INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

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1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA ACADEMIAA DE MICROBIOLOGÍA MANUAL DE PRÁCTICAS PARA LA ASIGNATURA: LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS PRIMERA EDICIÓN AUTORAS: Q.B.P. MIRIAM JUÁREZ JUÁREZ Q.B.P. REFUGIA PÉREZ SÁNCHEZ BIOL. L. PATRICIA RODRÍGUEZ PASCUAL EDITORAS: Q.B.P. MIRIAM JUÁREZ JUÁREZ M. EN C. GLORIA LÓPEZ JIMÉNEZ

2 Manual para el Laboratorio de técnicas microbiológicas. UPIBI-IPN INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA ACADEMIA DE MICROBIOLOGÍA MANUAL DE PRÁCTICAS PARA LA ASIGNATURA: LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS PRIMERA EDICIÓN AUTORAS: Q.B.P. MIRIAM JUÁREZ JUÁREZ Q.B.P. REFUGIA PÉREZ SÁNCHEZ BIOL. L. PATRICIA RODRÍGUEZ PASCUAL EDITORAS: Q.B.P. MIRIAM JUÁREZ JUÁREZ M. EN C. GLORIA LÓPEZ JIMÉNEZ 1

3 Manual para el Laboratorio de técnicas microbiológicas. UPIBI-IPN PRÁCTICA No. 1: MICROSCOPÍA UNIDAD I: Normatividad en el laboratorio y microscopía 1. OBJETIVOS: 1.1 Objetivo general El alumno aprenderá a enfocar correctamente una preparación para ser observada en el microscopio compuesto, así como la forma correcta de utilizarlo 1.2 Objetivos específicos Utilizar correctamente el microscopio compuesto Realizar la técnica de iluminación de Köhler Observar preparaciones temporales en el microscopio compuesto 2.- INTRODUCCIÓN El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño. Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un objeto microscópico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño original. Los diversos elementos que existen en la naturaleza, presentan tamaños, formas y composiciones distintas, la mayoría de ellas pueden verse, algunas a simple vista, y otras mediante instrumentos. Para poder observar a la célula es necesario recurrir a equipos como el microscopio, de este existen diversas variedades, los cuales están diseñados a lo que pretendemos observar y como ejemplo tenemos a: Microscopio óptico Es un instrumento (de un lente o varios lentes), que amplifica una imagen y permite la observación de mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio más simple es una lente de aumento o un par de anteojos. El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mínimo a esa distancia. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la información. La resolución depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor de la muestra, la calidad de la fijación y la intensidad de la coloración. Teóricamente la máxima resolución que se puede alcanzar es de 0,2 µm dada por una luz con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no puede aumentar la resolución. Existen distintos microscopios ópticos generales y de investigación que se diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminación, la alteración física de la luz que incide en la muestra y procesos analíticos que se aplican a la imagen final. El microscopio compuesto esta formado por tres sistemas: 1. Sistema de iluminación; 2. Sistema óptico y 3. Sistema mecánico. El sistema de iluminación corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos para iluminar eficazmente la preparación y esta formado principalmente por la lámpara (6V), el diafragma de campo y el condensador (lente frontal, diafragma de iris y lente auxiliar) El sistema óptico esta formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que permiten agrandar la imagen y esta formado por los objetivos, tubo y el ocular. 2

4 Manual para el Laboratorio de técnicas microbiológicas. UPIBI-IPN El sistema mecánico esta formado por una serie de engranes y botones que permiten realizar el movimiento y cambio de las lentes así como el enfoque de la preparación y esta formado por la base, estativo, tornillos macrométrico y micrométrico, platina, revólver y portarevólver. Función básica de cada parte del microscopio: a.- Sistema mecánico Base. Pieza metálica que sostiene a todo el aparato Estativo. Lugar de donde se debe tomar para trasladar al microscopio Platina. Es una plancha cuadrada y gruesa de metal con un orificio central en donde descansa la preparación, la cual es fijada por dos pequeñas pinzas, se puede mover hacia arriba y hacia abajo con los tornillos macrométrico y micrométrico por medio de un sistema de engranes. Posee escalas numéricas que permiten ubicar fácilmente la posición de lo que se observa y, al mismo tiempo, deslizar la preparación en forma de cruz (ejes X y Y) para su localización. Pinzas. Sirve para sujetar al portaobjetos. Tornillo macrométrico. Permite el enfoque mayor. Tornillo micrométrico. Permite el enfoque con precisión. Tubo del ocular. Sostiene el lente del ocular. Revolver: Es un dispositivo giratorio en donde se atornillan las lentes de los objetivos de distinto aumento. Tubo binocular. Cada uno de los tubos contiene en el interior un sistema de prismas y espejos que dividen el haz de luz en dos haces, cada uno de los cuales se envía por separado a cada tubo, estos tubos se deslizan hacia los lados para ajustar la distancia interpupilar ya que cada persona posee una diferente separación entre sus ojos. Los microscopios binoculares tienen entre los tubos una escala grabada para poder ajustar la distancia y cada persona debe memorizar su valor de apertura interpupilar; uno de los tubos tiene el ocular fijo y el otro tiene un sistema mecánico que sube o baja. Para realizar el enfoque de cada ojo primero se enfoca con el tornillo micrométrico el tubo que tiene el ocular fijo y después se enfoca el que tiene el ocular móvil, pero en este caso sin mover el tornillo micrométrico, girando el ocular móvil hasta encontrar el foco. b.- Sistema de iluminación Lámpara. Es la encargada de proporcionar los haces de luz y tiene las siguientes características: 6V, 5-15 W ó 12 V, W Diafragma de campo. Esta situada en la base del microscopio y su función es la de regular el diámetro de la emisión de la luz a fin de que se ilumine solo el área de campo visual, es decir controla la cantidad de luz que atraviesa la preparación. Condensador. Es un sistema de tres lentes convergentes que concentran los rayos luminosos sobre el objeto a observar, el condensador utilizado es capaz de agrupar todos los rayos que provienen del foco y permite aprovechar toda la luz posible que inciden sobre él y los dirige hacia el plano focal del objeto. c. Sistema óptico Oculares 3

