Microbiologia General. Trimestre 16-P

Transcripción

1 Microbiologia General Trimestre 16-P

2 8. Cinética microbiológica

3 CRECIMIENTO MICROBIANO Aumento ordenado de todos los constituyentes químicos de los microorganismos en el número de células o en la masa celular El crecimiento de una población se mide a través de: Métodos directos Número de células Masa celular Cuenta directa: microscopio Cuenta en placa: solo células viables Peso seco: filtración, centrifugación Turbidez: DO de una suspensión de células Métodos indirectos Consumo de sustratos Formación de productos Métodos cinéticos Componentes celulares Actividades enzimáticas azúcares CH 4, etanol Respirometría (O 2 /CO 2 ) ác. nucleicos, proteínas, lípidos, ATP deshidrogenasa

4 Estimación de CRECIMIENTO La selección de un método para cuantificar el crecimiento microbiano, depende de: Propiedades de la biomasa (bacterias, hongos) Propiedades del medio de cultivo Sensibilidad requerida Confianza del método Velocidad necesaria

5 Métodos de crecimiento Medida del número de células Cuenta directa al microscopio: conteo de células totales cámaras especiales para conteo Cuenta en placa: conteo solo de células viables Medida de la masa celular Masa celular número de células se puede estimar uno para conocer el otro Peso seco: se recupera la biomasa del medio de cultivo, se seca y se pesa (filtración, centrifugación) Turbidez: cuantificación de la DO de una suspensión de células curva patrón con número conocido de células

6 Cámaras de recuento Cámara de Neubauer Cálculo de no. de células/ml: X células x 25 cuadros x 10 4 x FD [=] número/cm 3 1 mm 0.2 mm

7 Cámaras de recuento Ventajas: Conteo rápido de microorganismos Limitaciones: No se distinguen las células muertas de las vivas Células pequeñas son difíciles de distinguir Se requiere tiempo y habilidad Se requiere un microscopio de contraste de fases si las células no están teñidas No es buen método para suspensiones muy diluidas (< 10 6 células/ml)

8 Cuenta en placa Fundamento: cada célula viable forma una colonia UFC: se cuantifica el número de células a través del conteo de colonias Ventaja: solo se cuentan las células viables las que pueden reproducirse (dividirse) Dos técnicas (medios sólidos): Siembra en superficie 0.1 ml de muestra sobre la superficie del medio Colonias superficiales Vertido en placa ml de muestra en la caja, se vierte el medio fundido (~45 C) y se homogeneiza Colonias sub-superficiales Colonias superficiales

9 Cuenta en placa: DILUCIONES SERIADAS En los métodos de conteo en placa, el número de colonias: No debe ser muy alto para poder contarlas No debe ser muy bajo para que tenga significado estadístico No. colonias de caldo Muestra a contar Normalmente no se conoce el número de microorganismos viables diluciones usualmente seriadas Incontable

10 Cuenta en placa: DILUCIONES SERIADAS

11 Turbidimetría Método más rápido (espectrofotómetro) Turbidez en una suspensión celular las células dispersan la luz se cuantifica la luz transmitida No. de células DO (turbidez) número de células turbidez (DO) Desventaja: problemas asociados al medio de cultivo y a la presencia de partículas GRAVIMETRÍA Se cuantifica el peso seco de una muestra Filtración (< 0.2 μm) de la suspensión de BM secado peso BM Centrifugación secado peso del precipitado Desventaja: incluye microorganismos muertos, materia orgánica, polímeros extracelulares

13 CRECIMIENTO Incremento ordenado de todos los constituyentes químicos de los microorganismos aumento en la masa microbiana o en el número de células

14 FASES DE CRECIMIENTO Fases de crecimiento Exp Estacionaria Muerte Crecimiento Cultivo en lote o batch Tiempo Lote (batch): el medio NO se renueva crecimiento en un volumen fijo que se altera continuamente por el crecimiento microbiano Continuo: el medio se renueva constantemente número de células y estado metabólico constantes estado de equilibrio

15 CULTIVO EN LOTE (FASES DE CRECIMIENTO) Adaptación o latencia: fase Lag Los microorg. adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales se prepararan para reproducirse Esta fase se puede reducir/evitar: Inoculo lo más activo posible fase exponencial de crecimiento Medio de crecimiento de inoculo parecido al medio de prod.

