"DESARROLLO DE LA PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE HIDROLIZADO DE SANGRE BOVINA CON EL USO DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS MICROBIANAS".

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1 "DESARROLLO DE LA PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE HIDROLIZADO DE SANGRE BOVINA CON EL USO DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS MICROBIANAS". TITLE: "INDUSTRIAL PRODUCTION DEVELOPMENT OF BOVINE BLOOD HYDROLYZED BY USING MICROBIAL PROTEOLITYC ENZYMES" Autores: R. A. González*; M. L. Pérez*; N. L. Velunza*; Rodríguez, Bárbara*; G. Ascunse**; M. Redondo***; L. Núñez***; R. Galardi***; G. Sardiñas***; W. García*** *Centro de Estudios de Biotecnología, Universidad de Matanzas "Camilo Cienfuegos". **Empresa de Conservas "Libertad", Colón, Matanzas. ***Empresa Laboratorios Biológicos Farmacéuticos (LABIOFAM). Dirección postal autor principal: América # 6317 e/ Calles 63 y 65 Matanzas Teléfono 3905 RESUMEN. Se describe el proceso de escalado seguido para lograr la producción industrial exitosa de un reconstituyente animal, obtenido mediante hidrólisis enzimática de sangre bovina, utilizando para la hidrólisis un extracto crudo de enzimas proteolíticas microbianas de producción nacional. Se comprobó que la calidad del producto obtenido no tiene diferencias estadísticamente significativas, con el producto que se obtiene empleando la enzima papaína de origen vegetal. ABSTRACT The scaleup process up to success industrial stage of an animal reconstituent obtained by bovine blood enzymatic hydrolysis was described. A microbial proteolytic crude extract, from national production, was utilized for the hemolyzed production. There was not statistical significant differences between this product and the product obtained using plant papain enzyme. PALABRAS CLAVES hidrólisis, enzimas proteolíticas, hemolizado, escalado, papaína, reconstituyente. 1

2 INTRODUCCIÓN. Después de establecida la tecnología de producción industrial del extracto crudo de enzimas proteolíticas microbianas en los fermentadores de la Empresa LABIOFAM 1 en Santiago de las Vegas, se continuaron los trabajos de desarrollo de la aplicación de dicho extracto en diversos usos, tales como la producción de hidrolizados de sangre bovina (hemolizado), vino reconstituyente para la salud humana y solución digerida de carne para caldos de fermentación y el empleo del extracto en el depilado de las pieles en la industria tenera, entre otros posibilidades en estudio. En el caso de la producción de hemolizado, por ser la primera aplicación prevista para el extracto, se ha logrado el mayor avance, llegándose al completamiento del proceso de escalado con su producción a nivel industrial en la planta de Biopreparados de Matanzas. El empleo de las enzimas de origen microbiano, en lugar de las enzimas obtenidas de organismos superiores (animales y vegetales), ha sido una tendencia creciente a nivel mundial, teniendo en cuenta sus innumerables ventajas 2 y esta tendencia se ve reforzada en las condiciones actuales de Cuba, por las dificultades existentes para producir o importar enzimas de organismos superiores. Por esa causa se comenzaron los trabajos encaminados a la obtención de enzimas de origen microbiano 3,4 y se priorizó su empleo en la sustitución de la enzima vegetal papaína, en la producción del hidrolizado de sangre vacuna, conocido comercialmente como hemolizado. En el presente trabajo se describe el proceso de escalado realizado y se brindan los resultados de la comparación del producto obtenido en las distintas escalas (laboratorio, piloto e industrial) con el obtenido empleando la enzima papaína de origen vegetal, mucho más cara y deficitaria en estos momentos. MATERIALES Y MÉTODOS. 1- Proceso de escalado de la producción de hemolizado con el extracto crudo de enzimas proteolíticas bacterianas. 1.1 Escala de laboratorio. Se realizó la hidrólisis enzimática de la sangre bovina en frascos Erlenmeyer de 1 L de capacidad con un contenido de 0.5 L de mezcla inicial, empleando en igualdad de condiciones, la enzima papaína de origen vegetal y el extracto crudo enzimático de origen microbiano, con una actividad enzimática de 100 Unidades Anson 3,4. Para el diseño del experimento se consideraron tres variables fundamentales (temperatura, ph y dosis de extracto) y dos niveles para cada variable, por lo cual se aplicó un diseño factorial 2k, con tres réplicas por análisis5. El avance de la hidrólisis se midió por el incremento del nitrógeno amínico. Para el resto de las condiciones (adición de anticoagulantes, mezclado con otros productos, etc.), se aplicaron las recomendaciones de la tecnología tradicional de la Empresa LABIOFAM para la producción de 2

