11 Número de publicación: Número de solicitud: Int. Cl.: 74 Agente: Segura Cámara, Pascual

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Número de solicitud: Int. Cl.: C08F 120/6 ( ) C08F 2/10 ( ) G01N 27/26 ( ) G01N 27/447 ( ) 12 PATENTE DE INVENCIÓN B1 22 Fecha de presentación: Fecha de publicación de la solicitud: Titular/es: Universidad de Barcelona Centro de Patentes de la UB. Baldiri Reixac, Barcelona, ES Fecha de la concesión: Fecha de anuncio de la concesión: Inventor/es: Rosa López, José Luis; Casas Terradellas, Eduard; García Gonzalo, Francisco Ramón; Hadjebi, Ouadah; Bartrons Bach, Ramón y Ventura Pujol, Francisco 4 Fecha de publicación del folleto de la patente: Agente: Segura Cámara, Pascual 4 Título: Gel para la separación de proteínas. 7 Resumen: Gel para la separación de proteínas. Gel de poliacrilamida que comprende: (i) una parte inferior que tiene un gradiente de concentración de poliacrilamida. dentro del intervalo de 3% a 20% y una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 60:1 a 20:1; y (ii) una parte superior que tiene una concentración de poliacrilamida en el intervalo de 3% a 10% y una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 100:1 a 70:1; donde ambas partes forman una única capa. La invención también se refiere al procedimiento y al kit para obtener este gel de poliacrilamida. Es útil para la separación electroforética simultánea de proteínas de elevado y bajo peso molecular. ES B1 Aviso: Se puede realizar consulta prevista por el art LP. Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, Madrid

2 Gel para la separación de proteínas. DESCRIPCIÓN La invención se relaciona con la electroforesis en gel y particularmente con con un gel de poliacrilamida para la separación de proteínas así como con un procedimiento para obtener el gel. Estado de la técnica La electroforesis en gel configura un grupo de técnicas usadas por los científicos para separar moléculas en base a sus características físicas tales como su tamaño, su forma o su punto isoeléctrico. La electroforesis en gel se utiliza normalmente con fines analíticos aunque también puede ser usada como técnica preparativa para la purificación parcial de moléculas previo a su uso en otros métodos para su caracterización, tales como la espectrometría de masas, la PCR (del inglés, Polymerase Chain Reaction ), el clonaje, la sequenciación de ADN o el immunoblotting. Más de cuarenta años después de su descripción inicial (cfr. J.V. Maizel, 2000, TIBS, vol. 2, pp ), la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) continúa siendo una de las herramientas más poderosas para el análisis de proteínas. Existen distintas variantes de la PAGE que proporcionan diferentes tipos de información sobre las proteínas analizadas (masa, carga, pureza, etc). Entre estas variantes, la más común es probablemente la que se usa el dodecil sulfato sódico ( sodium dodecyl sulfate, SDS), comúnmente referida como SDS-PAGE. Este detergente aniónico (SDS) se une a lo largo de toda la superficie de las proteínas desnaturalizadas por calor, confiriéndoles por ello una carga total que es proporcional a su tamaño (i.e., una proporción masa:carga uniforme). Como resultado, la distancia de migración de una proteína cuando se aplica una corriente eléctrica a un gel SDS-PAGE, depende únicamente de la masa de la proteína. Este hecho junto con algunos otros refinamientos tales como el uso de agentes reductores y el uso de un gel concentrador, ha hecho que sea posible separar proteínas según su peso molecular con una resolución considerable. Para obtener una resolución de proteínas óptima mediante SDS-PAGE, es necesario verter un gel concentrador sobre el gel separador. El gel concentrador posee una concentración menor de acrilamida (mayor tamaño de poro), un ph inferior y un contenido iónico diferente. Esto permite a las proteínas de cada carril concentrarse en una banda estrecha, antes de su entrada en el gel separador, produciendo un gel con bandas de proteínas más estrechas y mejor separadas. La SDS-PAGE es una técnica conocida para la separación de proteínas pequeñas. En este caso, se usa normalmente un gel con concentración de poliacrilamida entre y 20% y una proporción