Uso y cuidado del microscopio de campo claro.

Transcripción

1 OBJETIVOS. Uso y cuidado del microscopio de campo claro. Al finalizar la práctica el estudiante será capaz de: Aplicar los cuidados básicos de un microscopio óptico de campo claro. Identificar las partes que componen el microscopio óptico de campo claro. Enfocar adecuadamente el microscopio en todos sus aumentos. INTRODUCCIÓN. El microscopio es una de las herramientas más útiles en Microbiología. Su utilización permite la observación de los microorganismos y con ella, la obtención de datos esenciales para su identificación y estudio tales como: forma, agrupación, tamaño y características tintoriales, por ello es tan importante saber utilizar éste instrumento y desde luego, cuidarlo adecuadamente. MATERIALES. - Microscopio óptico de campo claro - Aceite de inmersión - Preparaciones fijas - Letras (a, b, f, g, r, t) muy pequeñas recortadas de periódico o revistas - Pinceles - Paño limpio - Papel seda MÉTODO Uso de simulador: 1. Abrir la página y seleccionar Virtual microscope. 2. Realizar el ejercicio para enfocar la letra e. 3. Realizar el enfoque de las muestras Root onion, Bacterial capsula y cheek smear. 4. En la bitácora de laboratorio dibujar los esquemas de los enfoques realizados. 5. Como tarea realizar el enfoque de tres ejercicios de Puzzle y los tres de medición (measurement) y entregar los resultados ya sea indicando las acciones que realizaron para obtener la imagen enfocada o las medidas solicitadas en los ejercicios. (anexo 2). NOTA: En esta misma página hay un video sobre la forma de usar un microscopio. Está en inglés. Trabajo con microscopio en laboratorio: 1. Mostrar la manera adecuada de transportar y colocar un microscopio óptico en las mesas de trabajo. 2. Solicitar el equipo y transportarlo a las mesas de trabajo. 3. Mostrar cada una de sus partes así como la forma correcta de limpiarlo utilizando papel seda para los lentes, pinceles y/o un paño para las partes mecánicas y de soporte. 4. Físicamente mostrar el manejo de: pinzas de sujeción, tornillos de la platina y su movimiento, así como el de los tornillos macro y micrométrico. 5. Mostrar la manera correcta de manipular el cable de conexión y la lámpara, el manejo del cabezal y sus cuidados. (1)

2 6. Mostrar las lentes de los oculares, la manera de ajustar dioptrías y distancia interpupilar, señalar sus cuidados. 7. Mostrar las lentes de los objetivos y la manera correcta de girar el revólver (tomándolo por la cintilla muescada y en sentido de las manecillas del reloj) y posicionar los objetivos. Introducir los conceptos de aumento, aumento total, apertura numérica, índice de refracción; utilización de cubreobjetos del grosor recomendado y del aceite de inmersión. Conectar el equipo. 8. Mostrar la utilización de los controles de intensidad de la luz, condensador y diafragma y al manipularlos observar los cambios en la iluminación. 9. Relacionar el diámetro de las lentes de los objetivos con la cantidad de luz requerida. (Se puede utilizar una preparación de cualquier colorante entre porta y cubreobjetos, para demostrar este punto). 10. Señalar importancia de marcar adecuadamente las preparaciones y la forma de reportar resultados. Colocar una preparación en la platina (preparación fija, en fresco ó letras pequeñas). 11. Colocar el revólver en el objetivo de 10x, centrarlo en la preparación. 12. Sin observar a través de los oculares y con la mirada dirigida hacia la platina, llevarla al máximo acercamiento de la lente. 13. Observando a través de los oculares, ajustar el diafragma y el condensador para obtener la iluminación adecuada. 14. Lentamente bajar la platina utilizando el tornillo macrométrico hasta obtener el enfoque de la preparación, afinar el enfoque utilizando el tornillo micrométrico. Ajustar la iluminación hasta obtener el contraste óptimo. 15. Girar el revólver al objetivo de 40x, señalar la importancia de la distancia focal. Afinar el enfoque con el tornillo micrométrico. 16. Enfoque a inmersión: Girar el revólver a la posición media entre los objetivos de 40 y 100x, colocar una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación (recordar el diámetro de la lente) posicionar el objetivo de inmersión, afinar el enfoque con el tornillo micrométrico. 17. Utilizando los tornillos de la platina, realizar un barrido sistemático de la preparación señalando su importancia y aplicaciones. Anotar observaciones. 18. Para retirar la preparación, se baja la platina y se abren las pinzas de sujeción. Las preparaciones se sumergen en un baño sanitizante durante 10 min. antes de ser lavadas con un detergente líquido diluido, agua y esponja. 19. Girar el revólver, limpiar la lente con papel seda (sin tallar).sí se desea observar otra preparación, iniciar con el paso No Finalizado el trabajo, apagar el equipo, realizar su limpieza utilizando papel seda para las partes ópticas, eliminando cualquier resto de aceite de inmersión (sin tallar) y con un paño ó pincel las mecánicas. Arreglar el cable, girar el revólver hacia el objetivo de menor aumento, colocar el cabezal en su posición original y asegurarlo. 21. Entregar el equipo transportándolo adecuadamente. 22. Antes de retirarse, asegurarse que las mesas de trabajo, tarjas y el laboratorio en general quede limpio y ordenado. Precauciones generales. Nunca tocar las lentes con los dedos. No tocar la superficie del papel seda con la que se va a limpiar las lentes. Nunca retire la preparación con el objetivo de inmersión en posición de observación. Las partes mecánicas no deben ser forzadas, el equipo debe ser tratado en todo momento con gran suavidad. En caso de que alguna pieza se atore, comunicar al profesor. Cuando el microscopio no esté siendo utilizado debe permanecer apagado. El microscopio debe ser colocado en el centro de la mesa de trabajo, lejos de las orillas y de la tarja. (2)

