JBS Kit de Iniciación a la Cristalización de Proteínas

Transcripción

1 Cat. No. CS-401ES Cantidad 1 Kit Sólo para usos in vitro Garantía válida para 12 meses Conservar a 4 C Introducción y Teoría de la Cristalización Hoy en día hay dos métodos fundamentales para determinar la estructura tridimensional de una proteína. Por un lado está la resonancia magnética nuclear (NMR) y, por el otro, la cristalografía de rayos X. Con el método NMR sólo se pueden estudiar moléculas con un peso molecular aproximado de hasta Da (25 kda, o aproximadamente 220 aminoácidos); la cristalografía de rayos X es más apropiada para determinar la estructura de proteínas más grandes o complejos macromoleculares. Las primeras estructuras analizadas con este método fueron la mioglobina (1950) y la hemoglobina (1955), estudios que fueron premiados en 1962 con el premio Nobel de química. El primer paso para determinar una estructura por medio de la cristalografía y, al mismo tiempo, el más complicado- radica en la obtención de cristales de suficiente tamaño. Un cristal es una estructura tridimensional formada por bloques básicos (en este caso, moléculas proteicas) dispuestos de manera regular. Cómo podemos lograr cristales partiendo de una molécula tan compleja como es la proteína? Para pasar del estado líquido al cristalino, hay que reducir primero la solubilidad de la molécula. Por regla general, esto entraña la formación de una precipitación amorfa. Sin embargo, si las condiciones se han elegido de tal manera que en la superficie de la molécula se hallan áreas complementarias entre sí, se pueden dar variaciones específicas entre las moléculas proteicas. Si la geometría de estas variaciones es favorable, se formarán cristales. Fig. 1: Diagrama esquemático de fases de una mezcla de proteína y precipitante En la cristalización se distinguen principalmente dos pasos: (1) la nucleación y (2) el crecimiento del cristal. Ambos pasos tienen lugar, si las condiciones son favorables, en la zona sobresaturada del diagrama de fases (ver Figura 1). Desafortunadamente, para la nucleación se requiere más sobresaturación que para el crecimiento. El área de formación nuclear donde se da la sobresaturación también se denomina zona inestable o labil, mientras que el área de crecimiento se conoce como zona metaestable. Para la nucleación es necesario que la solución llegue a la zona labil. Sin embargo, una vez allí los núcleos crecerán demasiado rápido y los cristales resultantes serán muchos y muy pequeños. Como nos interesa formar cristales lo más grandes posibles (ca. 0,5 mm de largo) es necesario limitar la cantidad de núcleos en formación. En el experimento, por tanto, hay que aproximarse a la fase de nucleación muy lentamente, para garantizar que los núcleos tengan tiempo suficiente para crecer. El paso de una solución estable a una sobresaturada se puede realizar fácilmente variando la proporción de la mezcla de proteína y precipitante guiándose por el diagrama de fases. Para ello, se puede aumentar la concentración de la proteína o la del precipitado. Los procesos físicos que se prestan para lograr un cambio de concentración son la diálisis y la difusión. Ambos se caracterizan por el transporte de materia. El método de difusión por vapor, ilustrado en la Figura 2, ha demostrado ser especialmente idóneo para la cristalización. Page 1 of 7 Last update: April 7, 2015

2 Este método también se conoce como gota colgante ( hanging drop ). La solución proteica se encuentra en una gota suspendida de la parte inferior de una lámina de microscopio. El tamaño de la gota oscila normalmente entre los 0,5 µl y los 20 µl. La solución del pocillo (ca. 1 ml), que se encuentra en un reservorio por debajo de la gota, posee una elevada concentración de precipitante y dispone, por tanto, de una presión de vapor inferior a la de la solución proteica. Durante el experimento, el agua de la gota se evapora sobre la solución del recipiente. De esta manera, la concentración proteica de la gota aumenta, junto con la concentración de otros materiales. En condiciones favorables, la cristalización tendrá lugar al cabo de unos días o semanas. En otras palabras, estamos usando un sistema (gota colgante sobre un pocillo) que se halla en desequilibrio termodinámico. Es primordial que el equilibrio se vaya alcanzando poco a poco. Fig. 2: El método de gota colgante o hanging drop Qué Materiales se Pueden Usar Como Precipitante? En principio, se puede usar cualquier material que pueda influir sobre la solubilidad de la proteína, siempre que no la desnaturalice en elevadas concentraciones. Los distintos precipitantes usados comúnmente en la cristalización de proteínas se pueden catalogar según sus efectos sobre la solución. Por ejemplo, las sales como (NH 4) 2SO 4, NaCl, LiCl, KH 2PO 4, etc., cambian la carga iónica de la solución. La Figura 3 demuestra cómo varía la solubilidad de las proteínas en función de la carga iónica. Fig. 3: Dependencia de la solubilidad S en función de la carga iónica I El área a la izquierda del máximo de solubilidad proteica también se denomina area de salado ( salting-in ); el área a la derecha, de desalado ( salting-out ). En la zona de salting-in la solubilidad aumenta debido a la elevada constante dieléctrica de la solución. Gracias a este aumento, las cargas de la superficie de la proteína pueden interactuar mejor con su entorno. En la zona de salting-out la solubilidad vuelve a descender, ya que las cargas de precipitante entran en competencia por las moléculas de agua con las cargas de la superficie de la proteína. Los precipitados orgánicos como el ethanol, el methanol, el propanol, el MPD (metilopentanediol) o el acetonitrilo, entre otros, disminuyen la solubilidad proteica ya que bajan la constante dieléctrica de la solución. El mismo efecto provocan los polímeros orgánicos como, por ejemplo, los PEGs (polietilenglicoles), que se pueden encontrar con diversos pesos moleculares (de 400 a Da). Otro parámetro importante que influye en la solubilidad de las proteínas es el factor de ph. La solubilidad es más baja, por lo general, en el punto isoeléctrico de la proteína (IEP), puesto que allí es donde la proteína contiene una carga neta de cero. Page 2 of 7 Last update: April 7, 2015

