ES A1 ESPAÑA 11. Número de publicación: Número de solicitud:

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA Número de publicación: Número de solicitud: Int. CI.: A61K 31/336 ( ) C12N 5/0797 ( ) A61P 25/28 ( ) 12 SOLICITUD DE PATENTE A1 22 Fecha de presentación: Fecha de publicación de la solicitud: Solicitantes: UNIVERSIDAD DE CÁDIZ (100.0%) OTRI-Vicerrectorado de i+d+i C/ Benito Pérez Galdós, s/n Cádiz ES 72 Inventor/es: CASTRO GONZÁLEZ, Carmen; HERNÁNDEZ GALÁN, Rosario; MACÍAS SÁNCHEZ, Antonio José; ECHEVARRI, Fernando y GERIBALDI DOLDÁN, Noelia 54 Título: COMPOSICIÓN CAPAZ DE PROMOVER LA PROLIFERACIÓN DE CELULAS MADRE NEURALES. 57 Resumen: Composición capaz de promover la proliferación de células madre neurales. Esta invención está relacionada con el empleo del compuesto 3,12-di-O-acetil-8-O-tigloilingol (de aquí en adelante ELAF) o una sal farmacológicamente activa de dicho compuesto, para favorecer la proliferación de precursores neurales o células madre neurales en cultivo. Adicionalmente, también se relaciona con el empleo del mismo compuesto para la elaboración de una composición farmacéutica útil en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central que cursen con perdida neuronal. ES A1

2 COMPOSICIÓN CAPAZ DE PROMOVER LA PROLIFERACIÓN DE CELULAS MADRE NEURALES. SECTOR DE LA TÉCNICA 5 10 Esta invención está relacionada con el empleo del compuesto 3,12-di-0-acetil-8-0 tigloilingol (de aquí en adelante ELAF) o una sal farmacológicamente activa de dicho compuesto, para favorecer la proliferación de precursores neurales o células madre neurales en cultivo. Adicionalmente, también se relaciona con el empleo del mismo compuesto para la elaboración de una composición farmacéutica útil en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central que cursen con perdida neuronal. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La existencia de regeneración de lesiones a partir de células madre neurales en el sistema nervioso central, se ha descrito principalmente en modelos de isquemia transitoria global o focal, epilepsia y en lesiones por traumatismo craneal, entre otras. Así en modelos de isquemia, se ha comprobado que en la zona lesionada, aparecen nuevas neuronas que se han podido generar in situ por activación de células madre locales, o como resultado de la migración de precursores desde las áreas neurogénicas (giro dentado y zona subventricular). En un modelo de isquemia transitoria global se ha observado un aumento de la proliferación de precursores neurales en el giro dentado (Liu, J et al. Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils. J Neurosci 18: , 1998) y un efecto similar puede observarse en modelos de isquemia focal (Jin, K. et al. Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat. Proc Natl Acad Sci USA 98: , 2001), así como en modelos de epilepsia (Parent, JM et al. Dentate granule cell neurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant network reorganization in the adult rat hippocampus. J Neurosci.17: , 1997). 2