3 En caso de derrames accidentales de muestras sobre el microscopio, limpiar las partes afectadas con una solución sanitizante a base de sales cuaternarias de amonio, NUNCA CON CLORO. Sí la partes mecánicas se limpian con un paño, éste no debe dejar pelusa. Nunca tocar las lentes con las manos. La limpieza de las partes internas y lentes del microscopio debe ser realizada por personal especialmente capacitado al respecto. El microscopio deberá ser protegido del polvo cubriéndolo con una funda o en un estuche. Disposición de desechos 1. Los portaobjetos y cubreobjetos rotos ó dañados y que estén limpios deben ser colocados en el contenedor adecuado. Discusión de resultados 1. Cuál es la importancia del uso del microscopio en el laboratorio de microbiología experimental? 2. Por qué crees que es importante cuidar adecuadamente el microscopio en tu laboratorio de microbiología experimental? 3. Qué otros cuidados crees que podamos adoptar en el laboratorio de microbiología experimental para mejorar el cuidado del microscopio? 4. Cuáles crees que sean los errores más comunes que cometen, los alumnos en clase, al manipular el microscopio? Literatura de consulta Leboffe M.J., Pierce B.E Microbiology, laboratory and application.2ª. edición, Morton Publishing Co.,USA. Ketcham, B Microscopy Pre-lab Activities. (Instructional Video y Virtual microscope) Madigan, M. T., J. M. Martinko y J. Parker Brock. Biología de los microorganismos. 10ª Ed. Prentice Hall Iberia. España. Ramírez-Gama, R. M., B. Luna Millán, O. Velásquez Madrazo, L. Vierna García, A. Mejía Chávez, G. Tsuzuki Reyes, L. Hernández Gómez, I. Müggenburg, A. Camacho Cruz y M del C. Urzúa Hernández Manual de Prácticas de Microbiología General. 5ª edición. Facultad de Química, UNAM. México. Stanier,R. Y., J. L Ingraham, M. L Wheelis y P. R Painter, Microbiología. 2ª edición. REVERTÉ, S. A. España Tortora Gerard J., Fonke Beidell R. y Case Christine L Microbiology an Introduction. 5a. ed. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 801 pp (3)

