A COMPARATIVE STUDY OF UNCAPPING AND REMOVING DEAD BROOD IN HYGIENIC AND NON-HYGIENIC HONEYBEES

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1 A COMPARATIVE STUDY OF UNCAPPING AND REMOVING DEAD BROOD IN HYGIENIC AND NON-HYGIENIC HONEYBEES María Alejandra Palacio; Flores, J. M.*; Figini, E**; Ruffinengo, S; Escande, A.; Bedascarrasbure, E.** ; Rodriguez, E**; Gonçalves,L***. Universidad Nacional de Mar del Plata. Balcarce. PROAPI. C.C (7620) Balcarce. Tel-Fax palacio@vet.unicen.edu.ar * Universidad de Córdoba. España. ** Universidad Nacional del Centro. Proapi. Argentina. ***Universidade de Sao Paulo. Brasil. ABSTRACT Honeybees hygienic behaviour is considered as mechanism of tolerance for many diseases. It includes the uncapping of the cells and the removalof dead or damaged brood from the colonies. Most works on hygienic behaviour have registered the consequence of this behaviour after one or two days. The objective of this work was to evaluate the time that hygienic(h) and nonhygienic(nh) honeybees take to uncap and to remove dead brood in observation hives after the pin-killing test. Two hygienic and non-hygienic colonies in modified observation hives were used. Thirty brood cells were perforated and observations after 1,2,3,4,5,6,and 24 hours were done. Different phases for uncapping and removing stages were registered. Differences in uncapping and removal between H and NH colonies were significant in all comparations related to time after perforation (p<0.0001). One hour after perforation of the worker brood in the H colonies about 45 % of the reached brood was completely uncapped and only 4 % in nh colonies. differences were more clear four hours after perforation when 100 % of the brood was totally uncapped and 43% removed in H colonies, and nh colonies reached that values for uncapping 24 hours after perforation.at that time only 53% of the brood had been removed.there were also significant differences between experiments done in different days but the tendency was the same for each experiment.it is possible to discriminate between H and NH colonies one hour after perforation using observation hives. INTRODUCCION El comportamiento higiénico de la abeja melífera es considerado como un mecanismo de tolerancia para distintas enfermedades. Este comportamiento involucra el desoperculado de las celdas y la remoción de la cría muerta hacia el exterior de la colonia y fue descripto por primera vez en 1964 por Rothembuler. Este autor señaló que el mismo está regulado por dos genes recesivos, uno de desoperculado (abertura de la celda de cría) y otro de remoción del cadáver. Más tarde, Moritz (1988) señaló que la determinación genética sería mas compleja, ya que la remoción de cadáveres estaría controlada por más de 2 locus, probablemente tres. Proceedings of the 37 th International Apicultural Congress, 28 October 1 November 2001, Durban, South Africa APIMONDIA 2001 To be referenced as: Proc. 37 th Int. Apic. Congr., 28 Oct 1 Nov 2001, Durban, South Africa ISBN: Produced by: Document Transformation Technologies Organised by: Conference Planners

2 Distintos autores estudiaron la relación del comportamiento higiénico con la fortaleza de la colonia. Jones y Rothembuhler (1964) observaron que las obreras tardaban el mismo tiempo en retirar de la colonia 2000 larvas muertas que 100, por lo que sugirieron que las abejas que se encuentran patrullando en la colonia son afectadas a la tarea de limpieza cuando es necesario. Spivak y Gilliam (1993) detectaron que el comportamiento higiénico se ve afectado por la fortaleza de la colonia al comparar colmenas completas con colmenas de observación. Es importante destacar que en esas colmenas de observación solo de transfiere el 15 % de la población original. Gramacho (1996) no encontró diferencias entre el comportamiento higiénico en colmenas de dos cuerpos, cámaras y núcleos. Palacio et al (1996) no detectaron correlación significativa entre el comportamiento higiénico y el número de cuadros cubiertos por abejas, ni entre ese comportamiento y la relación cuadros cubiertos por abejas / cuadros de cría. El comportamiento higiénico constituye una fuente de resistencia natural de las abejas a las enfermedades de la cría (Rothembuler, 1964, Milne, 1983, Guilliam et al., 1989, Spivak y Guilliam, 1993; Spivak y Gilliam, 1998). En este sentido, se han realizado trabajos de selección tendientes a obtener líneas de abejas que manifiesten este comportamiento (Rothembuler, 1964 ; Taber, 1982 ; Spivak y Guilliam, 1993; Palacio et al., 1996). Un programa de mejoramiento genético puesto en marcha en el año 1992 por la F.C.A. de Balcarce y la F.C.V. de Tandil ha permitido a través de selección masal, mejorar los índices de este comportamiento (aumento de la tasa de limpieza), lo que condujo a una menor incidencia de las enfermedades de la cría en las colonias higiénicas (Palacio et al., 2000). A diferencia de otros comportamientos estudiados en la abeja, todos los trabajos realizados sobre comportamiento higiénico se basan en la consecuencia del mismo, que como resultado final conduce al desoperculado de celdas y/o eliminación de cadáveres. Las técnicas utilizadas para testear el comportamiento higiénico normalmente se realizan en colonias completas y los resultados se evaluan después de 1 o dos días. El objetivo de este trabajo fue evaluar el tiempo que abejas higiénicas y no higiénicas demoraron en desopercular y remover la cría muerta en colmenas de observación, luego de la muerte de las larvas por pinchado con un alfiler. MATERIALES Y METODOS De 300 colonias evaluadas por su comportamiento higiénico matando la cría mediante el uso de un alfiler, fueron seleccionadas 2 higiénicas y 2 no higiénicas. De cada una de estas colonias, fue retirado un cuadro de cría operculada cubierto con abejas. Cada cuadro fue instalado en diferentes colmenas de observación, con una reina nueva. Las observaciones se iniciaron una vez liberada la reina y normalizado el funcionamiento de la colonia. Para evitar pérdidas de abejas y alteración del comportamiento al realizar el pinchado de la cría, se desarrolló una técnica que consistió en colocar en las colmenas de observación laterales de policarbonato con 65 agujeros. Estos se cubrieron con pequeños cuadrados de hoja plástica