3 De forma similar, el efecto se observa en otra de las zonas neurogénicas, la zona subventricular (Fallan, J. et al. In vivo induction of massive proliferation, directed migration, and differentiation of neural cells in the adult mammalian brain. Proc Natl Acad Sci USA 97:14,686-14,691, 2000). Los precursores neurales proliferantes S en estas regiones neurogénicas, estimulados tras la lesión, dan lugar a la producción de nuevos neuroblastos que, eventualmente, migran en dirección a la zona lesionada. Cualquiera que sea su origen, la capacidad de regeneración es muy escasa, habiéndose descrito una reposición neuronal entre 0,2 y 10%, según el área afectada y el tipo de lesión (Arvidsson, A. et al. Neuronal replacement from endogenous 10 precursors in the adult brain after stroke. Nat Med 8: , 2002; Nakatomi, H et al. Regeneration ofhippocampal pyramidal neurons after ischemic brain injury, by recruitment of endogenous neural progenitors. Cell 110: , 2002; Teramoto, T. et al. EGF amplifies the replacement ofparvalbuminexpressing striatal interneurons after ischemia. J Clin Invest. 111: , 2003). El hecho de que 15 haya una respuesta neurogénica a la lesión hace pensar que la formación de nuevas neuronas sea un mecanismo eficaz en la reparación de pequeñas lesiones, que permanecen silentes precisamente porque las neuronas que hacen apoptosis son reemplazadas, al menos en parte, por neuronas de nueva formación. Un estudio reciente demuestra que en los animales que han sufrido un traumatismo craneal, se 20 incrementa la neurogénesis en el giro dentado del hipocampo y posteriormente estos animales recuperan su capacidad de realizar tareas de memoria especial. Sin embargo, si en estos animales se eliminan selectivamente las células madre que comienzan a dividirse en el hipocampo como consecuencia del daño inducido por el traumatismo, estos animales no pueden recuperar la capacidad para realizar tareas de 25 memoria espacial (Blaiss CA, Yu TS, Zhang G, Chen J, Dimchev G, Parada LF, Powell CM, Kemie SG. Temporally specified genetic ablation of neurogenesis impairs cognitive recovery after traumatic brain injury. J Neurosci : ), demostrando así que la reposición neuronal en estas regiones tiene un efecto sobre la recuperación de la memoria tras un traumatismo craneal. Adicionalmente, la 30 aparición de neurogénesis en lesiones cerebrales, se ha demostrado también en humanos, concretamente se ha podido observar que en muestras de cerebro de 3

4 pacientes sometidos a cirugía tras una lesión por traumatismo craneal, aparecen en la zona de la corteza cerebral alrededor de la lesión, células madre neurales proliferantes y neuroblastos (Zheng W, Zhuge Q, Zhong M, Chen G, Shao B, Wang H, Mao X, Xie L, Jin K. Neurogenesis in Adult Human Brain after Traumatic Brain Injury. J Neurotrauma [Epub ahead ofprint] Sin embargo, las lesiones graves o las experimentales con mayor pérdida neuronal no pueden ser resueltas, a menos que se establezcan medidas terapéuticas eficaces para incrementar de forma significativa el proceso neurogénico. Una de las alternativas que podría contribuir a resolver, los problemas clínicos que plantean las enfermedades que cursan con pérdida neuronal es el transplante de células madre que puedan posteriormente generar nuevas neuronas. Varios laboratorios han intentado esta estrategia en modelos animales a los que se han transplantado células madre de origen embrionario (Cao et al. Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted toa gliallineage. Exp Neurol.167:48-58, 2001), células madre neurales de animales adultos (Pluchino, S. et al. Jnjection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model ofmultiple sclerosis. Nature 422: , 2003), o bien células procedentes de células madre sometidas a diferentes grados de diferenciación in vitro. El fenómeno más generalmente observado es que, las células madre que se implantan en las zonas neurogénicas del cerebro (por ejemplo, la zona subventricular o el bulbo olfativo en roedores) se diferencian a neuroblastos y se convierten en neuronas maduras pero no ocurre este mismo fenómeno en las zonas no neurogénicas del cerebro. (Herrera, D.G. et al. Adult-derived neural precursors transplanted into multiple regions in the adult brain. Ann Neurol. 46:867-77, 1999; Mligiliche, NL.. et al. SurVival of neural progenitor cells from the subventricular zone of the adult rat after transplantation into the host spinal cord of the same strain of adult rat. Anat Sci Int. 80:229-34, 2005). Por lo tanto uno de los problemas con el que se enfrenta la presente invención, es que, si bien las células madre que se implantan en las zonas neurogénicas del cerebro (por ejemplo, la zona subventricular o el bulbo olfativo en roedores) se diferencian a neuroblastos y se convierten en neuronas maduras, cuando el transplante se produce 4