5 Manual para el Laboratorio de técnicas microbiológicas. UPIBI-IPN El ocular es la parte óptica final externa, situados en el tubo a través de los cuales se obtiene la imagen final, el ocular tiene aumento propio (los aumentos son denominados con la letra X), en nuestro caso es de 10X. El ocular consta de una lente cercana al ojo, collar, tubo del ocular y una lente cercana al objetivo. Tubo El tubo es la parte óptica mecánica, situada en la parte superior del microscopio, este puede ser monocular o binocular, además esta adaptada para poderle colocar una cámara fotográfica ó una cámara de televisión. El tubo generalmente esta diseñado para trabajar a una distancia mecánica fija entre ellos y este valor puede ser de 160 mm, el factor del tubo del microscopio a utilizar en el laboratorio es de 1,25X, dato que nos sirve para calcular el aumento total. Objetivos Son lentes que captan la imagen a observar, están construidos de cristal o fluorita, poseen aumento propio, apertura numérica y esta diseñada para trabajar con diferentes campos. Todos los objetivos tienen anillos de colores y números grabados sobre el tubo metálico, que nos permite saber a detalle cuales son sus ventajas, la disposición de estos caracteres es la siguiente: 1.- El anillo de color superior indica los aumentos (Tabla 1) 2.- El lado superior izquierdo indica el número de aumentos 3.- El lado superior derecho la apertura numérica. 4.- El lado inferior la distancia mecánica 5.- El lado inferior derecho el espesor del cubreobjetos 6.- El anillo de color inferior indica en qué medio se hace la inmersión del objetivo (Tabla 2) En ocasiones el objetivo puede traer en lugar de 0.17, el número 1, el cual indica que: Acepta cubreobjetos desde 0,17 a 0,22 mm de espesor, 10= No requiere cubreobjetos ó 0,11 0,27 = Es ajustable a diferentes espesores de los cubreobjetos, desde 0,11 mm hasta 0,27 mm. Anillo superior Los anillos de color cerca del anillo moleteado facilitan el reconocimiento del coeficiente de aumento: Tabla 1. Correspondencia entre los aumentos y los anillos de colores grabados Aumentos Color anillo superior 1.0X Negro 2.5 X Pardo 4.0 X Rojo 6.3 X Anaranjado 10 X Amarillo 16 X Verde claro 25 X Verde oscuro 40 X Azul claro 63 X Azul oscuro 100X Blanco 4

6 Manual para el Laboratorio de técnicas microbiológicas. UPIBI-IPN Tabla 2. Colores para el anillo inferior que indican en qué medio se debe hacer la inmersión del objetivo Carácter Sustancia Índice de refracción Color del anillo Oil Aceite 1,515 Negro W Agua 1,333 Blanco Glyz Glicerina 1,455 Anaranjado Metileno Yoduro de metileno 1,740 Amarillo Aumentos totales: El número total de aumentos que se puede lograr en un microscopio se obtiene multiplicando el número de aumentos que tiene el ocular por el número de aumentos que tiene el tubo y por el número de aumentos que tiene el objetivo con el que se esta observando. Distancia mecánica: Se llama distancia mecánica a la distancia que recorre a luz por el interior del microscopio desde que penetra por el objetivo, pasando por los tubos y espejos, hasta llegar al ocular, la distancia mecánica se mide desde la superficie de la rosca del objetivo hasta la base del ocular, esta distancia en el caso de nuestro microscopio es de 160 mm. Poder de resolución: El poder de resolución de una lente se define como la capacidad que tiene para discernir entre dos puntos muy cercanos entre sí y que puedan verse separada. El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm, el microscopio óptico de 0,2 µ y el microscopio electrónico de 6 Ángstrom. Apertura numérica: Es una medida de la amplitud del cono luminoso que se forma por las lentes del microscopio, ya sea del condensador o del objetivo. Microscopio de contraste de fase Permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas. Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados. La resolución de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuro porque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partículas individuales más pequeñas en las imágenes de campo oscuro, debido al contraste creado. Es útil para observar autorradiografías, cristales en la orina y para detectar espiroquetas en particular el Treponema pallidum microorganismo causante de la sífilis. Cada uno de los microscopios tiene una función determinada, en este y en este caso este tipo de microscopio utiliza un microscopio auxiliar y un filtro verde, además en este tipo de microscopio también se realiza la técnica de iluminación de Köhler. 5