4 ANEXO 1. GUIÓN PARA USO DEL SIMULADOR HOW TO ACCIÓN AT VIEW CHECKLIST Automáticamente aparece una palomita verde en el cuadro amarillo. Control lighting (Control de luz) Pick a slide (seleccionar un portaobjetos) Switch objectives (selección del objetivo) Reposition slide holder (colocar el portaobjetos) Adjust focus More Switch views Adjust oculars Adjust focus Fine tuning Switch objectives 1.Encender con el botón off-on 2.Mover el reostato a 10 (no se realiza en el microscopio del laboratoriol) 3. Abrir el diafragma Real: Abrir la pinza de la platina y colocar el portaobjetos en la esquina. Simulador: Seleccionar la muestra. (Letra e, punta de la raíz de cebolla, cápsula bacteriana, frotis de mejilla. Aparecen en los portaobjetos de arriba abajo del lado superior derecho de la pantalla) Seleccionar el objetivo de observación moviendo el revolver con el cursor (manita) En el simulador empezar con 4X en el real iniciar con 10X Mover el portaobjetos (muestra) con los tornillos que se localizan abajo de la platina. En el simulador se mencionan como bottoms X y Y. Alinear la muestra con el haz de luz Mover el tornillo macrométrico (Coarse focus). Tornillo grande que se localiza junto a la base y tiene unas flechas blancas que señalan hacia arriba y abajo. Indica que ahora estás listo para ver a través de los oculares. Dar click en donde dice You are Looking at the microscope. En este momento aparece en la pantalla la imagen de unos oculares y el campo microscópico. Mover los oculares (abrir o cerrar) hasta tener una sola visión del campo microscópico. Mover el tornillo macrométrico hasta obtener una imagen 1.Enfoque fino para obtener una imagen clara, para ello mover el tornillo micrométrico (tornillo pequeño localizado junto al macrométrico). 2.Centrar la imagen con tornillos XY (campo encerrado en un círculo rojo) 3.Abrir el diafragma iris Cambiar al objetivo de 10X (mover con el revolver). Ajustar la luz con el diafragma iris y enfocar con el tornillo micrométrico Enfocar con el objetivo de 40X y con el de 100X, para ello: 1. Ajustar la luz con diafragma iris 2. Enfocar con el tornillo micrométrico. Real: Antes de colocar el objetivo de 100X es necesario Light on Rheostat at 10 Adjust iris diaphragm Slide chosen Scanning (4X) lens in place Specimen centered (open iris temporarily to do this) Coarse focus Adjust oculars Coarse focus Fine focus Center image Adjust iris diaphragm Adjust iris diaphragm Fine focus Adjust iris diaphragm Fine focus poner una gota de aceite de inmersión. ** Con letras pequeñas se indican las acciones que no se realizan con los microscopios que ocuparemos en el laboratorio o bien, aquellas que no se realizan en el simulador. (4)

5 Puzzles: ANEXO 2 Try this (Ejercicios con el simulador). Each puzzle image is a specimen that is off by a bit. It may be out of focus, uncentered, too much or little light, or several of this. See if you can correct the view. Use the help check list to see how you did. Cada imagen del rompecabezas es un espécimen que puede estar desenfocado, sin centrar, con demasiada o con poca luz, o varias cosas a la vez. Trata de mejorar el enfoque. Puedes utilizar la lista de verificación (check list) para ayudarte a hacerlo. Measurement: These images give you a chance to use the ocular micrometer. Use X & Y controls to move the image. Rotate the top of the right ocular to rotate the micrometer. The size of a single micrometer unit is provided with each example. Estas imágenes te brindan la oportunidad de utilizar el ocular micrométrico. Utiliza los tornillos X y Y para mover la imagen. Rota el ocular derecho para girar la escala del ocular micrométrico. El tamaño de cada unidad (o línea) del micrométrico se indica en cada ejemplo. M1. If each micrometer unit equals 10 micrometers at this magnification, how tall is the letter e, top to bottom? Si cada unidad del ocular micrométrico es igual a 10 micrómetros en este aumento (10X), cuál es la altura de la letra e? M2. If the upper right of the field of view, is a cell that is nearly finished mitosis (chromosomes are mostly pulled apart). If each micrometer unit is equals 1.0 micrometers, how wide is the cell at it s widest point? En la parte superior derecha del campo visual, está una célula que casi acaba la mitosis (los cromosomas se están separando). Si cada línea del ocular es igual a 1.0 micras, cuánto mide la célula en el punto más ancho? M3. There is a small bubble near the top of the field of view. If each micrometer unit is equals 1.0 micrometers at this magnification (100X), what is the diameter of the air bubble? Hay una burbuja pequeña cerca de la parte superior del campo visual. Si cada línea es igual a 1.0 micrómetros en este aumento (100X), cuál es el diámetro de la burbuja de aire? Submit. Dar click en el botón para enviar los resultados y ver si la respuesta es correcta) To rotate the micrometer, drag your cursor around the top of the right ocular cap in a circular motion. Para girar el ocular micrométrico, arrastra el cursor alrededor de la parte superior del ocular derecho con un movimiento circular. (5)