5 en otras zonas, inician la ruta de diferenciación glial. En las lesiones que ocurren en zonas no neurogénicas aparecen precursores neurales proliferantes que posteriormente podrían diferenciarse y la fuente endógena de precursores neurales en estas regiones es la glía parenquimal. Estas células de glía se activan tras una lesión y 5 dan lugar a precursores neurales la mayoría de los cuales se diferencian a células de glía y muy pocas a neuronas. Adicionalmente y sin perjuicio de lo anterior, la presente invención también se enfrenta al problema de elegir la fuente de los precursores a trasplantar a la hora de realizar este tipo de trasplantes. Las células madre embrionarias diferenciadas in 10 vitro a células madre neurales o los precursores neurales fetales son una de las fuentes más abundante. Sin embargo, no es fácil encontrar donantes de precursores embrionarios y fetales por lo que sería de gran utilidad poder aislar precursores neurales de cerebro adulto, cultivarlas y expandirlas in vitro para su posterior uso en trasplantes. Así, identificar agentes que favorezcan la expansión de los precursores 15 neurales en cultivo resultará de gran utilidad en el desarrollo de terapias regenerativas del sistema nervioso. 5

6 DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS S Fig l. Ensayo de neuroesferas: efecto de ELAF sobre cultivos de precursores neurales in vitro. A. Imágenes de microscopía de contraste de fase representativas de cultivos de precursores neurales crecidos en presencia y ausencia de ELAF (1 O 11M). En todos los casos la proliferación se estimulaba mediante la adición de los factores de crecimiento EGF+bFGF al medio de cultivo. 10 B. Efecto de concentraciones crecientes de ELAF sobre el tamaño de las neuroesferas (* p<0.01 en Test T-student en relación al control sin ELAF). C. Efecto de ELAF (10 11M) sobre el número total de células en los cultivos de neuroesferas Fig 2. Ensayo de neuroesferas: efecto de ELAF sobre cultivos de precursores neurales in vitro en presencia del inhibidor de las isoformas clásicas y nóveles de PKC G A. Imágenes de microscopía de contraste de fase representativas de cultivos de precursores neurales crecidos en presencia y ausencia de ELAF ( 1 O 11M) y con el inhibidor de PKC G En todos los casos la proliferación se estimulaba mediante la adición de los factores de crecimiento EGF+bFGF al medio de cultivo. B. Efecto de ELAF 101-1M sobre el tamaño de las neuroesferas en presencia y ausencia del inhibidor de PKC (* p<0.01 en Test T-student en relación al control sin ELAF). 25 6

7 Fig 3. Inmunocitoquímica: efecto de ELAF sobre la proliferación de precursores neurales in vitro. A. Imágenes de microscopía de fluorescenciade fase representativas de cultivos de precursores neurales crecidos en presencia y ausencia de ELAF (1 O.tM) en los que 5 se ha detectado la proteína marcadora de células en ciclo celular Ki67. En todos los casos la proliferación se estimulaba mediante la adición de los factores de crecimiento EGF+bFGF al medio de cultivo. B. Efecto 10.tM ELAF sobre el porcentaje de células Ki67+ (* p<0.01 en Test T student en relación al control sin ELAF). 10 Fig 4. Ensayo de neuroesferas: Efecto de ELAF -1 sobre cultivos de precursores neurales in vitro. A. Imágenes de microscopía de contraste de fase representativas de cultivos de precursores neurales crecidos en presencia y ausencia de ELAF -1 (1 O.tM). En todos 15 los casos la proliferación se estimulaba mediante la adición de los factores de crecimiento EGF+bFGF al medio de cultivo. B. Efecto de concentraciones crecientes de ELAF-1 sobre el tamaño de las neuroesferas (* p<0.01 en Test T-student en relación al control sin ELAF-1). 20 7

8 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención resuelve el problema de generación de nichos neurogénicos tanto en zonas neurogéncias como no neurogénicas del Sistema Nervioso Central, basándose en el empleo del compuesto 3,12-di-0-acetil-8-0- tigloilingol. 5 Este compuesto favorece la proliferación de los cultivos celulares de precursores neurales y, perfundido dentro del cerebro lesionado, favorece la proliferación de precursores neurales que después se diferencien a neuronas y puedan reparar el tejido dañado. Este nuevo fármaco permite superar la inhibición de la neurogénesis fuera de 10 regiones neurogénicas y favorecer la generación de nuevas neuronas en estas regiones a partir de precursores neurales, bien endógenos o bien trasplantados. Por lo tanto, a la hora de regenerar lesiones, en la región no-neurogénica de la zona lesionada ELAF incrementa la probabilidad de que las células madre endógenas como las trasplantadas puedan dar lugar a neuronas maduras y funcionales. 15 Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención, comprende el uso del compuesto 3,12-di-0-acetil-8-0-tigloilingol (de aquí en adelante ELAF) con número CAS y cuya estructura química se muestra a continuación: Estructura 1: HÓ 20 o sales farmacológicamente activas del mismo, para la elaboración de un medicamento (de aquí en adelante composición farmacéutica de la presente invención) para el tratamiento de enfermedades o lesiones que cursen con perdida neuronal. Alternativamente, el primer aspecto de la presente invención se refiere al compuesto ELAF o sales farmacológicamente activas del mismo para su uso en el 25 tratamiento de enfermedades o lesiones que cursen con perdida neuronal. 8

