DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE HEMOPARASITOSIS I. PALUDISMO

Transcripción

1 TEMA 9 DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE HEMOPARASITOSIS I. PALUDISMO Pilar Tajada Alegre Programa de Formación Continuada a Distancia 2011

2 DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE HEMOPARASITOSIS I. PALUDISMO Pilar Tajada Alegre Doctora en Farmacia. Especialista en Análisis Clínicos. Complejo Hospitalario de Segovia. Especialista Universitario en Diagnóstico Parasitológico. INDICE 1. INTRODUCCIÓN 2. ETIOLOGÍA 3. EPIDEMIOLOGÍA 4. TRANSMISIÓN 5. CICLO BIOLÓGICO 6. PATOGENIA 6.1. Mecanismos patogénicos 6.2. Mecanismos de defensa Naturales Adquiridos 7. MANIFESTACIONES CLÍNICAS 7.1. Malaria no complicada 7.2. Malaria complicada 7.3. Diagnóstico diferencial 8. DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO 8.1. Métodos directos Diagnóstico microscópico a) Preparación de las muestras 1. Frotis sanguíneo 2. Gota gruesa b) Tinciones c) Examen microscópico d) Cálculo de la parasitemia Técnicas inmunocromatográficas a) Detección proteína rica en histidina HRP-2 b) Detección enzima parasitaria LDH (lactato deshidrogenasa) Diagnóstico molecular 8.2. Métodos indirectos 9. BIBLIOGRAFÍA Y ENLACES OBJETIVOS ESPECÍFICOS: Una vez finalizada la acción formativa, los alumnos habrán conseguido: 1. Conocer los aspectos fundamentales de la epidemiología del paludismo. 2. Conocer las distintas formas parasitarias que integran el ciclo biológico de Plasmodium. 3. Conocer las manifestaciones clínicas del paludismo. 4. Conocer las principales técnicas diagnósticas a disposición del laboratorio para poder abordar un caso de paludismo. 5. Conocer las claves diagnósticas para la diferenciación microscópica de las especies de Plasmodium.

3 El paludismo es una de las enfermedades importadas que ha cobrado interés como consecuencia de los movimientos migratorios, el turismo y la cooperación internacional. Para los profesionales del laboratorio clínico, es importante conocer cómo llevar a cabo un diagnóstico preciso lo más rápidamente posible. Diagnosticar a tiempo un caso de paludismo puede ser vital para el paciente, ya que la aparición de complicaciones está muy relacionada con la demora del tratamiento. Esta unidad didáctica trata a partir de las guías clínicas y páginas webs más relevantes sobre Medicina del Viajero de proporcionar las herramientas diagnósticas para conseguir este objetivo. 1. INTRODUCCIÓN El paludismo o malaria es la enfermedad parasitaria tropical más importante en el mundo. Constituye la quinta causa de muerte por enfermedades infecciosas tras las infecciones respiratorias, HIV, enfermedades diarreicas y tuberculosis. A pesar de que el paludismo es una enfermedad que se puede prevenir y curar, se estima que cada año se infectan entre 350 y 500 millones de personas y se produce casi un millón de muertes por esta causa. Los niños constituyen un grupo especial de riesgo; se calcula que entre 2000 y 3000 menores de 5 años fallecen diariamente por paludismo, es decir que cada 30 segundos muere un niño por malaria. En África, uno de cada cinco niños (20%) muere debido a los efectos de la enfermedad. 2. ETIOLOGÍA El paludismo es una enfermedad parasitaria causada por protozoos intracelulares del género Plasmodium. De las más de 150 especies de Plasmodium que parasitan a diferentes vertebrados, solamente cinco infectan al hombre: P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae y P. knowlesi. P.knowlesi, similar morfológicamente a P. malariae, se localiza en todo el sudeste asiático como patógeno natural de macacos y recientemente ha sido identificado como agente causal de malaria en humanos. Se le considera una malaria zoonótica ya que se desconoce si se transmite de humano a humano a través de mosquitos sin el hospedador intermediario natural que son los macacos. 3. EPIDEMIOLOGÍA El paludismo es una enfermedad parasitaria conocida desde la antigüedad. Este parásito es uno de los patógenos humanos más importantes y ha desempeñado un papel muy significativo en el desarrollo y propagación de las diferentes culturas humanas. El hecho de que la enfermedad estuviera asociada a la presencia de zonas pantanosas dio origen a los dos nombres con los que se la conoce actualmente, paludismo (del latín palus= pantano) y malaria (del italiano mala aria= mal aire). Respecto a la distribución de la enfermedad, el 40% de la población mundial habita en zonas de riesgo palúdico. El paludismo es endémico en África, gran parte del sur y sudeste asiático, América Central y norte de Sudamérica. En 2009, la malaria ha estado presente en 108 países y territorios y el 90% de las muertes se ha producido en África. En la Fig. 1. se muestra las áreas de riesgo de transmisión de malaria. La distribución geográfica de las especies parasitarias difiere entre sí: P. falciparum produce las formas más graves de malaria y se distribuye por todas las zonas palúdicas, predominando en África Subsahariana, Sudeste asiático, Oceanía, Haití, República Dominicana y zonas del Amazonas ; P. malariae tiene un área de distribución similar a la de P. falciparum pero es mucho menos frecuente; P. vivax, es el que posee mayor diseminación y predomina en América Central y del Sur, Oriente Medio e India; 1