3 Existen muchos factores que pueden influir en la cristalización, y normalmente disponemos de una cantidad reducida de proteína; como consecuencia, resulta prácticamente imposible probar todos y cada uno de los parámetros existentes en el espectro. Es importante, por tanto, desarrollar una estrategia que nos permita obtener resultados rápidos sin gastar demasiado material. Las Propiedades de los Cristales Proteicos En principio, los cristales proteicos están formados de igual manera que los cristales de moléculas pequeñas o cristales salinos, y su empaquetamiento molecular y su simetría se rigen por las mismas reglas. Sin embargo, hay algunas diferencias fundamentales que afectan tanto a las propiedades mecánicas y ópticas de los cristales como a su composición. Los cristales proteicos son muy blandos y contienen normalmente entre un 30% y un 70% de agua, la mayor parte de forma relativamente desordenada dentro del cristal. La integridad del cristal está dictada por la interacción entre las moléculas proteicas; sin embargo, entre las proteínas se encuentran espacios vacíos de un tamaño considerable, que están llenos de agua y/o moléculas amortiguadoras. Por consiguiente, las moléculas proteicas se encuentran en un medio casi natural, es decir, acuoso. Su estructura original (los pliegues de la proteína, fundamentales para permitir la actividad proteica) se mantiene, algo que se puede comprobar por medio de tests de actividad enzimática realizadas en proteinas cristalizadas. En algunos casos, la forma cristalina es una forma natural de reserva, como ocurre por ejemplo con la insulina. El JBS Kit de Iniciación a la Cristalización Proteica Jena Bioscience ha desarrollado este Kit de Iniciación a la Cristalización Proteica, que contiene todo el material necesario para averiguar, partiendo de una proteína ejemplo (lisozima de clara de huevo) cómo se va desarrollando la cristalización en función del ph, con NaCl como precipitante. Para ello, el ph se modifica poco a poco, mientras se va variando por fases la concentración del precipitante. El Kit, además, incluye todos los materiales para cristalizar lisozima por medio del método batch. Para ello, la solución de cristalización y la solución proteica se mezclan al mismo tiempo, logrando cristales sin difusión por vapor y sin equilibrar la concentración de proteina y precipitante. El Kit Incluye: 1. 2 placas 24-well SuperClear TM para la cristalización según el método de gota colgante 2. 1 jeringa con 5 ml de grasa de silicona para sellar los pocillos láminas para la cristalización por gota colgante 4. 1 porta objeto ml de NaCl, 20% (m/v) 6. 4 dosis de 3 ml de 2 de acetato de sodio como tampón, con un ph de 4,0; 4,4; 4,8 y 5,2 cada una 7. de solución de lisozima en agua (20 mg/ml) 8. 1 ml de solución de cristalización para la cristalización por método batch (30% (m/v) de PEG 5000-MME, 1 M de NaCl, de acetato de sodio con un ph de 4,4) Otros Materiales Necesarios no Incluidos en este Kit: 1. Pipetas Eppendorf o similares, con capacidad para abarcar de 1 a 2. Puntas de pipeta del tamaño correspondiente 3. Agua destilada o desionizada 4. Una pinza 5. Una habitación con una temperatura constante (20 22 C) 6. Un microscopio con un poder de amplificación de para examinar los cristales Realización del Experimento Según el Método de Gota Colgante En el experimento por gota colgante o hanging drop (Figura 2), la lisozima se cristaliza equilibrando la gota de proteína diluida en la solución de cristalización con la solución de cristalización contenida en el pocillo, por medio de una placa de cristalización sellada. Para ello se utiliza un sistema Page 3 of 7 Last update: April 7, 2015