7 Manual para el Laboratorio de técnicas microbiológicas. UPIBI-IPN Fig. Diafragma de iris de un microscopio de contraste de fases, microscopio auxiliar y filtro verde 3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO 3.1 MATERIAL POR EQUIPO Microscopio compuesto Preparaciones fijas de bacterias Preparaciones en fresco de mohos Preparaciones en fresco de agua estancada Frasco con benzal Esponja Papel seda Lámpara de alcohol 3.2 REACTIVOS Aceite de inmersión Atomizador con benzal 3.3 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO Una muestra de agua estancada Comida con mohos Colores 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL 4.1 Cuidado y limpieza del microscopio Un proceso de limpieza debe considerar los siguientes aspectos: a.- Para limpiar la parte óptica, se elimina primero las partículas de polvo, ya sea con un bulbo inyector de aire, un pincel o soplando fuertemente sobre la lente. b.- Algunos solventes como la acetona disuelven los revestimientos de barniz, la pintura y aún el cemento de las molduras y los objetivos compuestos, por lo que no se deben usar. c.- Las guías mecánicas deben mantenerse lubricadas. Se enlistan algunos compuestos recomendados sólo para ciertas partes del microscopio. a.- Espuma de jabón suave.- Solo para remover lo sucio de la superficie de instrumentos b.- Agua destilada con algún detergente sin aditivos alcalinos.- para un prelimpiado de la óptica. c.- Solución para limpiar la óptica.- etanol al 40 %, éter al 20 %, para limpiar superficies de la óptica o remover residuos de aceite de inmersión. 4.2 TÉCNICA DE ILUMINACIÓN MÉTODO KÖHLER A fin de evitar toda serie de inconvenientes y poder utilizar lámparas de filamento espirilado, Köhler propone un método que actualmente es utilizado. Su iluminación comporta dos diafragmas: un diafragma denominado de campo, situado generalmente a nivel de la lámpara colectora y un diafragma llamado de abertura, situado generalmente debajo del condensador. Pasos a seguir para la iluminación de Köhler en un microscopio 1.- Luz amarilla (bajo voltaje) 6

8 Manual para el Laboratorio de técnicas microbiológicas. UPIBI-IPN 2.- Ajustar la distancia interpupilar 3.- Ajustar las dioptrías 4.- Abrir el diafragma de campo e iris 4.3 Observación de una preparación temporal a.- Tomar un portaobjetos limpio y desengrasado con una torunda que contenga alcohol b.- Colocar una gota pequeña del agua estancada con una pipeta Pasteur d.- Cubrir la preparación con el cubreobjetos e.- Observar al microscopio de contraste de fases a 10 y 40 X f.- Observar la preparación temporal realizada en el microscopio compuesto y comparar los resultados obtenidos g.- Realizar esquemas de las preparaciones observadas. 4.4 Observaciones de preparaciones fijas a.- Tomar una preparación fija y enfocarla a 10 y 40 X. b.- Adicionarle aceite de inmersión y observarlo a 100 X c.- Observar la preparación que contiene una gran cantidad de muestra y realizar el esquema biológico d.- Ahora mover la preparación para enfocar la preparación con poca cantidad de muestra. e.- Comparar ambas muestra y concluir 7

9 Manual para el Laboratorio de técnicas microbiológicas. UPIBI-IPN 5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO Imagen a color de la preparación en fresco de agua estancada con el microscopio óptico a 10X y 40X Imagen a color de la preparación fija a 40X y 100X, Nombre del microorganismo, Forma y agrupación 5.3 Consulta la bibliografía y llena la siguiente tabla: Tipo de microscopio Poder de resolución Aplicaciones Compuesto Contraste de fase Electrónico Estereoscópico Fluorescencia Interferencia Polarización 5.4 En la siguiente tabla resume la función de cada una de las siguientes partes: Parte del microscopio Función Sistema al que pertenece: (mecánico, óptico, iluminación) Condensador Diafragma de campo Diafragma de iris Filtro azul Lámpara Objetivo Ocular Platina Revólver Tornillo macrométrico Tornillo micrométrico 6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 6.1 Ventajas y desventajas de utilizar la iluminación de Köhler. 6.2 Ventajas y desventajas de un microscopio compuesto, con respecto a su uso, Tipo de preparación y cantidad de muestra utilizada 6.3 Tamaño de las imágenes observadas en cada aumento 7.- CONCLUSIONES Elabora tus conclusiones tomando en consideración los objetivos de la práctica, los resultados obtenidos y la bibliografía consultada. 8.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 8.1 Barrera Escorcia Héctor El Microscopio Óptico 1ª edición Editores Plaza y Valdez, S.A. de C.V Freifelder, D. Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular. Reverté Mexicana, S.A. de C.V Locquin Marcel, Manual de Microscopía I 1 edición, Ed. Labor S.A. 8.4 Rincón-Sánchez A.R.y Reyes Ortiz N. Manual de Microscopía Óptica 1ª edición Editado por la Asociación de Químicos del Instituto Nacional de Nutrición, Secretaría de Salud., México.. 8