16 CULTIVO EN LOTE (FASES DE CRECIMIENTO) Exponencial: fase Exp Condiciones óptimas para el crecimiento los microorg. crecen y se multiplican aumento logarítmico La tasa de crecimiento es máxima y el tiempo de duplicación (t d ) es mínimo dx/dt = µx La fase Exp no puede durar indefinidamente p. ej.: Si una bacteria con un t d de 20 min crece a esa velocidad por 48 h población equivalente a 4,000 veces el peso de la Tierra (peso de una bacteria: g)

17 CULTIVO EN LOTE (FASES DE CRECIMIENTO) Fase estacionaria El cultivo está limitado por nutrientes y/o por acumulación de productos Tasa de crecimiento = Tasa de muerte Fase de muerte dx/dt = 0 Generalmente también es logarítmica, pero más lenta que el crecimiento Exp Tasa de muerte > tasa de crecimiento dx/dt = -kx

18 CULTIVO CONTINUO Quimiostato*: tipo más común de cultivo continuo control de la densidad de población y la tasa de crecimiento del cultivo Elementos para su control: Tasa de dilución adición de medio fresco a un flujo constante Nutriente limitante nutriente esencial (C/N) en cantidad limitada Medio fresco Aire/gas estéril Regulador de flujo Espacio con aire Reactor Cultivo *Permite mantener la población celular en fase Exp por largos periodos Efluyente con células

19 CULTIVO CONTINUO Tasa de dilución controla la tasa de crecimiento el microorganismo no crece suficientemente rápido para igualar la tasa de dilución: lavado una parte de la población muere por falta de nutrientes [nutriente limitante] controla la densidad celular (células/ml) Densidad celular (biomasa) [Nutriente] limitante densidad celular Tiempo de duplicación Concentración de sustrato Tasa de dilución

21 DEFINICIONES Crecimiento: incremento ordenado de los constituyentes químicos de los microorganismos en el número de células o en la masa celular Tasa de crecimiento: cambio en el número de células o masa celular por unidad de tiempo Tiempo de duplicación (t d ): tiempo necesario para que a partir de una célula se formen dos (para que una célula se duplique) Número de generaciones (n): número de divisiones celulares en un determinado tiempo = generaciones

23 Crecimiento exponencial Durante la fase exponencial incremento de la población en el que el número de células se duplica cada cierto tiempo t d 1 t d t d 2 2x2 2x2x n Tiempo (h) No. células ,024 t d = tiempo de duplicación

24 Crecimiento exponencial Representando lo anterior en forma gráfica: 4000 Si t d es constante el crecimiento es exponencial t d t d t d t d 1 2 2x n x = x 0 2 n x = número o masa de individuos t d = tiempo de duplicación n = número de divisiones celulares en un determinado tiempo = generaciones

25 Crecimiento exponencial Obtener información sobre la tasa de crecimiento a partir de curvas aritméticas es difícil escala logarítmica (línea recta): Fácil uso podemos estimar tiempos de duplicación (t d ) a partir de resultados experimentales x (No. de células) ln (x ) m = 0.693/t d Tiempo (h) Tiempo (h)

26 TIEMPO DE DUPLICACIÓN El número de veces que se duplica la biomasa en un cierto tiempo esta dado por: n = t/t d Donde: n = número de generaciones t = tiempo de la fase Exp t d = tiempo de duplicación La concentración de biomasa después de un tiempo de crecimiento exponencial puede cuantificarse, en función de la biomasa inicial, a través de: x = x 0 2 n x = x 0 2 t/td Donde: x = número final de células x 0 = número inicial de células

27 TIEMPO DE DUPLICACIÓN Con base en la Ec. ❸, si conocemos las poblaciones inicial y final, podemos calcular el número de generaciones (n) y el tiempo de duplicación (t d ) para expresar la Ec. ❸ en términos de n: x/x 0 = 2 t/td ln (x/x 0 ) = ln2 (t/t d ) ln (x/x 0 ) = (t/t d ) ln x = t + ln x 0 ln x ln x 0 = t d t t d Ec. de una línea recta t/t d = n = ln x ln x