4 de acetato de sodio/nacl, teniendo en cuenta que la cristalización depende en gran parte del valor de ph del tampón y la concentración de NaCl. El test se realiza con un ph de entre 4,0 y 5,2 en combinación con una concentración de NaCl de entre 4% y 9%. Desarrollo del Experimento: 1. Aplicar grasa de silicona en los pocillos de cristalización: usando la jeringa incluida en el kit, esparcir uniformemente la grasa de silicona sobre los bordes circulares del pocillos de cristalización. No deben aparecer irregularidades en el filo engrasado ni hilos sobre la cavidad del recipiente. 2. Pipetar la solución en el pocillo siguiendo el esquema de la Figura 4: el volumen total por pocillo debe ser 1ml, y la concentración de tampón tras ser mezclado con el precipitante y con agua debe ser. Atención: antes de empezar a pipetar, asegurarse de que el placa está colocado correctamente, sirviéndose como orientación de las líneas (A-D) y las columnas (1-6). 3. Pipetar la gota para la cristalización: pipetar 1 µl de solución proteica y 1 µl de solución del pocillo en una lámina circular. Pipetar cada línea (A-D) por separado. Primero se coloca una gota de la solución proteica en una lámina. Después, se aplica con cuidado la solución del pocillo sobre cada gota. Para ello, colocar la punta de la pipeta con precaución sobre la superficie de la gota de proteína y liberar 1 µl de solución del pocillo sin que aparezcan burbujas sobre la gota. Antes de pipetar una gota nueva hay que cambiar la punta de la pipeta. 4. Tapar los recipientes: con ayuda de una pinza, coger las láminas, darles la vuelta cuidadosamente con la gota hacia abajo y colocarlas sobre los pocillos. A continuación, presionar ligeramente para que la grasa de silicona cierre herméticamente el pocillo. Conservar las placas preparadas en una habitación con una temperatura constante (20-22 C). Para examinar la gota bajo el microscopio es recomendable quitarles la tapa a la placa. Se deben tomar precauciones para no ensuciar el objetivo del microscopio con la grasa. Asegúrese de observar toda la profundidad de la gota de proteína en el microscopio. La luz polarizada se puede aplicar también a fin de distinguir entre precipitado amorfo y material cristalino, ya que los cristales son capaces de polarizar la luz transmitida. La Figura 5 muestra el aspecto de la gota de cristalización a través del microscopio (factor de amplificación de 40) al cabo de 20 horas. Las coordinadas (A-D, 1-6) son las mismas que figuran sobre la placa de cristalización. Se puede observar claramente que el número de cristales aumenta cuanto más elevada sea la concentración de NaCl. La calidad óptima de cristales se alcanza cuando la saturación salina es ligeramente inferior a la máxima, como indica el diagrama de fases de la Figura 1 (para más información, véanse los procesos de nucleación y crecimiento de cristales en la introducción de este manual). Por contraste, la formación de núcleos decrece conforme aumenta el ph del tampón, dando como resultado menos cristales cuanto más alto es el ph. Desarrollo del Experimento Según el Método Batch Para un experimento tipo batch hay que pipetar, de manera similar al método hanging drop, una gota de la solución de cristalización junto con una gota de solución proteica en una lámina. En este caso, sin embargo, la composición de la solución de cristalización ha sido optimizada de tal manera que la cristalización de la proteína ocurre inmediatamente. Después de unos 20 minutos, se pueden apreciar con el microscopio los primeros cristales, que en el transcurso de pocos minutos irán creciendo con rapidez. De este modo, se pueden obtener cristales de lisozima más rápido que con el método de gota colgante. Page 4 of 7 Last update: April 7, 2015

5 Desarrollo del Experimento: 1. Pipetar la solución precipitante: pipetar 4 µl de la solución de cristalización en la lámina del microscopio. 2. Pipetar la solución proteica: pipetar 2 µl de solución proteica sobre la gota de buffer. Observe la gota en el microscopio. Se pueden variar las proporciones de buffer y proteína, lo que afectará la velocidad de crecimiento de los cristales y el número total de cristales formados. Agradecimientos Damos gracias a Dr. Manfred Weiss como autor de la idea original y por su asistencia en la organización de este kit. Gran parte de este manual está basado en las instrucciones para experimentos proporcionadas por Dr. Weiss. Derechos de Autor Todas las figuras incluidas en este manual son propiedad registrada de Dr. Manfred S. Weiss. Todos los derechos de las ilustraciones pertenecen a su autor. Se prohibe la reproducción total o parcial de este manual sin la autorización expresa y por escrito de Jena Bioscience GmbH. Page 5 of 7 Last update: April 7, 2015

6 Concentración final 20 % NaCl 4 % 5 % 6 % 7 % 8 % 9 % ph 4,0 2 Acetato de Sodio ph 4,4 ph 4,8 ph 5,2 20 % de NaCl 2 de Acetato de Sodio Agua Destilada Fig. 4: Esquema para pipetar según el método de gota colgante Page 6 of 7 Last update: April 7, 2015

7 A B C D Fig. 5: Aspecto del experimento según el método de goteo después de 20 horas (ampliación de 40x) Page 7 of 7 Last update: April 7, 2015