10 UNIDAD I: Normatividad en el laboratorio y microscopía. TEMA: 1.3 Preparación de un frotis microbiano Preparaciones fijas Preparaciones en fresco PRACTICA No. 2 PREPARACIONES FIJAS Y EN FRESCO LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS. UPIBI-IPN 1. OBJETIVOS 1.1 Objetivo general El alumno realizará preparaciones en fresco y fijas para ser observadas en el microscopio óptico por medio de tinciones. I.2 Objetivo específicos Realizar preparaciones en fresco y fijas de bacterias y mohos Realizar tinciones simples, diferenciales y específicas Realizar esquemas coloridos de las observaciones a 40X y 100X 2. INTRODUCCIÓN La gran mayoría de los microorganismos son invisibles para el ojo humano, por lo que el uso del microscopio resulta indispensable para observar a estos seres vivos. Para lograr una buena observación microscópica es necesario tomar en cuenta la preparación de la muestra, debido a que los objetos deben tener un cierto grado de contraste con el medio circundante para poder ser percibidos a través del microscopio, además de que los microorganismos carecen de una coloración natural, hay que teñirlos previamente para hacerlos resaltar de manera artificial del fondo de la imagen. Una forma de conseguir este contraste consiste en realizar tinciones simples con un colorante o tinción diferencial. Tinción simple: En las tinciones simples se utiliza un solo colorante, que siempre es de tipo básico, se utiliza solamente para incrementar el contraste de la célula que absorberá el colorante y quedará teñido del mismo color. Tinción diferencial: Se utilizan una combinación de colorantes para dar diversos complejos coloridos y como ejemplo tenemos la tinción de Gram y la tinción de Ziehl-Neelsen. Tinciones específicas: Incrementan el contraste en las células microbianas y revelan estructuras particulares, entre las que se incluyen las endosporas, los flagelos y la cápsula. Estas técnicas se basan en la estructura que se desea poner de manifiesto tiene un grado de afinidad por los colores utilizados mayor que el resto de la célula. Las bacterias no teñidas muestran pocos detalles morfológicos, el diagnóstico bacteriológico generalmente se basa en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias para identificarlos más adecuadamente, Sin embargo, también resultan útiles las preparaciones no teñidas en la determinación de la movilidad. Las preparaciones fijas y teñidas son de uso casi universal, tanto a partir de especimenes recibidos como de colonias cultivadas. En general una muestra del espécimen original puede ser colocada directamente sobre el portaobjetos o bien ser recogida con una asa, recordando siempre tener una preparación delgada y homogénea. Una colonia puede ser examinada haciendo con ella una suspensión tenue en una gota de solución salina, y luego extendiéndola con una asa sobre un portaobjetos. Las películas secadas al aire son fijadas con calor suave sobre la flama de un mechero y luego pasadas a través de ella. Debe tenerse cuidado para evitar el calor excesivo, que puede alterar la forma bacteriana. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos sea apenas caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano. Aunque cuando tenemos la necesidad de observar preparaciones en fresco podemos utilizar el microscopio de contraste de fases, en donde la característica más importante de este tipo de microscopio es que nos permite ver a los microorganismos sin la necesidad de teñirlos. 9

11 3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO 3.1 EQUIPO Microscopio óptico 3.2 MATERIAL Portaobjetos Cubreobjetos Pipeta pasteur Gradilla 1 tubo de ensaye de 13 X 100 mm Asa bacteriológica Frasco gotero con solución de cristal violeta Frasco gotero con solución de lugol Frasco gotero con solución de alcohol acetona Frasco gotero con solución de safranina Frasco gotero con solución de fucsina fenicada Frasco gotero con solución de alcohol ácido Frasco gotero con solución de azul de metileno Frasco gotero con solución de verde de malaquita Solución salina o agua de la llave Mechero Asa y porta asa Puente de coloración Gradilla metálica Lámpara de alcohol 3.3 CEPAS MICROBIANAS Staphylococus aureus Escherichia coli Sacharomyces cerevisiae Mohos que se encuentren disponibles 3.4 REACTIVOS Atomizador con benzal LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS. UPIBI-IPN 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL 4.1 Preparación de Frotis: Método A Limpiar el portaobjetos con una torunda de algodón y que contenga alcohol. a.- Etiquetar la preparación, solo sobre la superficie superior del portaobjetos, la etiqueta será preferentemente pegada a la izquierda de la preparación, si con una etiqueta no basta colocar otra del lado derecho, la etiqueta llevará el nombre del microorganismos, el nombre de la tinción, el equipo, el grupo y la fecha. 10