6 Preparaciones húmedas Gota pendiente Preparaciones fijas Tinción simple Preparaciones Microbiológicas Objetivos Al finalizar esta práctica el alumno será capaz de: Realizar diferentes preparaciones microbiológicas a partir de muestras naturales y cultivos puros. Describir las características morfológicas y de locomoción de microorganismos que se encuentran en muestras naturales. Realizar frotis fijos y tinciones simples. Identificar y describir las características morfológicas y de agrupación de bacterias y hongos levaduriformes. Introducción El tamaño de los microorganismos impide detectarlos a simple vista, por lo que es esencial el uso del microscopio. Para que un objeto pueda ser percibido a través del microscopio, este debe poseer cierto grado de contraste con el medio circundante. Para aumentar el contraste de los microorganismos y lograr una mejor observación de los mismos, se emplean diferentes técnicas de tinción, las cuales se basan en la capacidad de los microorganismos para retener (o no) ciertos colorantes lo que depende de la carga de la célula y del colorante. Materiales Muestras: Agua de charco Pulque Alimento en estado de descomposición Cultivos puros de las siguientes bacterias y un hongo: Bacillus sp. Micrococcus luteus Serratia marcescens Staphylococcus sp. Streptococcus sp. Saccharomyces cerevisiae Material por equipo: Microscopio Aceite de inmersión Pipetas Pasteur con bulbo Preparaciones fijas Frascos gotero con azul de metileno, safranina, cristal violeta (6)

7 Material que deben tener los alumnos: Mecheros Asas Portaobjetos excavados Portaobjetos Cubreobjetos Charola para tinción Puente de vidrio Piseta Pinzas de madera para ropa Paño limpio de algodón Papel seda Palillos Vaselina sólida Frasco con una solución de sanitizante para desechar preparaciones Metodología Lavar y desengrasar los portaobjetos y cubreobjetos. Para ello emplear jabón líquido y agua; enjuagar varias veces con alcohol al 95%, ponerlos a secar al aire a temperatura ambiente y flamearlos de 2 a 3 veces Preparaciones húmedas 1. Con una pipeta Pasteur colocar una gota de la muestra (agua o de pulque) en el centro del portaobjetos, cubrir la gota con un cubreobjetos. 2. Observar al microscopio con los objetivos de 10x y 40x. Nunca con el objetivo de inmersión. 3. Esquematizar la morfología y movimiento de los microorganismos observados (v. figura 1) Gota pendiente 1. Con un palillo colocar un poco de vaselina alrededor de la concavidad del portaobjetos excavado. 2. Con una pipeta Pasteur tomar una gota de la muestra y colocarla en el centro del cubreobjetos. 3. Invertir el portaobjetos excavado y colocar la excavación sobre el cubreobjetos que tiene la muestra, procurando que ésta quede en el centro de la concavidad. 4. Oprimir suavemente la zona engrasada a fin de sellar y disminuir la evaporación. 5. Invertir la preparación y observar al microscopio con los objetivos de 10x y 40x. 6. Esquematizar la morfología y movimiento de los microorganismos observados (v. figura 1) Preparaciones fijas 1. Etiquetar los portaobjetos en uno de sus extremos. 2. Si la muestra del cultivo es sólida, colocar una pequeña gota de agua (con asa) en el centro del portaobjetos. 3. Esterilizar el asa de siembra y en condiciones asépticas tomar una pequeña cantidad del cultivo. 4. Mezclar suavemente el cultivo y el agua, con el asa, hasta obtener una suspensión homogénea y extenderla en el centro del portaobjetos. 5. Esterilizar el asa. 6. Si la muestra se toma de un cultivo líquido, no es necesario poner la gota de agua, solo extender directamente sobre el portaobjetos. 7. Dejar secar totalmente la preparación a temperatura ambiente. 8. Fijar el frote con calor, para ello cuando el frote está perfectamente seco pasar el portaobjetos por la flama del mechero de cuatro a cinco veces y dejar enfriar (v. figura 1). (7)