4 y P. ovale, se localiza casi de modo exclusivo en África tropical, especialmente en África Occidental. Los casos esporádicos de malaria en humanos por P. knowlesi detectados en 2004 mediante métodos moleculares se han producido en zonas boscosas del sudeste asiático en Malasia, Filipinas, Tailandia y Myanmar. Aunque el paludismo sea una enfermedad ampliamente distribuida en los trópicos, el riesgo de adquisición es muy heterogéneo, y varía de país a país, e incluso de zona a zona dentro del mismo país. El destino geográfico, la ruta específica seguida, el tipo y la duración del viaje o la estación del año en que se realiza son factores determinantes del riesgo. Los viajeros internacionales procedentes de zonas no endémicas tienen un alto riesgo de contraer paludismo y padecer sus consecuencias al no ser inmunes. Los inmigrantes procedentes de zonas endémicas que viven actualmente en zonas no endémicas y vuelven a su país de origen a visitar a sus amigos y familiares también están en riesgo porque carecen de inmunidad o la tienen disminuida. Para una información detallada sobre las enfermedades infecciosas de potencial riesgo para los viajeros, es útil consultar la información disponible. El National Travel Health Network and Centre (NaTHNaC) proporciona guías informativas para los profesionales sanitarios y viajeros ( En el apartado de información por países está disponible la información sobre la salud del viajero para cada país del mundo ( y en las páginas web de la OMS ( y 4. TRANSMISIÓN La malaria se puede adquirir a través de las siguientes vías: 1.- Transmisión natural: a través de la picadura de mosquitos hembras del género Anopheles previamente infectados (Fig. 2). Las hembras son hematófagas ya que necesitan la ingesta de sangre cada 2-3 días para favorecer el desarrollo de los huevos que gestan en su interior. Los machos viven tan sólo unos pocos días, y al no alimentarse de sangre, no juegan ningún papel en la transmisión de la enfermedad, salvo la de fecundar a las hembras. Una vez que el mosquito hembra es infectado, permanece infectante durante toda su vida (de 1-6 meses). El mosquito pica principalmente entre el atardecer y el amanecer. Figura 1. Áreas de riesgo palúdico. Fuente: 2