12 LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS. UPIBI-IPN b) En la gradilla se tiene un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 2 ml de agua, de ahí tomar con el asa una pequeña gota de agua y colocarla en el centro de la superficie de un portaobjetos. c) En el mechero, flamear el asa al rojo vivo y en un radio de 20 cm de la flama del mechero, abrir el tubo de ensaye y flamearlo, tomar la muestra con el asa, volver a flamear la boca del tubo y taparlo. Dejar el tubo sobre la gradilla y con la mano izquierda tomar el portaobjetos y con la mano derecha en la que tenemos el asa extender el inoculo aproximadamente un cm 2 para obtener una película delgada de microorganismos. Flamear el asa para esterilizarla. d) Dejar secar el frotis a temperatura ambiente. d) Fijar el frotis con calor, es decir pasarlo rápidamente por la flama del mechero, luego colocarlo en el dorso de la mano, si soportamos el calor pasarlo nuevamente.. El calor deseable es aquel que soportamos en el dorso de la mano. Realizar esta operación una vez más Dejar enfriar el portaobjetos antes de teñir. Nota: Procurar no tomar una gran cantidad del inóculo de lo contrario quedará un frotis grueso, la luz no pasará y no observaremos; en caso de haber ocurrido esto entonces, observa en la periferia del frotis Método B a) Si se proporciona un tubo con una suspensión bacteriana, entonces encender el mechero. b) En un radio de 20 cm abrir el tubo, flamearlo y con el asa tomar un inóculo de la suspensión. c) Flamear la boca del tubo de ensaye, cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla d) Colocar el inóculo en el centro de un portaobjetos limpio. Extender el inóculo por lo menos 1 cm 2, y flamear el asa. Dejar secar el frotis y fijarlo al calor. 4.2 Examen en fresco de una muestra agua estancada De la muestra de agua estancada que se ha traído al laboratorio, colocar una gota en un portaobjetos limpio Con la ayuda de una pipeta Pasteur colocar en el centro una gota de la muestra y cubrirla con un cubreobjetos Al colocarle el cubreobjetos dejarlo caer con un movimiento rápido para evitar que se formen burbujas Observar al microscopio óptico o de contraste de fases con el objetivo de 10 X y 40 X. 11

13 LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS. UPIBI-IPN 4.3 Preparación en fresco de un moho Colocar una gota del colorante azul de algodón lactofenol Colocar el inoculo y hacer una pequeña extensión Colocarle el cubreobjetos sin realizar burbujas Observar la preparación al microscopio con el objetivo 10X y 40X. Si se requiere que la preparación dure un poco más se sellar los bordes del cubreobjetos con barniz de uñas transparentes. 4.4 Tinción simple a) Tomar la preparación fija de Staphylococcus aureus y colocarla el colorante que previamente les ha tocado b) Tomar el tiempo por 1 minuto c) Enjuagar el portaobjetos en el recipiente que contiene el agua d) Dejar secar la preparación y observarla al microscopio con el objetivo de 40 y 100 X. 4.5 Tinciones diferenciales Tinción de Gram completa: a) Colocar los frotis correspondiente de cada uno de los microorganismos Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus en el puente de coloración. b) Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto. c) Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante. d) Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto. e) Lavar los frotis con agua de la llave. f) Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 15 segundos. g) Lavar inmediatamente con agua de la llave. h) Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos i) Lavar los frotis con agua de la llave. j) Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el objetivo de 100X. (Previamente realizar la técnica de iluminación de Köhler y enfocar a 10 y 40X) 4.6 Tinción de Gram decolorada: a) Colocar un frotis fijado de Bacillus subtilis y de Escherichia coli en el puente de coloración. b) Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto. c) Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante. d) Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto. e) Lavar los frotis con agua de la llave. f) Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 90 segundos. g) Lavar inmediatamente con agua de la llave. 12

