en Argentina es importante esta investigación de detección de Chagas a través una técnica no invasiva en el área de medicina. El objetivo de esta investigación es analizar si es posible el descubrimiento de la enfermedad de Chagas de una forma temprana para poder prevenir o detener la enfermedad y evitar así del desarrollo hasta llegar una etapa más grave o inclusive la muerte. Para ello se estudian las características morfológicas del tripanosomas cruzy: su tamaño, forma y sus características físicas: su movimiento, sus fases cíclicas para obtener información visible o detectable por ultrasonido de la presencia de la enfermedad de Chagas. Las fases descubiertas del parasito en sangre son tres: tripomastigote (fase extra celular), amastigote (fase intracelular) y Epimastigote (fase intermedia). Estudiar las fases es de gran importancia para analizar la forma o la fase mas conveniente observable con ultrasonido. También se estudian las técnicas actualmente utilizadas: ELISA, HAI, PCR, mediante las cuales se puede detectar el parasito en sangre a partir de los 7 días desde el momento 1

2 de l ingreso del parasito en el flujo sanguíneo, en una concentración de un parasito en 10 microlitros, lo cual se puede ver que es una concentración muy baja y esto hace que la detección del parasito sea compleja. Se ve que el diagnostico que realizan las tres técnicas es tardío y el posible margen de error es grande. Se interioriza particularmente en la técnica óptica que utiliza el contador de hematocritos, su sensibilidad para detectar pequeñas diferencias entre las células, lo que lo hace interesante para detectar las células ya infestadas del parasito y diagnosticarlo en su fase temprana. Se analiza también la aplicación de un array, lo que mejoraría la utilización de la técnica. 2. Desarrollo 2.1 Características del parasito El género Tripanosoma se compone de varias docenas de especies de protozoos. Dos de las tres especies que infectan a los seres humanos son patógenas, y varias otras especies pueden causar enfermedades graves y de importancia económica en los mamíferos domésticos. En términos generales, los organismos pertenecientes a este género son protozoos flagelados,que pasan por diferentes etapas morfológicas (epimastigotes, amastigotes y tripomastigotes). 2.2 Morfología. Tripomastigote metacíclico, forma infectante. Es fusiforme. Mide µm, incluyendo el flagelo que inicia en la parte posterior del parásito, y emerge libre en el extremo anterior, formando en su trayecto submembranal una membrana ondulante. Presenta un gran núcleo central. El cinetoplasto es grande y de ubicación subterminal. Amastigote intracelular, replicativo. Es redondeado u ovoide. Mide µm. En él pueden apreciarse el núcleo, el cinetoplasto y cuerpo basal. Tripomastigote sanguíneo, diagnóstico.es una forma de transición. Epimastigote, en cultivos y en el insecto vector. También puede encontrarse en vertebrados, como forma de transición. El cinetoplasto se encuentra entre el núcleo y el flagelo libre. La membrana ondulante es pequeña.. Figura 1. Etapas morfológicas del parasito 2

3 Etapas en el ser humano. El ciclo se inicia cuando un insecto infectado pica a un ser humano y defeca. Los tripomastigotas meta cíclicos se transmiten en las heces. Entran en el huésped a través de la herida o por el cruce de las membranas mucosas. Cuando entran en una célula humana, se convierten en amastigotas. Esta es una etapa reproductiva a través de la mitosis. Después de la reproducción, una gran cantidad de amastigotas se encuentran en la célula infectada, formándose pseudo quistes. El almastigota se convierte de nuevo en tripomastigota y la célula se rompe. El tripomastigota vuelve a infectar otra célula repitiéndose el ciclo de multiplicación. Etapas en el insecto. Cuando el insecto pica a un huésped infectado, algunos tripomastigotas pasan a él a través de la sangre. En el intestino del insecto, se transforman en epimastigotas, los cuales constituyen una segunda etapa reproductiva. Después de la reproducción a través de mitosis, los epimastigotas pasan al recto. Allí se convierten en tripomastigotas meta cíclicos y se evacúan a través de las heces. Las heces pueden infectar a un nuevo huésped, repitiéndose el ciclo (ver figura 2). Figura 2.Ciclo del Trypanosoma Cruzi Figura 3. Amastigote,Epimastigote y Tripomastigote 3