28 TIEMPO DE DUPLICACIÓN: EJEMPLO 1 Con n expresado en términos de parámetros cuantificables (x y x 0 ), puede calcularse el tiempo de duplicación (t d ). P. ej.: Calcula el t d de un cultivo, considerando que: x 0 = 5 x 10 7 células x = 5 x 10 8 células t = 6 h t/t d = t/t d = n = ln x ln x t/t d = 3.3 t d = t/3.3 t d = 6 h/3.3 = 1.8 h

29 TIEMPO DE DUPLICACIÓN: EJEMPLO 2 A partir de una tabla de datos: número de células vs. tiempo x (No. de células) Podemos calcular t d de una gráfica semilogarítmica durante la fase Exp (crecimiento exponencial) En donde la pendiente (m) = 0.693/t d ln x = t t d + ln x 0 y = mx + b Tiempo (h) ln (x) Tiempo (h) t (h) x (células) ln x

30 TIEMPO DE DUPLICACIÓN: EJEMPLO 2 Pendiente = m = Entonces, cómo calculamos t d?: m = 0.693/t d = 0.693/t d t d = 0.693/1.386 t d = 0.5 h ln (x) m = 0.693/t d Tiempo (h)

31 TIEMPO DE DUPLICACIÓN: EJEMPLO 3 Se desea propagar un cultivo de Escherichia coli, cuyo tiempo de duplicación es de 20 min, estime: El número de generaciones de E. coli después de 10 h de fase Exp El número de células producidas si el medio se inocula con una célula, suponiendo que la fase Exp no termina 1. Convertir t d a horas o t a minutos t d (h) = 20 min 1 h 60 min = 0.33 h 2. Cálculo del número de generaciones (n) t/t d = n = ln x ln x n = t/t d n = 10 h/0.33 h n = 30.3

32 TIEMPO DE DUPLICACIÓN: EJEMPLO 3 3. Cálculo del número de células producidas (x) si se inocula con 1 célula (x 0 ) Usando las ecs. (2) o (3): x = 1 * x = x 0 2 n x = x 0 2 t/td x = 1.3 x 10 9 células Usando la ec. (4): t/t d = n = ln x ln x = ln x ln (1) ln x - 0 = 30.3(0.693) ln x = 20.9 x = exp (20.9) x = 1.3 x 10 9 células

33 TIEMPO DE DUPLICACIÓN: ejemplos Microorganismo Temperatura ( C) Tiempo de duplicación (min) Bacillus stearothermophilus Escherichia coli Bacillus subtillis Streptococcus lactis Pseudomonas putida Lactobacillus acidophilus Mycobacterium tuberculosis Bradyrhizobium japonicum Anabaena cylindrica (cianobacteria) Treponema pallidum (espiroqueta) (33 h)

34 8. Cinética microbiológica µ

35 Tasa de crecimiento específica Tasa específica de crecimiento = μ μ es la tasa (velocidad) a la cual una población microbiana se duplica en un tiempo determinado (fase Exp) μ está definida por: μ = Δx 1 = 1 dx Δt x x dt

36 Tasa de crecimiento específica En una gráfica aritmética de x vs. tiempo: μ = pendiente entre 2 puntos el no. de células promedio en esos 2 puntos Pendiente: m = y 2 - y 1 x 2 - x 1 t (h) x (células) (células) 4 células m = = (h) h No. células promedio: (2 + 4)/2 = 3 células x (No. de células) Fase Exp μ = 4 (células/h) 3 células μ = 1.33 h -1 Tiempo (h)

37 Tasa de crecimiento específica De acuerdo con lo anterior: μ = Δx 1 1 dx = Δt x x dt OJO: t tiempo que dura la fase exponencial Despejando dx/x: dx = μ dt x ln x - ln x 0 = μ t si integramos: dx = x 0 x dt = t 0 t ln x = μ t x 0 x = x 0 e µt Y, con base en el crecimiento Exp: ln x = t + ln x 0 t d y = m x + b La pendiente (m) = μ μ = t d