14 LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS. UPIBI-IPN h) Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos i) Lavar los frotis con agua de la llave. j) Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el objetivo de 100 X. 4.7 Tinción de Gram completa aplicada a una suspensión de microorganismos: a) Colocar un frotis fijado de una mezcla de Escherichia coli y Staphylococcus aureus. b) Cubrir el frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto. c) Lavar el frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante. d) Cubrir el frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto. e) Lavar el frotis con agua de la llave. f) Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 30 segundos. g) Lavar inmediatamente con agua de la llave. h) Cubrir el frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos i) Lavar el frotis con agua de la llave. j) Dejar secar el frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el objetivo de 100 X. 4.8 Tinción de Ziehl-Neelsen. a) Colocar el frotis correspondiente en el puente de coloración b) Cubrir los frotis con fucsina-fenicada y calentar con una lámpara de alcohol, hasta que emita vapores, aplicar calor periódicamente durante cinco minutos sin que se seque la preparación y esperar a que se enfríe. c) Enjuagar con agua de la llave. d) Cubrir los frotis con alcohol ácido por un minuto. e) Enjuagar con agua de la llave. f) Cubrir los frotis con azul de metileno por un minuto g) Enjuagar y dejar secar los frotis y observarlos con el microscopio utilizando lente de inmersión 4.9 Tinción específica Tinción de Shaeffer Fulton a) Cubrir el frotis correspondiente con verde de malaquita y calentar con una lámpara de alcohol, hasta que emita vapores, aplicar calor periódicamente durante cinco minutos, sin que se seque la preparación. b) Dejar que el frotis se enfríe. c) Lavar con agua de la llave. d) Cubrir el frotis con safranina por un minuto. e) Enjuagar, dejar secar y observar con el microscopio utilizando lente de inmersión. 13

15 5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO 5.1 Realiza el esquema de la preparación en fresco del moho observado. 5.2 Realiza un esquema de lo observado en el microscopio en la siguiente tabla LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS. UPIBI-IPN Aumento 40X Agua estancada Tinción Simple Tinción diferencial: Gram completa Tinción de Gram: decoloración Tinción de Ziehl-Neelsen Tinción específica Shaeffer y Fulton 100X 5.3 Cuales son los inconvenientes al realizar un frotis con una gran carga microbiana? 5.4 Cual es la finalidad de observar una muestra en fresco? 5.5 Por qué se coloca un cubreobjetos sobre la muestra? 5.6 Cuál es el propósito de fijar los frotis? 5.7 Cómo afecta la edad del cultivo en la técnica de Gram? 5.8 Por qué la tinción de Gram no se emplea para teñir mohos? 5.9 Cuando es recomendable utilizar una tinción simple y que colorante utilizarías? 5.10 Cuál es la finalidad de utilizar el barniz de uñas en las preparaciones en fresco? 6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 6.1 Discutir las ventajas y desventajas de las preparaciones en fresco, preparaciones fijas y tipos de tinciones adecuadas para cada una de ellas. 7. CONCLUSIONES 7.1 Elaborar las conclusiones con base al análisis y discusión de las ventajas y desventajas en la realización de preparaciones en fresco y fijas, el fundamento de las tinciones diferenciales, comparando con la bibliografía consultada y los objetivos de la práctica. 8 BIBLIOGRAFÍA 8.1 Lymch, M.J.; S.S. Raphael: L. D. Mellor; D.D. Spare, M. J., Inwood. Métodos de Laboratorio. 2ª Edición. Interamericana. México pags. 14

16 PRACTICA No. 3 ESTERILIZACIÓN UNIDAD II: Esterilización TEMA: Agentes físicos. Calor húmedo, calor seco Filtración a través de membrana Prueba de esterilidad (Método de la tira de papel impregnada con esporas) 1. OBJETIVOS 1.1 Objetivo general El alumno preparará material de uso en microbiología para su esterilización Utilizará el método adecuado de esterilización de acuerdo al tipo de material I.2 Objetivo específicos Lavar el material a esterilizar para uso en el área microbiológica Preparar el material de vidrio e instrumental para ser esterilizado por calor seco Preparar el material de vidrio e instrumental para ser esterilizado por calor húmedo Esterilizar el material previamente preparado, por calor seco y calor húmedo. Realizar el proceso de filtración a través de membrana LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS.UPIBI-IPN 2. INTRODUCCIÓN La esterilización es un proceso que destruye o elimina los microorganismos. La esterilización se puede realizar a través de métodos físicos y químicos. Para seleccionar el más adecuado es necesario conocer la naturaleza del material, aunque algunos pueden tener varias formas de esterilización. Métodos físicos Calor húmedo: La aplicación de calor es el método más simple para esterilizar un material, a condición de que no sufra daño en sí mismo. Una temperatura de 100 C matará a todas las formas vegetativas de Eubacterias, pero no las esporas ni a las Arqueobacterias extremófilas, para matar a estas es necesario una temperatura de 121 C, 15 minutos y 15 libras de presión. La muerte microbiana se produce por la desnaturalización de las proteínas, generalmente se utiliza vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando se encuentran húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas las partes del recipiente. Calor seco: Para esterilizar materiales que deben permanecer secos se dispone de hornos eléctricos por los que circula aire caliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se aplica una temperatura de C durante una h. Para ambos tipos de calor aplicadas en los tiempos ya mencionados el calor actúa desnaturalizando las proteínas y los ácidos nucleicos de la célula y fragmentando las membranas celulares. Incineración: La llama es un agente esterilizador eficaz, y el más simple de todos. Es frecuentemente utilizado para esterilizar el asa bacteriológica para sembrar o resembrar un cultivo. Al flamear el asa, debe evitarse de ser posible, que dicha asa lleve grandes cantidades de material biológico, pues éste podría saltar diseminándose partículas infectantes. A veces para instrumentos como tijeras, hojas de bisturí o pinzas, se puede esterilizar el material mojándolo con alcohol y encendiéndolo éste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilización completa. El método es rápido pero produce carbonización y pérdida del filo. 15