3 hemolizado con enzima papaína Escala piloto. Para el desarrollo del escalado se tuvo en cuenta las características específicas del proceso en estudio (hidrólisis enzimática discontinua) 7, por lo cual no fue necesario ejecutar la escala de banco y se pudo realizar la escala piloto en frascos de 20 L de capacidad con un contenido de 15 L de mezcla inicial, aplicando las condiciones óptimas obtenidas en la escala de laboratorio. Como testigo se realizó la producción de hemolizado con la enzima papaína, en iguales recipientes y con las condiciones especificadas en la tecnología vigente en LABIOFAM Con el objetivo de obtener suficiente producto para la realización de las pruebas de campo, se produjo una cantidad total de 400 L de hemolizado, la cual, en unión a la obtenida a nivel de laboratorio, se caracterizó y se comparó con la obtenida de forma tradicional. 1.3 Escala Industrial. Para el desarrollo de esta decisiva fase del escalado, se tuvo en cuenta la importancia de asegurar la homogeneidad de la mezcla inicial y de mantener la comparabilidad con el proceso tradicional, por lo cual se priorizó la necesidad de mantener constante la temperatura de operación (45 oc) durante todo el proceso y asegurar un nivel mínimo de agitación. Con este fin se seleccionó uno de los bioreactores de la Planta de Biopreparados de Matanzas, utilizados normalmente para la producción de vino reconstituyente, que disponía de un adecuado control automático de la temperatura y sistema de agitación, con una capacidad total de 1000 L (700 L efectivos). 2. Caracterización del producto obtenido. Se realizó la evaluación físico-química y química del producto obtenido en las tres escalas de producción (laboratorio, piloto e industrial), comparándose los resultados con el hemolizado obtenido con la tecnología tradicional y con la mezcla inicial. Todos los análisis se hicieron por triplicado y para las comparaciones se utilizaron los valores medios obtenidos. Como criterio para definir la igualdad de las medias en las distintas escalas de producción y con respecto al valor obtenido con la tecnología tradicional, se utilizó la distribución t de Student, para lo cual se planteó que si se cumple queµ, se pueden considerar iguales los valores medios de pares de mediciones diferentes, ya sea en escalas diferentes de producción o mediante el empleo de dos tecnologías diferentes (la tradicional y la que emplea enzimas de origen microbiano). La hipótesis se acepta si µ, calculando t para un 95% de significación, en una prueba de dos extremos 5. Los cálculos se hicieron empleando el paquete de programas STATGRAPHICS. La evaluación microbiológica se le realizó tanto a las materias primas como al producto final obtenido, 3

4 determinándose conteo total de mesófilos, presencia de especies patógenas y presencia de Bacillus cereus 8 RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 1 -Escalado. -Escala de laboratorio. A partir de los resultados experimentales obtenidos (Tabla 1) se realizó el ajuste del modelo matemático aplicando el paquete de programas estadístico STATGRAPHICS y se obtuvo como condiciones de trabajo: Dosificación de 2% de extracto crudo, temperatura 45 oc y ph = 8. 4