acrilamida:bisacrilamida de alrededor de 40:1, para el análisis de proteínas de a 200 kda (cfr. A.V. Ershov et al., 1996, The Journal of Biological Chemistry, vol. 271, pp ). Con el objetivo de analizar proteínas gigantes, se usa un gel compuesto con una mayor porosidad. Este gel se consigue incrementando la proporción acrilamida:bisacrilamida hasta 80:1 por ejemplo. También es necesario un porcentaje de acrilamida bajo de alrededor del 4-% (cfr. J.L. Rosa et al., 1996, EMBO J., vol. 1, pp ). Sin embargo, este tipo de geles son demasiado blandos y pegajosos, lo cual los hace de difíciles de manipular en tinciones o para transferirlos en membranas. Otros geles conocidos hacen uso de un gradiente de concentración, como los descritos en la solicitud de patente US 2003/ Este tipo de geles o sistemas de geles son capaces de separar moléculas con unos pesos moleculares en el intervalo entre 7 y 19 KDa (BioRad laboratories, Hercules, CA, USA). No obstante, ninguno de los geles conocidos en la actualidad es capaz de separar simultáneamente tanto proteínas gigantes como proteínas pequeñas. Explicación de la invención La presente invención se refiere a un nuevo gel de poliacrilamida capaz de separar simultáneamente proteínas de peso molecular alto y bajo (es decir, proteínas con un peso molecular en el intervalo de kda a mayor que 200 kda), donde este gel comprende una capa uniforme formada por diferentes soluciones, todas ellas polimerizadas al mismo tiempo. Así, utilizando el gel de polacrilamida de la invención, es posible analizar simultáneamente proteínas gigantes tales como HERC1 (32 kda) y la cadena pesada de la dineína (DYHC, 27 kda), proteínas grandes como la cadena pesada de la clatrina (CHC, 192 kda) y pequeñas proteínas como el factor 1 de ribosilación del ADP (ARF1, 20 kda). El gel de poliacrilamida de la invención tiene una buena resolución, coste de fabricación bajo, alta reproducibilidad y ahorra tiempo en comparación con los sistemas de gel utilizados en la técnica. Todas estas características, junto con el hecho de que se puede utilizar un aparato estándar disponible en cualquier laboratorio de bioquímica para hacer el gel de la presente invención, hace que sea una herramienta fácil y fiable. Así, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un gel de poliacrilamida que comprende: (i) una parte inferior que tiene un gradiente de concentración de poliacrilamida dentro del intervalo de 3% a 20% y una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 60:1 a 20:1; y (ii) una parte superior que tiene una concentración de poliacrilamida (fija o el gradiente) en el intervalo de 3% a 10% y una proporción acrilami- 2

3 da:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 100:1 a 70:1; donde ambas partes forman una única capa El término única capa como se usa aquí, se refiere a un gel uniforme sin separación o deformaciones entre las dos partes. Para hacer la parte superior más tratable, ambas partes deben polimerizarse al mismo tiempo. Corn resultado, el gel final es una unidad más consistente y puede ser manipulado cogiéndolo por su región inferior más densa. Esto es especialmente importante cuando el gel tiene que teñirse o transferirse a una membrana para llevar a cabo p. ej. un western blot. Un experto en la materia fácilmente entenderá el significado de los términos parte superior y parte inferior de un gel. En una primera realización de la presente invención, la parte inferior tiene un gradiente de concentración de poliacrilamida dentro del intervalo de 4% a 18% y una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 0:1 a 30:1. En otra realización, la parte superior tiene una concentración de poliacrilamida en el intervalo de 4% a 8% y una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 90:1 a 80:1. En una realización más preferida, la parte inferior tiene un gradiente de concentración de poliacrilamida desde el 6% al 1% y una proporción acrilamida:entrecruzador de 40:1. En otra realización, la parte superior tiene una concentración de poliacrilamida del 4% y una proporción acrilamida:entrecruzador de 80:1. Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para obtener el gel de la invención, que comprende los siguientes pasos: (a) verter en un generador de gradiente soluciones que comprenden acrilamida y entrecruzador, adecuadas para obtener un gradiente de concentración de poliacrilamida dentro del intervalo de 3% a 20% y una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 60:1 a 20:1; (b) añadir una segunda solución que comprende acrilamida y entrecruzador, adecuada para obtener una concentración de poliacrilamida en el intervalo de 3% a 10% y una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 100:1 a 70:1; y (c) dejar polimerizar las soluciones de los pasos (a) y (b) al mismo tiempo para formar una única capa. Para generar el gel de la invención, la acrilamida que se utiliza para hacer las soluciones de los pasos (a) y (b) del procedimiento de la invención tiene que mezclarse con un entrecruzador con el fin de formar el polímero entrecruzado. Además, esta polimerización debe hacerse en presencia de una solución de peróxido y de un agente reductor. En una realización preferida de la invención, la solución de peróxido, que se utiliza para formar el polímero entrecruzado puede ser, pero no se limita a, peroxodisulfato de amonio, y un peroxodisulfato de un metal alcalino. En otra realización de la invención, los agentes reductores que se utilizan para formar el polímero entrecruzado pueden ser, pero no se limitan a, compuestos amina, p. ej. N,N,N,N -tetrametiletilenediamina (TEMED), N,N,- dimetiletilenediamina, 3-dimetilamino-n-propilamina, 3-dimetilaminopropionitrilo, N-n-butildimetilamina y N,N -dimetilpiperazina. En una realización más preferida, en el paso (a) el gradiente tiene una concentración de poliacrilamida dentro del intervalo de 4% a 18%, y una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 0:1 a 30:1; y en el paso (b) la concentración de poliacrilamida está en el intervalo de 4% a 8%, y tiene una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 90:1 a 80:1. En todavía otra realización más, en el paso (a) el gradiente tiene una concentración de poliacrilamida desde el 6% al 1%, y una proporción acrilamida:entrecruzador de 40:1; y en el paso (b) la concentración de polacrilamida es 4% y la proporción acrilamida:entrecruzador de 80:1. Como se usa aquí, el término entrecruzador ( crosslinker ) se refiere a cualquier compuesto que posee funciones de entrecruzamiento. Ejemplos específicos de compuestos pueden ser, pero no se limitan a, N,N -metilenebisacrilamida (BIS o bisacrilamida), N,N -propilenebisacrilamida, diacrilamida dimetil éter y piperazina diacrilamida. En todavía una realización más preferida de la presente invención, el entrecruzador es bisacrilamida. Debe tenerse en cuenta que, en el procedimiento de la invención, es innecesario el uso de un gel de concentración puesto que el tamaño de poro decreciente continuo realiza la misma función. Un tercer aspecto de la presente invención se refiere al uso del gel de la invención para la separación de proteínas por electroforesis. En una realización preferida, el gel de la invención se utiliza para separar simultáneamente proteínas de muy diferentes tamaños. La parte inferior del gel de la invención es capaz de separar proteínas cuyos pesos moleculares son en el intervalo de kda a 200 kda y la parte superior del gel es capaz de separar proteínas cuyos pesos moleculares son mayores de 200 kda, con buena resolución. Finalmente, otro aspecto de la invención se refiere a un kit para llevar a cabo el procedimiento definido anteriormente, que comprende cantidades apropiadas de acrilamida, de entrecruzador y de un tampón adecuado. Un tampón adecuado puede ser Tris/HCI (ph 8.8) + SDS. 3