17 LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS.UPIBI-IPN Radiaciones ionizante y no ionizante: La radiación ultravioleta provoca daño en el DNA, la luz ultravioleta induce el entrecruzamiento entre pirimidinas adyacentes en una u otra de las dos tiras de polinucleótidos, formando dímeros pirimidínicos, las radiaciones ionizantes producen roturas en las tiras sencillas y en las dobles. Pueden emplearse también ondas supersónicas o ultrasónicas para romper o desintegrar a la célula. Filtración a través de Membranas Algunas sustancias no pueden ser esterilizadas por calor húmedo o seco pues son termolábiles, es decir que se desnaturalizan o que pierden alguna propiedad deseable, en tal caso se utilizan sistemas de filtración de membranas para retener a los microorganismos. Aquí debemos de conocer las dimensiones del microorganismo a eliminar para poder utilizar el filtro adecuado (diámetro). Los filtros utilizados son fabricados con porcelana, cuarzo, tierra de diatomeas, vidrio pulverizado, asbesto o ésteres de celulosa, para la filtración a través de membrana, se utiliza como bioindicador a Pseudomonas diminuta para filtros con porosidad de 0.22 µm, como mínimo. Jeringas y portamembranas Métodos químicos Gases (oxido de etileno) y líquidos (formaldehído y β propiolactona) Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógeno lábiles como los que tiene grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos e hidroxilos. Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria farmacéutica, sirve para esterilizar material termosensible como el plástico, equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo y además cancerigeno, por lo que se suministra normalmente con una concentración entre el 10 y el 20 % de CO 2. La concentración de óxido de etileno, la humedad y la temperatura influyen sobre la velocidad de esterilización. Un objeto limpio puede esterilizarse si se trata de 5 a 8 h a 38 C o de 3 a 4 h a 54 C, cuando la humedad relativa se mantiene entre el 40 y el 50 % y la concentración de óxido de etileno es de 700 mg/l. Una vez esterilizado el material es necesario airear para eliminar el óxido de etileno residual porque es muy tóxico. La β-propiolactona se emplea para esterilizar vacunas y suero, se degrada hasta una forma inactiva después de varias h y, por ello, no es tan difícil de eliminar. Destruye a los microorganismos más rápidamente que el óxido de etileno, pero no penetra tan bien en los materiales y puede ser cancerígena. Indicadores biológicos para el proceso de esterilización En todo lugar en donde se realice esterilización se debe de contar con indicadores de calidad que manifiesten que la esterilización se ha llevado correctamente y que dicho material se encuentra estéril, para ello existen en el mercado varios indicadores que se introducen con el material a esterilizar y posteriormente se verifica un cambio de color o turbidez de la ampolleta. 16

18 LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS.UPIBI-IPN Método de la tira de papel Las esporas de Geobacillus stearothermophilus.- En un proceso de esterilización por calor húmedo, se utilizan tres tiras impregnadas con las esporas del microorganismo, colocando una que se esteriliza previamente y servirá como control negativo; una tira sin esterilizar que fungirá como control positivo y una tira más se coloca en la muestra que se va a esterilizar. Una vez concluido el proceso de esterilización, cada tira se transfiere, bajo condiciones asépticas, a tubos con caldo de un medio enriquecido estéril y se incuban a 55 C durante 7 días. Al término de la incubación, se observa si hay crecimiento en cada uno de los tubos. Si la tira control positivo no presenta crecimiento o si la tira control negativo presenta crecimiento, se invalida el proceso. Si hay crecimiento solamente en la tira que corresponde al seguimiento del proceso, este se realizó en condiciones incorrectas y no hubo esterilización. Si no hay crecimiento solamente en la tira control negativo y en la tira de la muestra, el proceso se realizó correctamente. Método de la ampolleta: Son ampolletas que contienen una suspensión de Geobacillus stearothermophilus en medio de cultivo con púrpura de bromocresol como indicador. Las ampolletas indicadoras se colocan entre el material que se va a esterilizar por calor húmedo. Al término del proceso de esterilización, las ampolletas (sin abrir) se incuban entre 55 y 65 C durante 24 h, la turbidez y la aparición de un color amarillo indica un proceso de esterilización incorrecto. Al mismo tiempo se incuba una ampolleta sin esterilizar como control positivo, la cual debe mostrar desarrollo bacteriano y el medio se vuelve amarillo. OTROS AGENTES ESTERILIZANTES: Para instrumentos como hojas de bisturí, tijeras o pinzas, se esteriliza el material, impregnando con alcohol y poniéndolo a la flama hasta que se apague solo repitiendo el procedimiento tres veces. El método tiene la ventaja de ser rápido pero se produce carbonización y pérdida de filo. Pueden emplearse ondas supersónicas o ultrasónicas de 9000 ciclos / s, para romper y desintegrar las células. Se cree que las bacterias se dañan y destruyen por la formación de pequeñas burbujas de gas en la suspensión a consecuencia de las ondas sonoras. NOTAS: -Los tubos o frascos con tapa de baquelita, nunca deben cerrarse completamente. -Si existe material que ha estado en contacto con cultivo de microorganismos, éste debe ser esterilizado en autoclave a 121 o C, 1,05 atm de presión durante 15 minutos - Recolectar los desechos del material esterilizado en recipientes adecuados para darle una disposición final ambientalmente responsable. 3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO 3.1 EQUIPO Autoclave a 121 C Baño María a 55 C Autoclave a 110 C Membranas con porosidad de 0,45 µm de diámetro. Horno a 170 C Termómetros de 150 Incubadora a 35 C Termómetro de 200 C 17