3 fijada en dos de sus lados de manera tal que al levantarlos permitió matar la cría y manipular la colonia con mínimos disturbios. Con el uso de un alfiler, se mataron 30 pupas en cada una de las colmenas de observación. Se registraron diferentes estados de desoperculado y remoción de cría muerta, luego de 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 24 horas del pinchado. Se consideraron los siguientes grados de desoperculado: 0.Pinchado, 1 Menos de la mitad desoperculado, 2. Mitad desoperculado, 3. Más de la mitad desoperculado.4 Totalmente desoperculado. Los grados de remoción considerados fueron: 0. Sin remoción, 1. Inicio de remoción, 2. Menos de la mitad removida, 3. Mitad removida, 4. Más de la mitad removida, 5. Prácticamente removida, 6. Removida totalmente. Las observaciones se realizaron durante cuatro días consecutivos. Los porcentajes de cría desoperculada y removida en las colmenas higiénicas y no higiénicas fueron comparados mediante un test de Chi cuadrado. RESULTADOS En la Tabla Nº 1 se muestran los porcentajes de celdas de cría con diferentes grados de desoperculación en las colonias de alto (H) y bajo comportamiento higiénico (NH) para las diferentes horas de observación. Los datos corresponden al promedio de cuatro observaciones (días). Tabla 1: Porcentajes de celdas de cría desoperculado en las diferentes horas. correspondiente a diferentes grados de HORA GRADO DE DESOPERCULACION H NH H NH H NH H NH H NH Grados de desoperculación: 0.Pinchado; 1.Menos de la mitad desoperculado; 2.Mitad desoperculado; 3.Más de la mitad desoperculado; 4.Totalmente desoperculado.

4 Se observaron diferencias significativas entre colonias H y NH, en todas las observaciones realizadas (p< ). En las colmenas H, luego de la primera hora, el 45 % de la cría fue desoperculada totalmente y el 19 % no mostró indicios de desoperculación. Cuando las colonias NH fueron consideradas, solo el 4 % de la cría fue desoperculada totalmente y en el 60 % no se detectó inicio de desoperculación. Las diferencias entre colmenas H y NH disminuyen a partir de la cuarta hora, sin embargo, en todos los casos las mismas son altamente significativas. Cuatro horas después de la perforación, las colonias H desopercularon el 100% de la cría. En la Tabla Nº 2 se muestran los porcentajes de cría con diferentes grados de remoción en las colonias H y NH para las diferentes horas de observación. Tabla N 2: Porcentajes de celdas de cría correspondiente a diferentes grados de remoción en las diferentes horas. HORA GRADO DE REMOCION H NH H NH H NH H NH H NH H NH H NH Grados de remoción: 0.No removida; 1.Inicio de remoción; 2.Menos de la mitad removida; 3.Mitad de la cría removida; 4.Más de la mitad removida; 5 Prácticamente removida; 6.Totalmente removida. En la primera hora, el 15 % de la cría muerta fue removida en las colonias H y no fue registrada cría removida en las NH. En la 5º hora más del 50 % de la cría fue removida en las colonias H y solo 16 % en las colonias NH. Cuando se consideran los datos correspondientes a las 24 horas, las colonias H removieron el 99 % de la cría y las NH solo el 53%.