4 Aplicaciones frecuentes de la electroforesis SDS-PAGE para separar proteínas utilizando el gel de la invención son el análisis immunoblot (western blot), la inmunoprecipitación, la proteómica, estudios de interacción y otras aplicaciones conocidas por cualquier experto en la materia A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra comprende y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Breve descripción de los dibujos La Fig. 1A es una representación esquemática donde se muestra cómo se prepara el gel de la invención, entre dos cristales de un aparato para Western blot ( slab ). La Fig. 1B muestra la separación de las proteínas pertenecientes a vesículas con cubierta de clatrina (CCV) mediante el gel de la invención. b.p. = parte inferior; u.p. = parte superior; m. = marcadores. La Fig. 2 muestra algunas aplicaciones del gel. La Fig. 2A es una representación esquemática de distintas proteínas de fusión con GFP, de la proteína gigante HERC1 y sus dominios. Las Fig. 2B y Fig. 2C muestran plásmidos que expresan las proteínas de fusión con GFP, transfectados en células HEK-293 y analizados mediante immunoblot con anticuerpos anti-gfp (Fig. 2B) o anti-herc1 (Fig. 2C). La Fig. 2D muestra lisados de células HEK-293 inmunoprecipitados con anticuerpos contra HERC1, pre-inmune (P) o inmune (I). Ejemplos Preparación de un gel de poliacrilamida Un ejemplo del gel de la invención se muestra en la Fig 1. El gel fue preparado entre dos cristales (16 cm x 18 cm) de un aparato para Western blot estándar (cfr. F.W.Studier, 2000 TIBS, vol. 3, pp ). Para la generación del gel, se prepararon tres soluciones de acrilamida con bisacrilamida. Dichas soluciones tenían las siguientes características: - Una concentración de poliacrilamida del 6% y una proporción acrilamida:bisacrilamida de 40: Una concentración de poliacrilamida del 1% y una proporción acrilamida:bisacrilamida de 40:1. - Una concentración de poliacrilamida del 4% y una proporción acrilamida:bisacrilamida de 80:1. Todas las soluciones acrilamida:bisacrilamida se añadieron en un tampón [37. mm Tris/HCl (ph 8.8), 0.1% (w/v) SDS] en presencia de peroxodisulfato de amonio (10 µl de la solución al 10% en 20 ml de solución) y TEMED (0 µl en 20 ml de solución). Las soluciones de acrilamida al 6% (40:1) y 1% (40:1) fueron vertidas en cada uno de los compartimentos del aparato generador de gradiente al mismo tiempo. Rápidamente a continuación y antes que el gel solidificara, fue añadida la solución al 4% (80:1). De esta forma el gel final era una unidad o capa más consistente que podía ser manipulada más fácilmente cogiéndolo por su parte inferior más densa. Electroforesis en gel de poliacrilamida Con el objetivo de probar su resolución y sus posibles aplicaciones, se usaron vesículas con cubierta de clatrina (CCV) (cfr J.H. Keen et al., 1979 Cell, vol. 16, pp ) puesto que están formadas por relativamente pocas proteínas pero con un intervalo de pesos moleculares muy diverso. En las Figuras se muestran los marcadores de peso molecular (Miosina: 19 kda; β-galactosidasa: 116 kda; Albúmina de suero bovino: 9 kda; Ovoalbúmina: 1 kda; Anhidrasa carbónica: 37 kda; inhibidos de la Tripsina de semilla de soja: 29 kda; Lisozima: 20 kda; Aprotinina: 7 kda) (BioRad laboratories, Hercules, CA, USA). Se separaron proteínas de las CCV mediante el gel de la invención (Ejemplo 1), se visualizaron por tinción con Coomassie Brilliant Blue y luego fueron identificadas por espectrometría de masas (MS) y immunoblot con anticuerpos específicos. Se hirvieron durante 10 minutos 100 µg de CCV resuspendidos en tampón Laemmli [0 mm Tris/HCl (ph 8.8), 2% (w/v) SDS, 100 mm DTT, 10% (v/v) glicerol y 0.01% azul de bromofenol] (cfr. U.K. Laemmli, 1970 Nature, vol. 227, pp ) y se cargó en un gel previamente preparado entre dos cristales (16 cm x 18 cm) de una aparato estándar para Western blot. Se dejó correr la electroforesis a 4 V durante 16 horas y a temperatura ambiente. A continuación, el gel se tiñó con Coomassie Brilliant Blue, con lo cual los marcadores de peso molecular mostraron la buena resolución de este sistema (Fig. 1B). En el carril de las CCV, la tinción muestra un amplio abanico de proteínas con muy distintos pesos moleculares. La posterior identificación mediante proteómica confirmó la separa- 4