9 5 10 En un aspecto concreto de la presente invención, la composición farmacéutica de la presente invención además comprende precursores neurales o células madre neurales. En un aspecto aún más concreto de la presente invención, la composición farmacéutica de la presente invención comprende al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. En el contexto de la presente invención, se entiende por precursores neurales o células madre neurales a aquellas células madre aisladas del tejido neural adulto o fetal, que presentan capacidad de auto-replicarse, pero una capacidad de diferenciación limitada, pues sólo pueden diferenciarse hacia los tres subtipos de células del linaje neural: neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. En un aspecto particular de la presente invención, las enfermedades o lesiones que cursan con pérdida neuronal son las seleccionadas de la lista que consiste en: Enfermedades neurodegenerativas: Se producen como consecuencia de la muerte neuronal precoz. Las más frecuentes son la enfermedad de Alzheimer, con pérdida neuronal en el hipocampo y corteza cerebral fundamentalmente, la enfermedad de Parkinson, con muerte selectiva de neuronas en la sustancia negra, o la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), con déficit de neuronas en la médula espinal. Traumatismo craneoencefálico: es una lesión de origen traumático que incide sobre el cráneo, con afectación cerebral. El daño puede ser focallimitado a una sola área del cerebro--o involucrar a más de un área del cerebro. En el contexto de esta invención el traumatismo craneoencefálico puede producir daño cerebral por muerte neuronal que podría ser tratado mediante terapias dirigidas a favorecer la regeneración neuronal. Lesión hipóxico-isquémica: Reducción del flujo sanguíneo cerebral hasta niveles que son insuficientes para mantener el metabolismo necesario para la normal función y estructura del cerebro. En los adultos, la isquemia es causada fundamentalmente por accidentes cerebrovasculares, que pueden ser focales (de origen isquémico, hemorrágico o mixto), o múltiples (como en la demencia multiinfarto ). En el recién nacido, dicha hipoxia/isquemia se debe 9

10 fundamentalmente a sufrimiento fetal o perinatal. En el contexto de la presente invención la hipoxia-isquemia es una condición que produce sufrimiento celular debido a la falta de aporte de oxígeno al tejido cerebral que en la mayoría de los casos produce muerte neuronal. S Infecciones del SNC: Afectación cerebral por distintos agentes infecciosos que originan meningitis, encefalitis o meningoencefalitis. En el contexto de esta invención, las infecciones del SNC originan sufrimiento celular bien directamente o indirectamente por el edema cerebral que originan, pudiendo causar muerte neuronal 10 Epilepsia: Enfermedad crónica caracterizada por uno o varios trastornos neurológicos que deja una predisposición para generar convulsiones recurrentes, que suele dar lugar a consecuencias neurobiológicas, cognitivas y psicológicas. 15 En un aspecto aún más particular de la presente invención, las enfermedades o lesiones que cursan con pérdida neuronal son isquemia cerebral focalizada, traumatismo craneoencefálico con daño neuronal, Parkinson, epilepsia y esclerosis lateral amiotrófica. Un segundo aspecto de la presente invención, se refiere al uso in vitro de ELAF para favorecer la proliferación de precursores neurales o células madre neurales. 20 Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a un método (de aquí en adelante método de la presente invención) para la proliferación de células madre neurales o precursores neurales in vitro que comprende: 25 a. poner en contacto células madre neurales o precursores neurales con un rango de concentración desde 1 pmol/l a 40..tmol/L de ELAF, en un medio que no impida la proliferación de las células madre neurales o precursores neurales y que comprenda el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y/o el factor básico de crecimiento de fibroblastos (bfgf); y b. cosechar posteriormente las células. 10