8 2.2.4 Tinción simple 1. Cubrir el frote fijo con 3 gotas del colorante básico (azul de metileno, safranina o cristal violeta) y dejar actuar durante 1 minuto. 2. Sobre una charola escurrir el colorante y lavar la preparación con el mínimo de agua, para ello inclinar el portaobjetos y en la parte superior aplicar el agua con una piseta de manera que resbale sobre el frote. 3. Colocar el portaobjetos inclinado sobre una toalla de papel absorbente y dejar secar a temperatura ambiente. 4. Observar al microscopio con los objetivos de 10x, 40x y 100x. 5. Esquematizar sus observaciones y describir las características de los microorganismos observados empleando los términos adecuados respecto a la morfología, agrupación y estructuras; ejemplos: a) bacilos largos con extremos redondos en cadena, b) estreptococos c) bacilos cortos sin agrupación (v. figura 1). Figura 1. Formato para reportar las características microscópicas de bacterias. Fecha: Muestra: (nombre del microorganismo). Tinción: de Gram Aumento: Descripción: Anotar 1 Forma: bacilo, coco, cocobacilo, espirilo. 2 Agrupación: pares, cadena, racimo, ninguno, otro NOTA: El círculo representa el campo microscópico, así que los microorganismos que representes deben guardar proporción con respecto al mismo. En tu reporte debes dibujar el esquema o insertar la foto del microorganismo observado señalando las estructuras o morfologías observadas. Precauciones generales Procura preparar un frote delgado y sin extender demasiado sobre el portaobjetos. Cuando se fija la preparación al mechero, cuida que el portaobjetos no se caliente demasiado. Respeta el tiempo de aplicación del colorante. Busca un buen campo microscópico (células separadas, bien teñidas, en el que se defina bien la morfología y agrupación, que carezca de manchas del colorante) para realizar descripciones confiables de tus microorganismos. Para la observación de preparaciones húmedas baja la intensidad de luz y contrasta la imagen con ayuda del diafragma iris del microscopio. Disposición de desechos 1. Después de efectuar las observaciones, los portaobjetos se sumergen durante 10 minutos en una solución sanitizante de hipoclorito de sodio al 10% a partir de una solución comercial, después se lavan con detergente líquido, se enjuagan y se sumergen en alcohol al 95% durante 24 horas. 2. En caso de que las preparaciones se rompan, envolverlas en papel, esterilizarlas en autoclave y desecharlas en el contenedor exclusivo para material roto de vidrio. 3. Los portaobjetos rotos o dañados que se encuentren limpios se colocan directamente en el mismo contenedor. 4. Esterilizar en autoclave los cultivos bacterianos y muestras empleadas y desecharlas. (8)

9 5. Los desechos de colorantes se colocan en los contenedores dispuestos para este fin en cada laboratorio. Posteriormente se someten a adsorción con carbón activado y el agua libre de colorante es desechada. Discusión de resultados Qué diferencias en la técnica y resultados encuentras en las observaciones al microscopio al realizar preparaciones húmedas y fijas? Tinciones diferenciales Objetivos a. Tinción de Gram b. Tinción de Ziehl Neelsen Al finalizar esta práctica el alumno será capaz de: Diferenciar bacterias con diferente composición y estructura en su pared celular. Introducción La reacción a la tinción de Gram y de Ziehl-Neelsen se basa en la composición y estructura de la pared celular, que determina que unas bacterias retengan el primer colorante, en tanto que otras lo pierdan, lo que les permite reaccionar con el colorante de contraste. Materiales Cultivos puros de las siguientes bacterias: Cepas de referencia: Staphylococcus aureus ATCC Escherichia coli ATCC Material por equipo: Microscopio Aceite de inmersión Colorantes para tinción de Gram Frascos gotero con fucsina fenicada, azul de metileno de Löeffler, alcohol ácido Material que deben tener los alumnos: Mecheros Asas Portaobjetos Cubreobjetos Charola para tinción Puente de vidrio para tinciones Pinzas Piseta Paño limpio de algodón Papel seda Frasco con una solución de sanitizante para desechar preparaciones Cajas con crecimiento del lavado de manos o del área aséptica. (9)

10 Metodología Lavar y desengrasar los portaobjetos y cubreobjetos. Para ello emplear jabón líquido y agua; enjuagar varias veces con alcohol al 95%, ponerlos a secar y flamearlos 2 a 3 veces. a) Tinción de Gram 1. Etiquetar tres portaobjetos por uno de sus extremos con los nombres de: Staphylococcus aureus, Escherichia coli y el tercero con muestra del lavado de manos o del área aséptica. 2. Preparar los frotes bacterianos a partir de cultivos líquidos o sólidos. 3. Fijar con calor (mechero). 4. Agregar cristal violeta en cantidad suficiente para cubrir el frote (2 a 3 gotas) y dejar actuar 1 minuto. 5. Lavar con el mínimo de agua para eliminar el exceso de colorante. 6. Agregar lugol en cantidad suficiente para cubrir el frote (2 a 3 gotas) y dejar actuar 1 minuto. 7. Lavar con el mínimo de agua para eliminar el exceso de mordente. 8. Decolorar con alcohol acetona hasta que el efluente salga incoloro. 9. Lavar con agua para eliminar el exceso de disolvente. 10. Agregar safranina en cantidad suficiente hasta cubrir el frotis (2 ó 3 gotas) y dejar actuar 1 minuto. 11. Lavar con agua para eliminar el exceso del colorante de contraste. 12. Dejar secar la preparación a temperatura ambiente. 13. Observar al microscopio con los objetivos de 10x, 40x y 100x. 14. Esquematizar las observaciones realizadas con el objetivo de mayor aumento y describir las características de los microorganismos observados e indicar si son Gram positivos o Gram negativos (cuadro 2). b) Tinción de Ziehl Neelsen 1. Etiquetar los portaobjetos por uno de sus extremos. 2. En el portaobjetos colocar 1 gota del cultivo de Mycobacterium sp. y 1 gota del cultivo de Staphylococcus aureus. 3. Con el asa mezclar las dos suspensiones. 4. Secar al aire y fijar con calor (mechero). 5. Cubrir la preparación con un papel filtro y saturarla con fucsina básica fenicada, calentar la preparación pasando la flama del mechero. Dejar actuar el colorante durante 10 minutos cuidando que no se seque la preparación. 6. Dejar enfriar la preparación. 7. Con unas pinzas largas retirar el papel filtro y colocarlo en un frasco para su posterior desecho 8. Lavar con abundante agua (hasta que el efluente salga incoloro). 9. Decolorar con alcohol ácido el que se agrega gota a gota hasta que el efluente salga incoloro. 10. Lavar la preparación. 11. Cubrir la preparación con 2 a 3 gotas de azul de metileno de Löeffler y dejar actuar 2 minutos. 12. Lavar el exceso de colorante con el mínimo de agua. 13. Secar a temperatura ambiente. 14. Observar al microscopio con el objetivo de 100x. 15. Esquematizar sus observaciones y describir las características de los microorganismos e indicar si son Bacterias Ácido Alcohol Resistentes (BAAR) o bacterias No Ácido Alcohol Resistentes (cuadro 2) (10)

11 Cuadro 2. Características microscópicas de bacterias, de acuerdo a la tinción de Gram y de Ziehl- Neelsen. Microorganismo Forma 1 Agrupación 2 Gram / Ácido Esquema resistencia 3 1 Forma: bacilo, coco, cocobacilo, espirilo, otro 2 Agrupación: pares, cadena, racimo, ninguno, otro 3 Gram: positivo, negativo, no determinado. BAAR: positivo, negativo, no determinado Precauciones generales Primero prepara todos los frotes de tus muestras, apaga el mechero y posteriormente procede a la tinción. No pierdas de vista el objetivo de cada tinción diferencial, cuándo se considera una bacteria Gram positiva, cuándo una Gram negativa, en comparación de una BAAR positiva y de una BAAR negativa. Disposición de desechos 1. Después de efectuar las observaciones, los portaobjetos se sumergen durante 10 minutos en una solución sanitizante de hipoclorito de sodio al 10% a partir de una solución comercial, después se lavan con detergente líquido, se enjuagan y se sumergen en alcohol al 95% durante 24 horas. 2. En caso de que las preparaciones se rompan, envolverlas en papel, esterilizar en autoclave y desecharlas en el contenedor exclusivo para material roto de vidrio. 3. Los portaobjetos rotos o dañados que se encuentren limpios se colocan directamente en el mismo contenedor. 4. Esterilizar en autoclave los cultivos bacterianos y muestras empleadas y desecharlas. 5. Los desechos de colorantes se colocan en los contenedores dispuestos para este fin en cada laboratorio. Posteriormente se someten a adsorción con carbón activado y el agua libre de colorante es desechada. Discusión de resultados 1. Clasificar a las bacterias observadas como grampositivas o gramnegativas y explicar el por qué se incluyen en ese grupo. 2. Comparar los resultados obtenidos con las cepas control con lo reportado en la biliografía. Coinciden el carácter de Gram reportado para el microorganismo? 3. Analizar las posibles causas de error en el procedimiento o los factores que contribuyeron a la correcta tinción de las bacterias en estudio de acuerdo con el fundamento de la técnica. 4. Puede una bacteria Gram positiva teñirse como una Gram negativa? Por qué? (11)

12 Tinciones selectivas: Tinción de endosporas bacterianas Objetivos Al finalizar esta práctica el alumno será capaz de: Identificar y describir las endosporas bacterianas. Introducción Las tinciones selectivas son aquéllas que permiten observar un organelo celular determinado como la endospora bacteriana. Esta estructura de resistencia se caracteriza por presentar una capa externa formada por un complejo de calcio, ácido dipicolínico y peptidoglicano. Debido a esta composición, es muy difícil que los colorantes penetren, por lo que al aplicar una tinción simple, estas aparecen como cuerpos incoloros (dentro o fuera de la célula). No obstante es posible teñirlas mediante la aplicación de métodos drásticos. Cultivos puros de las siguientes bacterias: Cepas de referencia: Bacillus subtilis Bacillus megatherium Bacillus cereus Bacillus sp, Material por equipo Microscopio Aceite de inmersión Vaso de precipitados de 250 ml Charola de metal Tripie o anillo Papel filtro (cuadros 2x2cm) Frascos goteros con: verde de malaquita, safranina al 0.5% (no usar el de Gram), Material que deben tener los alumnos: Mecheros Asas Gradilla Portaobjetos Cubreobjetos Charola para tinción Puente de vidrio para tinción Pinzas de punta roma Piseta Paño limpio de algodón Papel seda Frasco con una solución de sanitizante para desechar preparaciones (12)

13 Metodología Lavar y desengrasar los portaobjetos y cubreobjetos. Para ello emplear jabón líquido y agua; enjuagar varias veces con alcohol al 95%, ponerlos a secar y flamearlos 2 a 3 veces. Tinción de endosporas 1. Etiquetar los portaobjetos por uno de sus extremos. 2. Preparar 2 frotes fijos a partir de cultivos de las diferentes especies de Bacillus. 3. Aplicar una tinción simple a uno de los frotes de cada bacteria (ver ejercicio 2.2.1). 4. Cubrir el segundo frote de cada microorganismo con papel filtro y saturarlo con verde de malaquita. 5. Calentar la preparación sobre un vaso de precipitados con emisión de vapores de agua durante 10 minutos, cuidando que el colorante no hierva y mantener la preparación húmeda. 6. Retirar el papel filtro con unas pinzas y colocarlo en un frasco para su posterior desecho. 7. Lavar con el mínimo de agua. 8. Agregar 3 gotas de una solución de safranina al 0.5% y dejarla reaccionar durante 30 segundos. 9. Lavar, dejar secar a temperatura ambiente y observar con el objetivo de 100x. Precauciones generales Procura no saturar con verde de malaquita la preparación para observar endospora. Disposición de desechos 1. Después de efectuar las observaciones, los portaobjetos se sumergen durante 10 minutos en una solución sanitizante de hipoclorito de sodio al 10% a partir de una solución comercial, después se lavan con detergente líquido, se enjuagan y se sumergen en alcohol al 95% durante 24 horas. 2. En caso de que las preparaciones se rompan, envolverlas en papel, esterilizar en autoclave y desecharlas en el contenedor exclusivo para material roto de vidrio. 3. Los portaobjetos rotos o dañados que se encuentren limpios se colocan directamente en el mismo contenedor. 4. Esterilizar en autoclave los cultivos bacterianos y muestras empleadas y desecharlas. 5. Los desechos de colorantes se colocan en los contenedores dispuestos para este fin en cada laboratorio. Posteriormente se someten a adsorción con carbón activado y el agua libre de colorante es desechada. Discusión de resultados 1. Diferencia en tus preparaciones las endosporas de las esporas libres. 2. Distingue la posición de las endosporas de cada una de las especies del género Bacillus que trabajaste en clase. (13)

14 Tinciones negativas: Tinción de cápsula Objetivos Al finalizar esta práctica el alumno será capaz de: Identificar y describir las cápsulas bacterianas. Introducción La cápsula, esta es una cubierta extracelular constituida por agua y polisacáridos que se acumulan alrededor de la célula. Estos componentes no se combinan con los colorantes, por lo que para la observación de la misma se emplean tinciones negativas con las que se oscurece el fondo y de esta manera se contrastan las cápsulas. Materiales Muestras: Pulque Material por equipo Microscopio Aceite de inmersión Frascos goteros con: tinta china (1:1), cristal violeta al 1.0% o solución alcohólica de fucsina básica. Material que deben tener los alumnos: Mecheros Asas Gradilla Portaobjetos Cubreobjetos Charola para tinción Puente de vidrio para tinción Pinzas de punta roma Piseta Paño limpio de algodón Papel seda Frasco con una solución de sanitizante para desechar preparaciones Metodología Lavar y desengrasar los portaobjetos y cubreobjetos. Para ello emplear jabón líquido y agua; enjuagar varias veces con alcohol al 95%, ponerlos a secar y flamearlos 2 a 3 veces. 1. En el extremo del portaobjetos, colocar una gota de agua y una de tinta china y mezclar. 2. Colocar una gota de pulque en la mezcla anterior. 3. Colocar el borde de otro portaobjetos sobre la gota y deslizar éste sobre el porta que contiene la muestra formando una película delgada. 4. Dejar secar al aire (NO FIJAR). 5. Cubrir el frote con cristal violeta o fucsina fenicada, dejar actuar durante un minuto. (14)

15 6. Lavar, dejar secar a temperatura ambiente y observar la preparación con el objetivo de inmersión. Precauciones generales Las preparaciones hechas para observar cápsula no deben fijarse con calor. Disposición de desechos 1. Después de efectuar las observaciones, los portaobjetos se sumergen durante 10 minutos en una solución sanitizante de hipoclorito de sodio al 10% a partir de una solución comercial, después se lavan con detergente líquido, se enjuagan y se sumergen en alcohol al 95% durante 24 horas. 2. En caso de que las preparaciones se rompan, envolverlas en papel, esterilizar en autoclave y desecharlas en el contenedor exclusivo para material roto de vidrio. 3. Los portaobjetos rotos o dañados que se encuentren limpios se colocan directamente en el mismo contenedor. 4. Esterilizar en autoclave los cultivos bacterianos y muestras empleadas y desecharlas. 5. Los desechos de colorantes se colocan en los contenedores dispuestos para este fin en cada laboratorio. Posteriormente se someten a adsorción con carbón activado y el agua libre de colorante es desechada. Discusión de resultados 1. Fue fácil reconocer las cápsulas bacterianas? Por qué? 2. Qué estrategia sugieres para reconocer y localizar más eficazmente las cápsulas bacterianas? Discusión GENERAL de resultados Discute sobre la información que te proporciona cada una de las tinciones realizadas en sesiones anteriores. En todos los casos obtuviste resultados similares a los reportados en la literatura? De no ser así cuáles fueron las posibles causas de error? Literatura de consulta Balows, A Manual of Clinical Microbiolgy. 5ª edición. A. Society for Microbiology, Washington, USA. Collins C.H. y Lyne Patricia M Métodos Microbiológicos. ACRIBIA. 524 pp Díaz, R., G. Gamazo e I. López Goñi Manual Práctico de Microbiología. 1ª edición. MASSON, S. A. España Holt, John G Bergey s manual of determinative bacteriology. 8ava edición. Leboffe, M. J., y B. E. Pierce Microbiology Laboratory and application. 2a edición. Morton Publishing Co., USA. Madigan, M. T., J. M. Martinko y J. Parker Brock. Biología de los microorganismos. 10ª Ed. Prentice Hall Iberia. España. Ramírez-Gama, R. M., B. Luna Millán, O. Velásquez Madrazo, L. Vierna García, A. Mejía Chávez, G. Tsuzuki Reyes, L. Hernández Gómez, I. Müggenburg, A. Camacho Cruz y M del C. Urzúa Hernández Manual de Prácticas de Microbiología General. 5ª edición. Facultad de Química, UNAM. México. Tortora Gerard J., Fonke Beidell R. y Case Christine L Microbiology an Introduction. 5a. ed. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 801 pp. (15)