38 Tasa de crecimiento específica Para corroborar que µ en el ejemplo 1 sea correcta: Con la ec. (8) Despejamos t d : µ = t d µ = 1.33 h -1 t d (h) = h -1 t d = 0.5 h

40 PROBLEMA 1 Si la concentración celular al inicio de la fase Exp en un cultivo es de 1 x 10 4 cel/ml y después de 4 h de crecimiento Exp hay 1 x 10 8 cel/ml. Calcular: a) La tasa específica de crecimiento (m) b) El tiempo de duplicación (t d ) c) El número de generaciones (n) Datos: x 0 = 1 x 10 4 cel/ml x = 1 x 10 8 cel/ml t = 4 h Para calcular (a), podemos usar la ec. (6): ln x - ln x 0 = µt ln (1 x 10 4 ) = 9.2 ln (1 x 10 8 ) = 18.4 ( )/4 [h] = µ µ = 2.3 h -1

41 PROBLEMA 1 Para calcular (b), usamos la ec. (8): µ = t d t d (h) = h -1 t d = 0.3 h Para calcular (c), usamos la ec. (4): n = ln x ln x n = n = 13.3

42 PROBLEMA 2 Un fermentador que se inocula con 2 x 10 6 cel/ml inicia su fase de crecimiento Exp después de 2 h. Cuánta biomasa se produce después de 12 h si la bacteria tiene un t d de 3.5 h y la fase Exp no termina? Datos: t d = 3.5 h x 0 = 2 x 10 6 cel/ml t = 12 2 [h] = 10 h x =? Para calcular x, primero necesitamos calcular m ec. (8): µ = µ (h -1 ) = t d h µ = 0.2 h -1 Calculamos x con las ecs. (6) o (7): x = x 0 e µt x = (2 x 10 6 cel/ml) e (0.2*10) x = (2 x 10 6 cel/ml) * (7.4) x = 1.5 x 10 7 cel/ml

43 PROBLEMA 3 La bacteria Streptococcus lactis tiene un tiempo de duplicación de 0.5 h a 37 C. Si se inoculó un fermentador con 1 x 10 8 células/ml Cuánta biomasa se producirá después de 300 min de crecimiento Exp? Datos: t d = 0.5 h x 0 = 1 x 10 8 cel/ml t = 300 min x =? Primero tenemos que pasar TODO a las mismas unidades: 300 min 1 h 60 min = 5 h Podemos calcular x con la ec. (2), pero primero necesitamos calcular n x = x 0 2 n t/t d = n n = 5 h/0.5 h n = 10

44 PROBLEMA 3 Sustituimos n en la ec. (2) x = x 0 2 n n = 10 x 0 = 1 x 10 8 cel/ml x = (1 x 10 8 ) x 2 10 x = (1 x 10 8 ) x (1024) x = 1.02 x cel/ml

45 PROBLEMA 4 Cuánto tiempo tarda un cultivo en alcanzar una concentración de biomasa de 17 g/l si se inoculó con una concentración de 0.4 g/l y la tasa específica de crecimiento fue de 0.8 h -1? Datos: x 0 = 0.4 g/l x = 17 g/l μ = 0.8 h -1 t =? Podemos calcular t con la ec. (5): ln x - ln x 0 = µ t ln (17) = 2.83 t = (ln x - ln x 0 )/µ ln (0.4) = t = [ (-0.92)] / 0.8 h -1 t = 3.75 / 0.8 h -1 t = 4.7 h

46 PROBLEMA 5 En un experimento de laboratorio se obtuvieron los datos de crecimiento de Escherichia coli que se muestran en la tabla. Con base en ellos, calcula: a) La tasa específica de crecimiento (µ) b) El tiempo que tarda en duplicarse la población de E. coli y el número de generaciones X ln X 6.E E E E E E E Tiempo (h) Identificamos la fase Exp t (h) x (células) 0 1.0E E E E E E E E E E E E E+07 ln x

47 La pendiente de la recta es μ: μ = 2.4 h -1 μ = 0.693/t d, entonces: t d = 0.3 h n = t/t d, entonces: td = 0.3 h t =??? t = tiempo que dura la fase exp t = 6-2 [h] = 4 h n = 4 h / 0.3 h n = 14