11 Para utilizar el ELAF en un cultivo in vitro es preferible disolverlo previo a su utilización en una solución que pueda disolver tanto el compuesto como su sal farmacéuticamente aceptada. Ejemplos del disolvente pueden ser dimetilsufóxido, agua o similares. Adicionalmente este compuesto puede estar disuelto en tampón fosfato salino (PBS). En un aspecto particular de la invención, para cultivar las células madre neurales con ELAF se añade ELAF en un rango de concentración desde 1 pmol/l a 40..tmol/L. Las células madre se cultivan en flotación a una densidad de 20 a 200 x 10 6 células/l. El compuesto se añade a un cultivo estático a 37 C durante 1 a 14 días en una atmósfera de 5% C02, cambiando el medio de forma total o parcial cada dos días. El medio en el que se cultivan las células puede ser cualquier medio que no impida la proliferación de las células madre neurales, como ejemplo se puede utilizar preferentemente un medio Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)/F-12 (1: 1 ), que contenga 2% del suplemento B27 (Invitrogen), 2mM L-glutamina y 2..tg/ml de gentamicina. Adicionalmente el medio debe contener bien el factor de crecimiento epidérmico (EGF), preferiblemente a una concentración 20..tg/L, el factor de básico de crecimiento de fibroblastos (bfgf), preferiblemente a una concentración de 1 O..tg/L, o una mezcla de ambos. Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere a un medio de cultivo (de aquí en adelante medio de cultivo de la presente invención), adecuado para la proliferación de células madre neurales o precursores neurales, que comprenda ELAF en un rango de concentración de 1 pmol/l a 40..tmol/L. Un quinto aspecto de la presente invención se refiere al uso del medio de cultivo de la presente invención para la proliferación de células madre neurales o precursores neurales. Un sexto aspecto de la invención se refiere a un población de células madre neurales o precursores neurales obtenibles por el método de la presente invención. 30 Un séptimo aspecto de la presente invención se refiere al uso de la población de células madre neurales o precursores neurales obtenibles por el método de la presente 11

12 invención para la elaboración de un medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades o lesiones que cursen con perdida neuronal. S Por último, los inventores de la presente invención han constatado como compuestos estructuralmente similares a ELAF no presentan actividad favorecedora de la proliferación de precursores neurales. En este sentido, en la Fig. 4 se muestra como el compuesto 8D,15D-diacetoxi-3D-(2-metilpropanoiloxi)-2DH,4DH,9DH,11 DHlatira-5E,12E-dien-14-ona (de aquí en adelante ELAF12-1), con número CAS y la siguiente estructura química: 10 no es capaz de favorecer de la proliferación de precursores neurales. Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos de la presente invención y en ningún lugar han de entenderse como limitativos de la misma

13 EJEMPLOS EJEMPLO l. Efecto de 3,12-di-0-acetil-8-0-tigloilingol CELAF) sobre las células madre neurales Se ha investigado la actividad biológica del compuesto ELAF sobre las células madre neuronales extraídas de la zona subventricular de ratones postnatales de 7 días. Para ello las paredes laterales de los ventrículos laterales de la zona subventricular de ratones P7, fueron extraídas y disociadas enzimáticamente en líquido cefaloraquídeo (LCR) Ca2 bajo, Mg2 alto (5 mm KCl, 124 mm NaCl, 3.2 mm MgCh, 100.tM CaCh, 26 mm NaHC03, and 10 mm glucosa) suplementado con 1 mg/ml de tripsina y 0.2 mg/ml de ácido quinurénico calentado previamente a 37 C durante 15 minutos. Se incubó a 37 en estufa 13 minutos. El tejido fue centrifugado a r.p.m 5 minutos y resuspendido en LCR normal (5 mm KCl, 124 mm NaCl, 1.3 mm MgCh, 2 mm CaCh, 26 mm NaHC03, y 10 mm glucosa). Fue incubado en estufa 5 minutos y centrifugado en las mismas condiciones. Luego, las células fueron resuspendidas en Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)/F-12 (1:1) suplementado con 0.7 mg/ml de ovomucoide y disgregadas mecánicamente con una pipeta Pasteur con el diámetro reducido a la mitad. Después fueron centrifugadas nuevamente y resuspendidas en 6 ml de medio definido de neuroesferas ( 45ml de (DMEM)/F-12, 900.tL de B 27, 2mM L-glutamina y 2.tg/ml de gentamicina) suplementado con 6.tL de EGF 20ng/ml y bfgf 1 Ong/ml, y mantenido a 37 en atmósfera con 5% C02. Después de 1-2 días, los agregados celulares que se forman son lo que llamamos neuroesferas. Los subcultivos fueron pasados cada 3-4 días por centrifugación de neuroesferas y disociación mecánica de las células en 1 ml de medio definido de neuroesferas; después la suspensión de células fue cultivada en nuevos flaks con medio fresco para obtener nuevas neuroesferas. Los experimentos se llevaron a cabo entre los pases 3 y 5. Una vez obtenidas las neuroesferas se probó el efecto de ELAF sobre las células madre neurales a distintas concentraciones. Para ello las neuroesferas fueron centrifugadas y las células fueron resuspendidas y disgregadas en medio definido de 13