5 ción en el mismo gel de proteínas gigantes, como la cadena pesada de la dineína (DYHC, 27 kda), proteínas grandes como la cadena pesada de la clatrina (CHC, 192 kda), proteínas medianas como la chaperona Hsc70 (72 kda) o la sinaptotagmina I (Syt I, 6 kda), y proteínas pequeñas como el factor 1 de ribosilación del ADP (ARF1, 20 kda). Se conoce que todas ellas están presentes en las CCV (cfr. F. Blondeau et al., 2004 Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 101, pp ). Estos resultados mostraron la habilidad del gel de la invención para separar simultáneamente proteínas desde muy elevado hasta muy bajo peso molecular, utilizando una electroforesis de una dimensión, que además permite ahorrar tiempo. Análisis por immunoblot Una aplicación frecuente de la electroforesis de proteínas SDS-PAGE son los análisis por immunoblot. Esta aplicación también fue comprobada con el gel de la invención. Se observó que la polimerización simultánea de ambas partes del gel (parte inferior y superior) permite una manipulación del gel más sencilla. Para la transferencia (western blotting), se usó un aparato húmedo y un protocolo estándar para Western blot (BioRad laboratories, Hercules, CA, USA) con un tiempo de transferencia incrementado hasta 4 horas con 1=400 ma y a 4ºC. Bajo estas condiciones, los marcadores de peso molecular para proteínas (7-200 kda) fueron transferidos completamente. Se usaron membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) ya que las de nitrocelulosa resultaron pegarse demasiado a la parte superior del gel. Además, se observó que con el fin de obtener resultados reproducibles en el immunoblot, era preferible el uso de dos membranas de PVDF (una en cada lado del gel) durante la transferencia. De no ser así, cuando se analizaba la membrana con anticuerpos se observaba un intenso fondo en la parte de elevado peso molecular del gel, probablemente debido a impurezas en el tampón de transferencia. Siguiendo estas indicaciones, proteínas de todos los tamaños pudieron ser analizadas simultáneamente mediante immunoblot. A modo de ejemplo de sus aplicaciones y de su resolución, se usaron diversas proteínas de fusión a GFP de la proteína gigante llamada HERC1 (32 kda) (Fig. 2A). Se muestran entre paréntesis los aminoácidos de la secuencia de HERC1 que incluyen cada una de las proteínas de fusión. Se transfectaron plásmidos que expresan las proteínas de fusión indicados, a células HEK-293 (Fig. 2B, 2C). 48 horas más tarde, se analizaron lisados de estas células con el gel y se transfirieron a una membrana de PVDF tal y como se indica previamente. Las proteínas de fusión a GFP se identificaron mediante incubación con anticuerpos monoclonales anti-gfp (Roche). Como se muestra en en la Fig. 2B, se detectaron todas las proteínas de fusión a GFP en la misma membrana, observándose tal y como se esperaba una disminución en el grado de expresión de las proteínas de fusión directamente proporcional a su tamaños. De esta forma, las proteínas de fusión más pequeñas como la PFG40 fueron detectadas más rápidamente que proteínas de mayor tamaño como la proteína gigante pfg43, la cual se pudo detectar claramente con anticuerpos anti HERC1 (Fig. 2C). Inmunoprecipitación 40 4 A modo de otra aplicación de electroforesis de proteínas SDS-PAGE, se realizó la inmunoprecipitación de HERC1 con anticuerpos específicos anti-herc1 en lisados de células HEK-293. HERC1 y sus proteínas asociadas (CHC: cadena pesada de la clatrina; Hsp 70; CLC: cadena ligera de la Clatrina) fueron separadas con el gel y transferidas a una membrana de PVDF. Se analizaron las proteínas usando anticuerpos específicos (Fig. 2D). En resumen, todos estos ejemplos destacan la capacidad del gel para analizar simultáneamente con una elevada resolución y definición, proteínas con peso molecular muy elevado o muy pequeño, ampliando las utilidades de la electroforesis en gel SDS-PAGE

6 REIVINDICACIONES Gel de poliacrilamida que comprende: (i) una parte inferior que tiene un gradiente de concentración de poliacrilamida dentro del intervalo de 3% a 20% y una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 60:1 a 20:1; y (ii) una parte superior que tiene una concentración de poliacrilamida en el intervalo de 3% a 10% y una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 100:1 a 70:1; donde ambas partes forman una única capa. 2. Gel según la reivindicación 1, donde la parte inferior tiene un gradiente de concentración de poliacrilamida dentro del intervalo de 4% a 18% y una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 0:1 a 30:1. 3. Gel según la reivindicación 2, donde la parte inferior tiene un gradiente de concentración de poliacrilamida desde el 6% al 1% y una proporción acrilamida:entrecruzador de 40:1. 