5 -Escala Piloto. Con los resultados obtenidos en esta escala se logró la confirmación de los valores óptimos de temperatura, ph y dosificación de extracto, obtenidos a nivel de laboratorio y se pudo determinar el tiempo necesario para completar la hidrólisis, el cual estuvo en todos los casos entre 12 y 24 horas, muy inferior al requerido por la enzima papara (48 horas), lo que constituye una ventaja adicional del nuevo proceso. -Escala industrial. La primera producción industrial se realizó con el extracto crudo enzimático obtenido a escala piloto en las instalaciones del Laboratorio de Biotecnología de la Universidad de Matanzas y los buenos resultados obtenidos, avalados por la Empresa productora, sirvieron de estímulo para el completamiento del escalado de la producción del extracto crudo enzimático. El hemolizado obtenido en este primer lote industrial (700 L) también fue caracterizado completamente, y se comparó con el obtenido con la tecnología tradicional. Posteriormente, al culminarse el proceso de escalado de la producción del extracto crudo de Subtilopeptidasa, se empleó el extracto obtenido industrialmente, para la producción de nuevos lotes industriales de hemolizado en la Planta de Biopreparados de Matanzas. 2- Caracterización del hemolizado obtenido en las diferentes escalas. De la evaluación microbiológica, realizada en un trabajo previo 8, se obtuvo que la población microbiana en general es baja y los microorganismos presentes no son patógenos para el hombre ni para los animales superiores, y como resultado general de la caracterización se obtuvo que el hemolizado producido cumple con los requerimientos establecidos por las normas vigentes y no se hallaron diferencias, significativas estadísticamente, con el hemolizado tradicional. En el presente trabajo se realizó también la comparación del hemolizado producido con el extracto crudo obtenido a escala piloto y el hemolizado obtenido con el extracto producido industrialmente y no se observaron diferencias significativas estadísticamente entre ambas producciones, lo que avala también la calidad del escalado realizado con la producción de extracto crudo enzimático. A manera de ejemplo de la caracterización realizada, se muestra el análisis comparativo de los valores promedios de los análisis del contenido de nitrógeno amínico, proteico y total de la mezcla inicial y de los hemolizados obtenidos (Tabla 2), en la que se aprecia el incremento en el contenido de nitrógeno amínico que ocurre al realizarse la hidrólisis enzimática y la diferencia que existe entre los valores obtenidos en las distintas escalas de producción de hemolizado con extracto crudo, así como entre el hemolizado producido con el extracto crudo y el producido con la enzima papaína. El tratamiento estadístico de dichas diferencias se realizó con el empleo del paquete de programas STATGRAPHICS y en todos los casos se comprobó que µ, por lo 5

6 cual se aceptó la hipótesis de µ, lo que demuestra que las diferencias no son significativas estadísticamente. Como resultado final del trabajo se llegó a obtener una nueva tecnología de producción de hemolizado de sangre bovina, en la que se emplea el extracto crudo enzimático microbiano de producción nacional. Esta tecnología ha sido aceptada por la empresa productora (LABIOFAM) en sustitución de la tecnología tradicional que empleaba la enzima papaína. 6

7 CONCLUSIONES. 1- Se ha podido completar con éxito el escalado hasta nivel industrial, de la producción de un reconstituyente animal de alta calidad, hidrolizado de sangre bovina (hemolizado), a partir del extracto crudo de enzimas proteolíticas microbianas desarrollado por el Laboratorio de Biotecnología de la Universidad de Matanzas.. 2- Se ha comprobado la calidad del producto obtenido y el efecto de reducción del tiempo requerido para la hidrólisis, que provoca la sustitución de la enzima papaína, de origen vegetal, por el extracto crudo enzimático de origen microbiano. 3- Se obtuvo una tecnología de producción de hidrolizado de sangre bovina con el empleo del extracto crudo de enzimas proteolíticas microbianas que sustituye la tecnología tradicional que empleaba la enzima vegetal papaína. BIBLIOGRAFÍA 1- González, R. A.; Pérez, M. L.; Velunza, N.; Rodríguez, Bárbara; Redondo, M.; Sánchez, L., "Producción Industrial de un extracto crudo de enzimas proteolíticas por cultivo sumergido de una cepa de Bacillus subtilis", Centro de Estudios de Biotecnología, Universidad de Matanzas, 1994, (n/p). 2- Frost, G. M. ; Moss, D. A., "Production of Enzymes by Fermentation", Chapter 3, "Biotechnology", Vol. 7 a, Rehm, H. J.; (editors), VCH Verlagsgessellschaft, Weinheim, Pérez, M.; Velunza, N.; Rodríguez, Bárbara; "Producción de enzimas proteolíticas de origen microbiano con diferentes substratos inductores", Revista CIENCIAS BIOLÓGICAS, No. 3, pag. 67, Pérez, M.; Velunza, N.; Rodríguez, Bárbara, "Optimización de la acción catalítica de proteasas obtenidas a partir de la cepa de Bacillus subtilis GE/20" Revista CIENCIAS BIOLÓGICAS, No. 3, pag. 77, López Planes, R., "Diseño Estadístico de Experimentos", Editorial Científico -Técnica, La Habana, 1988 (203 pags.). 6- LABIOFAM (Empresa de Laboratorios Biológicos Farmacéuticos), "Norma Tecnológica para la producción de Hemolizado" Santiago de las Vegas, La Habana, González, R. A., "Principios Básicos de Escalado" (Curso de Pos Grado), Vice Rectoría de Investigaciones y Postgrado, Universidad de Matanzas "Camilo Cienfuegos", Matanzas, Velunza, N.; Pérez, M.; Ascunse, G.; García, P. P., "Estudio de la calidad microbiológica de dos biopreparados", Centro de Estudios de Biotecnología, Universidad de Matanzas, 1994 (n/p). 7