14 S neuroesferas y sembradas 20 células /J..lL a la que se le añadieron los factores de crecimiento EGF (20 ng/ml) y bfgf (10 ng/ml). ELAF se añadió al mismo tiempo poniendo en cada pocillo una concentración diferente. Se utilizaron 5 pocillos para las diferentes concentraciones (Control, 1J..lg/ml, 5J..lg/ml, 10J..lg/ml, 50 J..lg/ml) y por triplicado. Los experimentos se llevaron a cabo de modo que la persona que toma las imágenes y realiza la cuantificación no conoce las condiciones de cada uno de los cultivos. El número de nuevas neuroesferas formadas fue contada 72h después en el microscopio invertido y de contraste de fase Olympus IX70. Para medir el área de las neuroesferas se obtuvieron imágenes de 50 neuroesferas por pocillo y se analizaron empleando el sistema de análisis Image J. Se observó cómo el área de las neuroesferas aumentaba en los cultivos tratados con ELAF de manera dosis-dependiente hasta la concentración de 10J..lM. Se observó además que el efecto de esta concentración (1 OJ..lM) inducía un aumento estadísticamente significativo del tamaño de las neuroesferas (Figura 1 A y B), sugiriendo que a esta concentración el compuesto era capaz de facilitar la proliferación celular. El incremento en el tamaño de las neuroesferas coincidía con un incremento en el número total de células en los cultivos tratados con ELAF 1011M (Figura 1 C), apoyando la hipótesis de que el incremento en el tamaño de las neuroesferas se debía a una estimulación de la proliferación celular. 20 EJEMPLO 2. Efecto del inhibidor G06850 de PKC sobre el extracto de ELAF y su acción sobre las células madre neuronales Con el fin de confirmar si el efecto sobre el aumento en el tamaño de las neuroesferas estaba mediado por la capacidad de ELAF de estimular PKC, los precursores neurales fueron cultivados y tratados primero con el inhibidor, de las PKC clásicas y nóveles: G06850, y media hora después fueron tratadas con ELAF loj..lm. Para ello las neuroesferas fueron centrifugadas y las células fueron resuspendidas y disgregadas en medio definido de neuroesferas y sembradas 20 células /J..lL, donde se añadieron los factores de crecimiento EGF y bfgf y el inhibidor G El 14

15 5 10 compuesto 3,12-di-0-acetil-8-0- tigloilingol (ELAF) se añadió 30 minutos después de los inhibidores, esta vez sólo se utilizó la concentración de 1ÜJ.tg/ml, y por triplicado. El experimento se llevó a cabo de manera que la persona que tomaba las imágenes y realizaba la cuantificación no conocía en ningún momento las condiciones de cada uno de los cultivos. El número de nuevas neuroesferas formadas fue contada 72h después en el microscopio invertido y de contraste de fase Olympus IX70. Para medir el área de las neuroesferas se obtuvieron imágenes de 50 neuroesferas por pocillo y se analizaron empleando el sistema de análisis Image J. Tras 72 horas se midió el área de las neuroesferas y se observó como de nuevo en los cultivos tratados con ELAF 1ÜJlM el área de las neuroesferas aumentaban significativamente en comparación con el control (Figura 2A). Sin embargo, el área de las neuroesferas de las células tratadas sólo con el inhibidor y con ELAF 1O..tM en presencia del inhibidor presentaban un área incluso menor que el control, aunque la diferencia no era estadísticamente significativa. 15 EJEMPLO 3. Efecto de ELAF sobre el porcentaje de núcleos Ki67+. Inmunocitoquímica con anti-ki67 para detectar células proliferantes Con el fin de confirmar si el incremento en el tamaño de las neuroesferas se debía a un aumento en la proliferación de los precursores neurales se realizó una inmunocitoquímica frente a Ki67 que detecta aquellos núcleos que expresan el marcador de ciclo celular Ki67 en cultivos control y en cultivos tratados con ELAF 10..tM. Para ello, una vez pasadas las 72 horas de tratamiento, se procedió a fijar las células durante 20 minutos a temperatura ambiente con paraformaldehido (PF A) al 4% preparado en tampón fosfato 0.1 M. Posteriormente se lavaron los pocillos 3 veces con PBS. Se permeabilizaron las células incubando 20 minutos a -20 oc con una solución de etanol/acético (95% etanol absoluto, y 5% de ácido acético glacial). Se lavó 3 veces con PBS y posteriormente se bloqueó con una solución de BSA al 1.5% (albúmina sérica bovina) en PBS; se incubaron durante 30 minutos. Se añadió el anticuerpo anti Ki67 y se dejó durante toda la noche a 4 C en solución de bloqueo. 15

16 S 10 Al día siguiente se lavaron con PBS, se bloquearon nuevamente durante 20 minutos y se incubaron con los anticuerpos secundarios durante 40 minutos en solución de bloqueo en oscuridad. El montaje se realizó con una solución de Electron Microscopy Science y se añadió DAPI en el momento del montaje. Se utilizó un microscopio de epifluorescencia Olympus BX60 para la cuantificación. Se observó que el tratamiento con ELAF aumentaba el porcentaje de células en ciclo celular con núcleos Ki67+, así como el número total de células (núcleos totales teñidos con DAPI) (véase en figura 3). La inhibición de las PKC (clásicas y nóveles) mediante el inhibidor G06850 no afectaba al número de células Ki67+ ni en presencia ni en ausencia de ELAF, aunque podía observarse un mayor porcentaje de núcleos mitóticos. En las células tratadas con ELAF 1 O..M el porcentaje de núcleos Ki67 positivos (Figura 3) era significativamente mayor que en el control, indicando que ELAF activa la proliferación de los precursores neurales. 15 EJEMPLO 4. Obtención de 3,12-di-0-acetil-8-0-tigloilingol (ELAF) a partir de Euphorbia laurifolia Un extracto en acetato de etilo dellatex (100 ml) de E. laurifolia fue filtrado y el disolvente evaporado a presión reducida para proporcionar 4.0g de extracto crudo. Este crudo fue fraccionado mediante cromatografia en columna de gel de sílice, eluida con gradientes crecientes de hexano:acetato de etilo, lo que permitió obtener 20 fracciones de 30 ml cada una. El disolvente de la fracción 12 fue evaporado a presión reducida y el residuo resultante (25 mg) fue purificado mediante cromatografia preparativa en capa fina, empleando gel de sílice como fase estacionaria y una mezcla hexano/acetona (9:1, v/v) como eluyente, para proporcionar 3,12-di-0-acetil-8-0-tigloilingol (10 mg). 16

17 REINVINDICACIONES 1. Uso in vitro del compuesto 3,12-di-O-acetil-8-0-tigloilingol o una sal farmacológicamente activa del mismo, para favorecer la proliferación de precursores neurales o células madre neurales en cultivo. 2. Método para la proliferación de células madre neurales o precursores neurales in vitro que comprende: a. Disolver el compuesto 3, 12-di-O-acetil-8-0-tigloilingol o una sal farmacológicamente activa del mismo en una solución que pueda disolver tanto el compuesto como su sal farmacéuticamente aceptada; y b. Poner en contacto células madre neurales o precursores neurales con la disolución descrita en (a), en un medio adecuado para la proliferación de las células madre neurales o precursores neurales y que comprenda el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y/o el factor básico de crecimiento de fibroblastos (bfgf); y donde el compuesto 3, 12-di-O-acetil-8-0-tigloilingol o una sal farmacológicamente activa del mismo compuesto se halle en el medio en un rango de concentración de 1 pmol/l a 40 Ilmol/L. 3. Precursores neurales o células madre neurales obtenibles por el método de la reivindicación Uso del compuesto 3,12-di-O-acetil-8-0-tigloilingol y/o una sal farmacológicamente activa del mismo, para la elaboración de un medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades o lesiones que cursen con perdida neuronal seleccionadas del grupo que consiste en: isquemia cerebral focalizada, traumatismo craneoencefálico con daño neuronal, Parkinson, epilepsia y esclerosis lateral amiotrófica 5. Uso según la reivindicación 4, que además comprende uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. 6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 4ó 5, que además comprende una población de precursores neurales o células madre neurales. 17