4 2.4 Clinica Espectro clínico. 1. Fase aguda 2. Fase indeterminada 3. Fase crónica 1. Fase aguda. Asintomática en aproximadamente el 70% de los infectados. Más frecuente en niños. La incubación es de unos 14 días y la duración del cuadro oscila entre 6-8 semanas y donde sólo un 10% de los individuos presentará compromiso clínico. Se caracteriza por alta parasite mía. Durante los primeros 15 días puede presentarse el llamado "chagoma de inoculación", Esta fase se puede manifestar con fiebre, linfadenopatía, y mal estado general. 2. Fase subaguda o indeterminada: el sistema inmune controla la infección pero no la elimina; es asintomática, con baja parasitemia y presencia de anticuerpos específicos. No es mortal. La etapa aguda resuelve con la aparición de las respuestas efectivas del huésped y la desaparición de los tripanomastigotes del torrente sanguíneo. El microorganismo persiste intracelularmente. Siguen habiendo parasitemias episódicas originadas presumiblemente en los focos intracelulares. La localización y cantidad de los amastigotes determinan el cuadro clínico y la gravedad de la etapa crónica de la enfermedad. En la mayoría de los pacientes ésta no se da, y la fase latente, subaguda o indeterminada dura toda su vida. La fase indeterminada suele ser asintomática, pero pueden presentarse fiebre, anorexia, linfadenopatía, hepatosplenomegalia leve y miocarditis. Algunos casos agudos (10 a 20%) se resuelven en un período de dos a tres meses dando lugar a una fase crónica asintomática ahora llamada fase indeterminada, la cual se caracteriza por la persistencia de la infección sin presentar problemas clínicos para reaparecer sólo varios años más tarde 3. Fase crónica: La fase crónica es sintomática y puede aparecer años o décadas después de la infección inicial. La enfermedad afecta al sistema nervioso, al sistema digestivo y al corazón. Infecciones crónicas dan como resultado desórdenes neurológicos como por ejemplo la demencia, daño en el músculo cardíaco (miocardiopatía) y algunas veces la dilatación del tracto digestivo (megacolon y megaesófago). Sin tratamiento, la enfermedad de Chagas puede ser mortal, por lo general debido al componente de miocardiopatía se desarrolla insidiosamente en pacientes sin antecedentes de patología aguda. Predominan las manifestaciones cardíacas o gastrointestinales y afectación del sistema nervioso periférico. Cursa con baja parasitemia y presencia de anticuerpos específicos. El Tripanosoma produce en el huésped una infección persistente, por lo cual puede hallarse en la sangre periférica tanto en la fase aguda como en la crónica. El riesgo de transmisión es mayor en la fase aguda,ya que la parasistemia es intensa. 2.5 Diagnóstico En este sentido, se debe tener en cuenta que independientemente de la vía de transmisión del T. cruzi, cuando éste ingresa al organismo, cumple sus primeros ciclos de desarrollo en el hospedador, que comprenden entre 7 a 15 días, período después del cual recién se pueden detectar parásitos circulantes y posteriormente anticuerpos contra el parásito. De tal manera, como en otras enfermedades infecciosas, en Enfermedad de 4

5 Chagas existe un periodo de ventana, que es indispensable conocer, para evitar la realización de estudios parasitológicos y/o serológicos en un momento inadecuado, con la consecuencia de posibles falsos resultados negativos. Luego de este período de ventana, comienza la fase aguda, en donde la suma de las pruebas parasitológicas presentan una sensibilidad superior al 95%, para luego decaer hasta llegar al 50% o menos en el periodo crónico de la enfermedad. A partir de los 30 días aproximadamente, deben implementarse simultáneamente las metodologías serológicas. Desde el final del período agudo y durante todo el curso posterior de la infección, las pruebas serológicas en su conjunto presentan una sensibilidad cercana al 100% Fig. 4: Sensibilidad (S) de los métodos parasitológicos en el período de latencia, agudo y crónico Figura 5. Tripomastigotes de sangre periférica coloreados con Giemsa (400 x) 5

6 Figura 6: a) Rosetas de epimastigotes y epimastigotes libres en un hemocultivo (contraste de fase, 400x) Figura 7: Microscopía electrónica mostrando al parásito penetrando en una célula humana 3. MATERIALES Y METODOS 3.1 Diagnóstico. Técnicas de diagnostico Actualmente en la provincia de San Juan se utilizan las técnicas ELISA, HAI (Hemaglutinación indirecta) y PCR ( métodos de detección de ADN parasitario) para la detección de Chagas. 96% de sensibilidad y 97% de especificidad para ELISA. En HAI se obtuvo 99% tanto de sensibilidad como de especificidad, a través del métodos parasitologicos existen dos técnicas el examen en fresco y la técnica de concentración de Strutt que es una técnica muy simple basada en la concentración de los parásitos presentes en plasma por medio de la centrifugación y con posterior observación microscópica en fresco con una sensibilidad muy alta. El momento a partir del cual se puede detectar el parasito en sangre es de 7 dias en adelante, en una concertación de 1 parasito en 10 µl lo cual se puede ver que es una concentración muy baja y hace que la detección del parasito sea compleja. 6