4. Gel según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la parte superior tiene una concentración de poliacrilamida en el intervalo de 4% a 8% y una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 90:1 a 80:1.. Gel según la reivindicación 4, donde la parte superior tiene una concentración de poliacrilamida del 4% y una proporción acrilamida:entrecruzador de 80:1. 6. Gel según cualquiera de las reivindicaciones 1-, donde el entrecruzador es bisacrilamida Procedimiento para obtener el gel de poliacrilamida según se define en la reivindicación 1, que comprende los siguientes pasos: (a) verter en un generador de gradiente soluciones que comprenden acrilamida y entrecruzador, adecuadas para obtener un gradiente de concentración de poliacrilamida dentro del intervalo de 3% a 20% y una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 60:1 a 20:1; (b) añadir una segunda solución que comprende acrilamida y entrecruzador, adecuada para obtener una concentración de poliacrilamida en el intervalo de 3% a 10% y una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 100:1 a 70:1; y (c) dejar polimerizar las soluciones de los pasos (a) y (b) al mismo tiempo para formar una única capa. 8. Procedimiento según la reivindicación 7, donde en el paso (a) el gradiente tiene una concentración de poliacrilamida dentro del intervalo de 4% a 18%, y una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 0:1 a 30:1. 9. Procedimiento según la reivindicación 8, donde en el paso (a) el gradiente tiene una concentración de poliacrilamida desde el 6% al 1%, y una proporción acrilamida:entrecruzador de 40: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7-9, donde en el paso (b) la concentración de poliacrilamida está en el intervalo de 4% a 8%, y tiene una proporción acrilamida:entrecruzador seleccionada dentro del intervalo de 90:1 a 80: Procedimiento según la reivindicación 10, donde en el paso (b) la concentración de polacrilamida es 4% y la proporción acrilamida:entrecruzador de 80: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7-11, donde el entrecruzador es bisacrilamida. 13. Uso del gel de polacrilamida según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para la separación de proteínas por electroforesis. 14. Uso según la reivindicación 13, para separar simultáneamente proteínas de muy diferentes tamaños, de kda a más de 200 Kda. 1. Kit para llevar a cabo el procedimiento según se define en cualquiera de las reivindicaciones 7-12, que comprende cantidades apropiadas de acrilamida, de entrecruzador y de un tampón adecuado. 6

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9 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 ES Nº de solicitud: Fecha de presentación de la solicitud: Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TÉCNICA 1 Int. Cl.: Ver hoja adicional DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría Documentos citados Reivindicaciones afectadas A W. P. CAMPBELL et al., "Electrophoresis of small proteins in 1-1 highly concentrated and crosslinked polyacrylamide gradient gels", Anal. Biochem., 1983, vol. 129, páginas 31-36, ver páginas A Z. KHALKHALI-ELLIS, "An improved SDS-polyacrylamide gel 1-1 electrophoresis for resolution of peptides in the range of KDa", Prep. Biochem., 199, vol. 2, nº 1&2, páginas 1-9. A US A1 (C. M. PANATTONI) , ejemplos 1,2; 1-1 reivindicaciones. A US A (R. M. KRAUSS et al.) , columna 4, 1-1 líneas 6-9; reivindicaciones. A WO A1 (AMRESCO) , reivindicaciones. 1-1 A J. MARGOLIS et al., "Improvement of pore gradient 1-1 electrophoresis by increasing the degree of cross-linking at high acrylamide concentrations", J. Chromatogr., 197, vol. 106, páginas , ver página 207. Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica El presente informe ha sido realizado para todas las reivindicaciones O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud para las reivindicaciones nº: Fecha de realización del informe Examinador Página E. Dávila Muro 1/2

10 INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA Nº de solicitud: CLASIFICACIÓN DEL OBJETO DE LA SOLICITUD C08F 120/6 ( ) C08F 2/10 ( ) G01N 27/26 ( ) G01N 27/447 ( ) Informe del Estado de la Técnica (hoja adicional) Página 2/2