5 DISCUSION La velocidad de desoperculación y remoción de cría muerta de abejas higiénicas instaladas en colmenas de observación fue significativamente superior a la registrada en abejas de bajo comportamiento higiénico. Dichas diferencias fueron detectadas a partir de la primera hora posterior a la muerte de la cría. De esta manera, mediante el uso de colmenas de observación es posible discriminar colonias de alto y bajo comportamiento higiénico en pocas horas. Al evaluar el comportamiento higiénico en colmenas completas y colmenas de observación de dos cuadros de colonias higiénicas, Spivak y Gilliam (1993) registraron una disminución en el porcentaje de cría removida. En el caso de abejas no higiénicas, no observaron diferencias significativas en la cría removida en colmenas completas y en las colmenas de observación y sugirieron que la expresión del comportamiento higiénico dependía de la fortaleza de la colonia. Nuestros resultados indican que el comportamiento higiénico no se ve afectado por el tamaño de la colonia ya que a las 24 horas se obtuvieron porcentajes de remoción del 99 % para las abejas higiénicas y las abejas no higiénicas mantienen bajos valores de remoción de cría (53 %). Estos datos coinciden con Palacio et al (1996) y Gramacho (1996) quienes no encontraron relación entre el comportamiento higiénico y la fortaleza de la colonia. Hasta el momento no existen evidencias conclusivas sobre el estímulo que desencadena el comportamiento higiénico. Gramacho at al (1997) consideran que diferencias de temperatura registradas entre la cría muerta y viva estaría relacionada con los mecanismos de reconocimiento de las obreras. Masterman et al (1998) detectaron diferencias en la discriminación olfativa de abejas higiénicas y no higiénicas, utilizando el test de acondicionamiento de la extensión de prosboscis. Nuestros datos permiten afirmar que cualquiera sea el estímulo desencadenante para este comportamiento, las abejas son capaces de detectar la cría muerta durante la primera hora coincidiendo con Gramacho (datos no publicados). Cuando consideramos los registros obtenidos a las 24 horas, las colonias NH desopercularon el 90 % de la cría pero removieron solo el 53 %. Las colonias H desopercularon el 100 % de la cría y removieron el 99 %. Si bien estas diferencias fueron significativas entre colonias para todas las horas de observación, las mismas son más notables cuando el grado de remoción es considerado. Estos datos coinciden con Palacio et al(2000) quienes realizaron selección por la característica comportamiento higiénicoen una población de Apis mellifera. Estos autores registraron un aumento significativo en la tasa de comportamiento higiénico total (que involucra desoperculación y remoción de la cría) pero no así en la tasa de comportamiento higiénico parcial (que involucra la desoperculación y remoción parcial de la cría). Los valores de ésta última variable eran altos en la población inicial sugiriendo que la frecuencia de genes relacionados con la desoperculación es relativamente alta en las poblaciones estudiadas y la selección realizada tiene efectos sobre genes relacionados con el comportamiento de remoción de la cría.

6 BIBLIOGRAFIA Gilliam, M.; Taber, S.; Lorenz, B.G.J.; Prest, D.B Hygienic honey bees and antagonistic normal microflora for control of chalkbrood disease. XXXII Int. Apiculture Congress of Apimondia. October 22-28,Rio de Janeiro, Brasil. Gramacho, K Estudo do comportamento higiênico em Apis mellifera, como subsidio a programas de seleçåo e melhoramento genético em abelhas. Dissertacao de Mestrado para a obtencåo do título de Mestre em Ciências. Faculdade Filosofia, Ciências, e Letras. RP USP.103 pp. Gramacho,K; Goncalves,L.S; Rosenkranz,P Temperature measurement of living and killed (pin test) honey bee brood (Apis melliferal). German Bee Research Institutes Seminar. Report o the 44 th meeting in Jena, March Apidologie 28: Masterman,R;Mesce,K; Smith,B.H & Spivak,M Odor discrimination by hygienic honeybees using prosboscis extension conditioning. Am. Bee Journal 138(4): Milne, C.P Jr Honey bee (Hymenoptera: Apidae) hygienic behaviour and resistance to chalkbrood. Annals of the Entomological Society of America 76(3): Moritz, R.F.A A re-evaluation of the two locus model for hygienic behaviour in honeybees (Apis mellifera L.). J. Heredity 79: Palacio, M.A; Figini, E; Del Hoyo, M; Rodriguez, E; Bedascarrasbure, E.L; Ruffinengo, S; Cuenca Estrada, G Selección para comportamiento higiénico en una población de Apis mellifera. V Congreso Ibero Latinoamericano de Apicultura. 30 Mayo al 2 de Junio. Mercedes. Uruguay Palacio,M.A; Figini,E; Rodriguez,E; Rufinengo,S; Bedascarrasbure,E; Del hoyo,m.(2000). Changes in a population of Apis mellifera selected for its hygienic behaviour. Apidologie 31: Rothembuler, W.C Behavior genetics of nest cleaning in honey bees. IV. Responses of F 1 and backcross generations to disease -killed brood. American Zoologist 4: Spivak, M. ; Gilliam, M Facultative expression of hygienic behaviour of honey bees in relation to disease resistance. J.Apic. Res.32 (3/4): Spivak,M; Gilliam,M Hygienic behaviour of honeybees and its application for control of brood diseases and varroa. Part 1: Hygienic behaviour and resistance to American Foulbrood. Bee World 79(3): Taber, S a. Bee Behavior: Breeding for disease resistance. Am. Bee J. 122: