Laboratorio 4: Tinción de microorganismos. Biol 3725L

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1 Laboratorio 4: Tinción de microorganismos Biol 3725L

2 1 ml 1 ml Repaso de diluciones 0.1 ml 1 ml 1 ml 9 ml 1 / ml 9.9ml 9 ml 1 / ml 0.1/ 10 1/ / ml 9 ml 1/ ml 0.1 ml Cuántas colonias viables tengo? 1. Escojo el plato que tenga entre UFC. 2. Utilizo la fórmula de: UFC * (1/factor de dilución) TMTC UFC UFC UFC

3 Reportar datos: 1. Placas con estriado: obtuvo o no colonias discretas 2. Dilución en serie: reporte UFC/mL para las tres placas utilizadas en su sub-grupo (incluya los cálculos)

4 Objetivos Conocer el mecanismo básico y ventajas de una tinción. Aprender conceptos básicos relacionados a: Proceso de preparación de un frotis Tinción Gram Tinción Ácido-Resistente Tinción de Esporas Tinción de Cápsula (negativa). Identificar características en las bacterias en estudio en base a las diferentes tinciones.

5 Tinciones de microorganismos Tinción Gram (práctica) Tinción de Cápsulas - Tinción Negativa (práctica) Tinción de Esporas (práctica) Tinción Ácido-Resistente (teoría) Tinción de flagelos (teoría)

6 Morfología y agrupación de bacterias Ya se han discutido métodos de clasificación por morfología y medios de cultivo. Ahora utilizaremos tinciones con el fin de poder seguir caracterizando a las bacterias. Espiroquetas Coco Bacilo

7 Morfología y agrupación de bacterias: Tinción La tinción es una de las técnicas más utilizadas en los laboratorios de microbiología para clasificar microorganismos. El tinte es un compuesto orgánico que le da contrastea la célula. cromógeno(solvente orgánico que le provee las propiedades de color) auxócromo(grupo químico que se ioniza con el cromógeno y forma sales que se pegan a las fibras y tejidos). La adhesión del tinte va a depender de la carga que posea.

8 Tinción

9 Tiposde Tinciones Simple Tamaño, arreglo y forma Un solo tinte Directa Tiñe bacteria Negativa tiñe el fondo pero no a la bacteria Diferencial Separar y clasificar los microorganismos observados de acuerdo a sus características Más de un tinte Ejemplos: Tinción Gram y Ácido resistente Específica Para identificar estructuras: Ejemplos: Tinción de flagelos, cápsulas y esporas.

10 Tinción simple: un solo tinte, afinidad por carga con componentes de la superficie de la célula Ejemplo : azul de metileno (+) methylene blue (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

11 Tinción diferencial: permite detectar tipos distintos de células Azul-Violeta Rojo Pasos de la Tinción Gram Cristal violeta (1 minuto) Lavar con agua Yodo (1 minuto) Lavar con agua Alcohol etílico al 95% (20 segundos) Lavar con agua Safranina (1 minuto) Lavar con agua Secar con bibolous paper Gram+= azul-violeta, Gram = rojo (Streptococcus sp.) (Escherichia coli) Desventajas de técnicas de tinción: requieren fijar la muestra con calor: (células mueren) calor + químicos pueden distorsionar la forma original de las células

12 Tinción Gram Tinte primario-cristal Violeta(CV), tiñe la bacteria color violeta. Agente mordante-yodo, forma un complejo insoluble con CV. Ayuda a adherir el tinte a la célula. Ayuda a resistir la decoloración. Agente decolorizante-alcohol etílicoal 95%, sirve como solvente de lípidos y agente deshidratante de proteínas. Remueve el cristal violeta. Contratinte- Safranina, tiñe de rojo la bacteria.

13 Resultados -Tinción Gram Gram Negativo Gram Positivo

14 Su pared celular contiene una capa gruesa de peptidoglicano Gram + Reacción se basa en la diferencia en la composición química de la pared bacteriana. Gram - Su pared celular contiene una capa fina de peptidoglicano

15 Pared celular procariota Peptidoglicano: polímero de dos azúcares modificadas (N-acetil glucosamina y N-acetil ácido murámico ) y tetrapéptidos enlace β, 1-4 G M G M G M G M 3 4 M G M G M G M G M G = N-acetil glucosamina M = N-acetil ácido murámico (mureína) tetrapéptido (4 amino ácidos)

16 Pared celular procariota G M G M G M G M M G M G M G M G M G M G M G M G M G M G M G M G M M G M G M G M G M M G M G M G M G M G M G M G M G M M G M G M G M G M

17 Tinción Gram Fundamento Membrana externa de las Gram es soluble en solventes orgánicos como el alcohol la capa de peptidoglicano es demasiado delgada como para retener el complejo cristal violeta/yodo que se formó por lo que va perdiéndose el color azul-violeta. Las Gram + no tienen su capa susceptible a la acción de solventes orgánicos se deshidratan los poros y se cierran reteniéndose el complejo cristal violeta/yodo y por consiguiente el color azul-violeta.

18 Preparación de la muestra para proceso de Tinción Preparación de frotis: Limpiar la laminilla con papel de lentes. Prepara el frotis Medio líquido-solo se coloca una porción del cultivo con el loop en la laminilla. Medio sólido- se coloca una gotita de agua destilada en la laminilla y se diluye la porción de cultivo en ella. Se esparce bien. Secar a temperatura ambiente Fijación por calor

19

20 Tinción Gram Laminilla Control positivo Gram + (Bacillus cereus) Desconocido Control negativo Gram (E. coli) 1. Cubrir frotis con tinte cristal violeta (1 minuto). 2. Enjuague con agua destilada para remover el exceso de tinte. 3. Cubrir frotis con yodo (1 minuto). 4. Enjuague con agua destilada. 5. Enjuague la laminilla con alcohol etílico 95% (no exceder los 30 seg). 6. Enjuague la laminilla con agua destilada. 7. Cubrir frotis con tinte safranina (1 minuto). 8. Enjuague con agua destilada para remover el exceso de tinte. 9. Secar laminillas con papel bibulous para remover el exceso de agua.

21

22 Secuencia de reacciones

23 Tinción de Cápsulas Cápsula-estructura gelatinosa secretada por algunas bacterias capas de polisacáridos o proteínas que revisten el exterior de un bacteria Función: adherencia y formación de biopelículas(capas de crecimiento bacteriano) y protección contra fagocitosis (macrófagos, sistema inmunológico) La cápsula se compone de polisacáridos, glicoproteínas y polipéptidos. La mayoría de las cápsulas están compuestas de polisacáridos, por lo que son solubles en agua.

24 Tinción de Cápsulas cápsula

25 Tinción de Cápsulas Tinte primario- Cristal Violeta 1%- tiñe todo el frotis color oscuro Decolorante y Contratinte-Sulfato de Cobre 20%-se usa para enjuagar el tinte primario No se enjuaga con agua porque la cápsula es soluble en agua - función de decolorante El CuSO 4 es absorbido en el material de la cápsula que ha sido decolorada - función de contratinte. La cápsula aparece azul clara en un fondo oscuro.

26 Tinción de Cápsulas Preparación de un frotis cargado ( heavy ). Dejar secar a temperatura ambiente. Cristal violeta 1%(5-7 minutos). Enjuagar con CuSO 4 Secar con bibulous paper Cryptococccus laurentii

27 Tinción de Cápsulas Tinción simple-negativa La tinción se logra mediante una mezcla del tinte y el cultivo de bacteria. El tinte utilizado es India Ink (Se puede utilizar también eosina o nigrosina). Se le conoce como efecto de cielo estrellado.

28 Efecto de Cielo estrellado

29 Tinción de Cápsulas Tinción simple-negativa

30 Célula vegetativa- forma metabólicamente activa = bacterias. Esporas-forma metabólicamente inactiva y altamente resistente. Los miembros del género anaerobio Clostridium y del género aerobiobacilluspueden existir metabólicamente activos o inactivos.

31 Formación de esporascomo método de sobrevivencia En condiciones ambientales hostiles ocurre esporogénesis la cual forma la endospora. En condiciones ambientales favorables, ocurre germinación, lo cual forma la célula vegetativa (bacteria).

32 Formación de esporas como método de sobrevivencia

33 Endosporas La esporogénesis y la germinación no son medios de reproducción, son mecanismos de supervivencia de la célula. La composición química de la bacteria la hace resistente a: Calor extremo o excesivo Congelación Radiación Desecación Agentes químicos

34 Tinción de Esporas Tinte primario-verde Malaquita, requiere calor para la penetración de este tinte. Agente decolorante-agua, remueve el exceso de tinte, decolora la célula vegetativa. Contratinte- Safranina, tiñe las células vegetativas. Note: De obtener una coloración roja al final del proceso de tinción observando bajo el microscopio, solo se puede determinar que se tienen células vegetativas. No se puede concluir que es Gram -, eso sería otro procedimiento a realizar si se quisiera determinar si es Gram + o -.

35 Parrilla de metal Tinción de Esporas Laminilla con frotis Beaker Agua 1. Cubrir frotis con tinte verde malaquita y permita que el colorante humee, pero no hierva. 2. Espere 5 minutos. Si durante los 5 minutos el tinte se seca añada más tinte. 3. Enjuague la laminilla con agua destilada. Hot Plate 4. Coloque tinte safranina (30 seg). 5. Seque la laminilla en papel bibulous. 6. Observe y dibuje la coloración, morfología y arreglo de las bacterias bajo el microscopio.

36 Resultado Espora (color verde) Célula vegetativa (color rojo) Bacillus cereus

37 Tinción Ácido-Resistente Las familias Mycobacteriae y Nocardiaceaeson ácido resistente. Los microorganismos ácido- Los microorganismos ácidoresistentesse caracterizan por tener una pared celular gruesa de cera (lipoidal) que contiene ácido micólico.

38 Tinción Ácido-Resistente Tinte primario-carbolfucsina-tinte rojo fenólico (5%). Puede penetrar la pared celular de las micobacterias. Agente decolorizante-alcohol ácido (3% HCl +95% alcohol etílico). Contratinte-Azul de metileno-se utiliza para teñir de azul las bacterias que quedaron incoloras. Los organismos que son decolorados por el alcohol ácido no son ácido resistente. Azules: no son ácido resistentes (no tienen ácido micólico en la pared)

39 Tinción Ácido-Resistente Mycobacterium tuberculosis Observar laminillas!!!

40 Tinción de flagelos Tipo de tinción en la que se pueden visualizar el (los) flagelo(s). Utiliza 2 tintes: Ácido tánico (agente mordante: engruesa los flagelos) Rosalina (colorante que los define) Mobiluncus spp.

41 Resumen resultados de tinciones Tinción Gram (estructura de pared celular) Tinción de esporas Tinción de cápsula

42 Recapitulación Cuál es la diferencia entre una tinción simple y una diferencial? Qué tipo de tinción es la Gram? Cuál es el fundamento? Reactivos utilizados en la tinción Gram Qué otro tipo de tinciones puede mencionar? Cuales son algunas limitaciones de las tinciones?

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