18 7. Uso según la reivindicación 6, donde dicha población de precursores neurales o células madre neurales es la población de la reivindicación 3. 18

19 A control ELAF (10~M) B e i 125!J 'i 120! S 115! &'10.: ; 105 Il!. 100 ~~'F-~'f"~'",."-.'-"f".~~~-~~~ ~ o COReenttacton ELAF (,1M) FIG.l 19

20 control ELAF (loj,lm) A Sin inhibidor G06850 B 250 * contro 11 ~LAF10~M G FIG.2 20

21 DAPI Ki67 control ELAF (10~lM) 20 ' * control ElAF (10uM) FIG.3 21

22 A control ElAF12-1 (loilm) B FIG.4 22

23 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 21 N.º solicitud: Fecha de presentación de la solicitud: Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA 51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas A AVILA L et al. Effects of diterpenes from latex of Euphorbia lactea and Euphorbialaurifolia on human immunodeficiency virus type 1 reactivation. PHYTOCHEMISTRY, VOL: 71 No: 2-3 Pags: ISSN doi: /j.phytochem Ver todo el documento. 1-7 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado para todas las reivindicaciones para las reivindicaciones nº: Fecha de realización del informe Examinador B. Pérez Esteban Página 1/4

24 INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA Nº de solicitud: CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD A61K31/336 ( ) C12N5/0797 ( ) A61P25/28 ( ) Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) A61K, C12N, A61P Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, TXTUS0, TXTUS1, TXTUS2, TXTUS3, TXTUS4, TXTUS5, TXTEP1, TXTGB1, TXTWO1, TXTAU1, TXTCA1, TCPAT, MEDLINE, BIOSIS, NPL, EMBASE, XPESP, XPESP2, REGISTRY, HCAPLUS, GOOGLE ACADEMICS. Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

25 OPINIÓN ESCRITA Nº de solicitud: Fecha de Realización de la Opinión Escrita: Declaración Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Reivindicaciones 1-7 SI Reivindicaciones NO Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Reivindicaciones 1-7 SI Reivindicaciones NO Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986). Base de la Opinión.- La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica. Informe del Estado de la Técnica Página 3/4

26 OPINIÓN ESCRITA Nº de solicitud: Documentos considerados.- A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión. Documento Número Publicación o Identificación Fecha Publicación D01 AVILA L et al. PHYTOCHEMISTRY, VOL: 71 No: Pags: ISSN doi: /j.phytochem Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración La presente solicitud de patente describe el uso del compuesto 3,12-di-O-acetil-8-O-tigloilingol para favorecer la proliferación de células madre neurales, un método para la proliferación de estas células, y el uso del compuesto para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades que cursen con pérdida neuronal. No se ha encontrado en el estado de la técnica ningún documento que divulgue el método y los usos reivindicados en la solicitud, ni documentos que pudieran llevar al experto en la materia a dicho método y usos, por lo que las reivindicaciones 1 a 9 de la solicitud son nuevas y tienen actividad inventiva según los artículos 6 y 8 de la Ley de Patentes. El documento D01 se cita en este informe como un documento del estado de la técnica de la solicitud, pero que no afecta la novedad ni la actividad inventiva de la misma, pues describe un uso del compuesto 3,12-di-O-acetil-8-O-tigloilingol distinto al reivindicado en la solicitud, ya que en D01, el compuesto se emplea para promover la replicación de virus HIV-1 latentes. Informe del Estado de la Técnica Página 4/4