19 3.2 MATERIAL Papel aluminio Papel Kraft Algodón 2 cajas de Petri 2 matraces de 125 ml 3 pipetas de 2, 5 y 10 ml Una pinza de disección Una tijera Una gradilla Un cilindro pipetero Un cilindro para cajas de Petri 3.3 MEDIOS DE CULTIVO 4 tubos de 16 x 150 mm con 3 ml de caldo nutritivo 2 matraces con 20 ml de caldo nutritivo estéril 2 tubos de 113 X 100 con 3 ml de caldo nutritivo sin esterilizar 3.4 CEPAS MICROBIANAS Tiras controles de esporas Suspensión microbiana de Escherichia coli 3.5 REACTIVOS Agua destilada Caldo nutritivo LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS.UPIBI-IPN Un mechero Fisher Un vaso de precipitados de 100 ml 8 tiras de papel filtro Ligas Un sistema Millex HA Un portamembranas de filtración Membranas de 0.45 micrones de porosidad Escobillones de diferentes tamaños Una esponja Un tubo de ensaye 13 X 100 estéril con caldo nutritivo 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN 4.1 Lavado de material de vidrio e instrumental a).utilizando escobillones para pipetas, tubos y matraces y una fibra suave para las cajas de Petri, el material plano y el instrumental metálico lavar el material que se va a esterilizar, utilizando detergentes aniónicos que no dejan residuos b) Enjuagar suficientemente con agua de la llave c) Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura ambiente. 4.2 PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO TUBOS DE ENSAYO a) Tapar 2 tubos de 16 x 150 mm con tapones de algodón siguiendo las indicaciones del profesor b) Colocar los tubos en un bote de lámina, taparlos con papel Kraft y asegurarlos con una liga, anotar fecha, equipo, grupo, medida de los tubos y cantidad preparada. 21

20 LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS.UPIBI-IPN CAJAS DE PETRI a) Envolver 8 cajas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor. Anotar en el papel, la cantidad de cajas envueltas, fecha, equipo, número de equipo de laboratorio y grupo PIPETAS a) Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy compactado, utilizar para ello una aguja de disección o un clip b) Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el exceso de algodón c) Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremo con masking-tape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la fecha, el grupo y el número de equipo de laboratorio. Con una fecha indicar el sentido de la punta de la pipeta MATRACES a) Colocar en la boca de cada matraz un tapón compacto de algodón, envuelto con gasa, siguiendo las instrucciones del profesor. b) Con papel Kraft, elaborar un gorro ligeramente más grande que el tapón de algodón. c) En una tira de Masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo, adherir el Masking-tape al matraz. No anotar los datos sobre el gorro de papel PINZAS Y TIJERAS a) Envolver con papel Kraft una pinza o tijera y con lápiz señalar con una flecha la punta. b) Anotar en el papel la pieza de que se trate, la fecha, grupo y equipo PORTAMEMBRANAS Y MEMBRANAS DE 0.45 MICRONES DE POROSIDAD a) Abrir el portamembranas, revisar que contenga el empaque y con la ayuda de pinzas, colocar una membrana de 0.45 micrones de porosidad, del diámetro adecuado al tamaño del portamembrana, cerrar adecuadamente, envolver en papel Kraft, siguiendo las instrucciones del profesor. 4.3 PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO TUBOS DE ENSAYE a) Colocar en 2 tubos de ensaye, una cubierta de papel aluminio y colocarlos en una canastilla metálica. b) Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, grupo y equipo, sujetar el papel con masking-tape CAJAS DE PETRI a) Colocar en el interior de un cilindro de acero inoxidable para cajas de Petri dos cajas en posición invertida perfectamente secas. (NUNCA ESTERILIZAR POR ESTE MÉTODO MATERIAL CONTAMINADO) b) Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, el número de cajas que contiene el cilindro, el grupo y la fecha. Colocar la tira de papel entre la tapa del cilindro. 21