7 Contadores hematológicos (método óptico) La medición de la intensidad de luz dispersada es utilizada frecuentemente por los contadores celulares en sus mediciones. Las células en suspensión se hacen pasar alineadamente una detrás de otra, a través de una pequeña zona sobre la que incide perpendicularmente un haz de luz halógena o láser, lo que provoca la interrupción y dispersión lumínica de la energía radiante en diversos ángulos. El número de interacciones del haz de luz se corresponde con la cantidad de células que pasan por la zona de sensible del aparato y la magnitud de su dispersión será una función de distintas propiedades o características celulares, dentro de las que pueden citarse el volumen celular, el tamaño, el contorno y el índice de refracción que constituye una función del contenido celular (presencia de granulaciones, coloración, lobularidad nuclear, entre otros). Para la detección de la luz dispersa se utilizan varios detectores colocados en diversos ángulos con respecto al haz incidente. La fracción luz dispersada en un ángulo cónico entre 0-10 o, que casi coincide con la dirección del haz incidente, será proporcional al volumen celular. Por otro lado, la fracción de luz dispersada perpendicularmente con respecto al haz incidente, será una función de la complejidad de la estructura intracelular. Aplicación de ultrasonido La aplicación de ultrasonido consiste en interpretar los cambios producidos en las ondas ultrasónicas a su paso por el material, en nuestra investigación el medio es el flujo sanguíneo donde se encuentran los elementos sanguíneos y donde se encuentra el parasito en su forma Trypomastigote, permitiendo deducir las características histológicas de éste medio material. 4. Conclusiones En este trabajo se investiga los distintos métodos de diagnostico de Chagas y la posibilidad de detectar el Chagas a través de ultrasonido. A partir de los métodos estudiados, se profundiza en el funcionamiento del contador de hematocrito y en las características morfológicas del parasito y se llega a la conclusión que es factible seguir interiorizándose en la utilización de ultrasonido para llegar a una detección temprana del parasito en la sangre y evitar así llegar a la fase crónica de la enfermedad. El mayor inconveniente que presentan los actuales métodos son el diagnostico tardío de la enfermedad (entre siete y quince días desde el ingreso del parasito en el organismo). Otro problema es la escasa probabilidad de la detección del parasito en un chagásico lo Cual presenta un porcentaje relativo de error. Además es que el chagásico no presenta síntomas evidentes lo que dificultan esta un tratamiento adecuado. Debido a estos inconvenientes resulta necesario la búsqueda de otro método que puede ser el ultrasonido. En la investigación que se desarrolla, se considera que los inconvenientes podrían ser mejorados adecuando una técnica de ultrasonido que nos permitan un método de diagnostico no invasivo, detección temprana de la enfermedad, disminuir el margen de error de las actuales, mejorar la calidad de vida de los pacientes suministrándoles medicación adecuada. Qué inconvenientes posibles se detectarían en la aplicación de este nuevo método? Se observa un inconveniente en la técnica debido a que la presencia del tripanosoma Cruzi en la sangre no presenta cambios significativos en su composición, ni en las células sanguíneas, ni en el medio plasmático. 7

8 La escasa presencia del parasito circulante en sangre 1-2/10 microlitos es pequeña lo que dificulta el hallazgo por ultrasonido. Por su forma característica es similar al de diversas bacterias circulantes cuya diferencia no sería detectables por ultrasonido. La frecuencia necesaria para la aplicación de ultrasonido es de 100Mhz es casi ideal, debido al pequeño tamaño del parasito. Qué ventajas se observan para que sea factible la aplicación de este método? Estudiando las diversas fases del parasito, se considera que la forma más apropiada en la localización del parasito seria en la forma Trypomastigote, fase aguda de la enfermedad ya que presenta una morfología detectable (tamaño: 20 micras). A través del contador de hematocrito podría ser detectable la fase intracelular, por lo tanto sería importante seguir analizando su funcionamiento. Con la utilización de arrays sería posible una detección del parasito mucho más precisa ya que se podría hacer un barrido 3D. Pero su costo sería también considerable. Por el tamaño considerable del parasito (20 micras) con respecto a los demás componentes sanguíneos. Morfología característica (detectable fácilmente en el microscopio óptico). Por Movimiento característico del parasito y su diferencia en la velocidad con la que se mueve el parasito con respecto a la velocidad del flujo sanguíneo. Investigando descubrimos q a través del contador de hematocrito es posible hallar el parásito debido a la alta sensibilidad del equipo para encontrar distintas propiedades o características de elementos en el flujo sanguíneo, dentro de las que pueden citarse el volumen, el tamaño, el contorno y el índice de refracción que constituye una función de la morfología (presencia de granulaciones, coloración, lobularidad nuclear, entre otros). 8