5 Figura 2. Mosquito Anopheles, vector del paludismo. Fuente: CDC La intensidad de la transmisión depende de factores relacionados con el parásito, el vector, el hospedador y condiciones ambientales. Los climas cálidos con alto grado de humedad y abundante pluviosidad favorecen la transmisión al crear condiciones ideales para la supervivencia del vector. La malaria está restringida a regiones húmedas tropicales y subtropicales con temperaturas entre 20-30ºC y altitudes inferiores a metros. 2.- Otras vías de transmisión: directamente sin la intervención de mosquitos desde un individuo parasitado a uno sano a través de: a) transfusión sanguínea de un individuo infectado (la sangre contaminada almacenada puede ser infectante durante un mes, como mínimo). El riesgo de esta forma de transmisión en los países desarrollados es muy baja (menos de 1 caso por millón de habitantes) y se produce, sobre todo, a partir de donaciones de inmigrantes asintomáticos. b) pinchazo accidental c) diálisis d) trasplante de órgano sólido de un donante infectado e) compartir agujas y jeringuillas contaminadas (por ej., entre adictos a drogas por vía parenteral que vivan en países endémicos de malaria) f) experimental (manipulando material contaminado) g) transmisión congénita transplacentaria de la madre infectada al feto 5. CICLO BIOLÓGICO El ciclo biológico de Plasmodium es complejo (Fig. 3 y 4). Los parásitos del paludismo poseen un ciclo vital heteróxeno, ya que requiere la presencia de dos hospedadores para su desarrollo: un vértebrado (entre los que se incluye el hombre) que es el huésped intermediario, donde se produce la fase asexual (proceso esquizogónico) y un invertebrado, el mosquito Anopheles, que es el huésped definitivo y vector donde se produce la fase sexual (proceso esporogónico). La transmisión del parásito se produce cuando el mosquito Anopheles hembra se alimenta de sangre de una persona infectada e ingiere las formas parasitarias de Plasmodium llamadas gametocitos. En 1-2 semanas los gametocitos se reproducen sexualmente en el estómago del mosquito, dando lugar a un cigoto, que se transforma en ooquineto. Ésta forma móvil es capaz de atravesar la pared del estómago del mosquito y convertirse en un ooquiste. El ooquiste tras múltiples divisiones celulares genera miles de esporozoítos, los cuales migran desde la cavidad abdominal hacia la glándula salival del mosquito para poder así infectar otro huésped con la picadura. Al proceso desarrollado dentro del insecto se le conoce como ciclo esporogónico y su duración depende del mosquito, de la temperatura ambiente y de la especie de Plasmodium con un rango desde 8 días en P. vivax a 30 días en P. malariae. Cuando el mosquito Anopheles infectado pica al hospedador vertebrado, inocula saliva y, ayudado por sus funciones analgésicas y antihemostásicas, obtiene la sangre y le transmite los esporozoítos presentes en sus glándulas salivares que son la forma infectante. Aunque las glándulas salivares pueden contener hasta esporozoítos, solamente de son 3

6 inoculados durante la picadura. Los esporozoítos inyectados por vía sanguínea alcanzan en 10 ó 15 minutos el hígado e infectan a los hepatocitos. Los esporozoítos se unen a los hepatocitos por procesos mediados por receptores en los que participan moléculas de superficie del parásito, moléculas secretadas por el aparato apical del mismo y moléculas de superficie de los hepatocitos. Una vez en el interior del hepatocito, maduran y adoptan forma de esquizontes tisulares. Cada esquizonte es capaz de dividirse de forma asexual por partición nuclear, transformándose cada división en una nueva célula parásita denominada merozoíto. Debido a la elevada multiplicación de los parásitos, el hepatocito se rompe liberando miles de merozoítos que pueden invadir nuevas células hepáticas desarrollándose así un ciclo denominado esquizogónico exoeritrocítico. En el caso de P.vivax y P. ovale puede ocurrir que algunos parásitos permanezcan en el hígado en la forma latente denominada hipnozoíto. Éstos pueden reactivarse después de periodos variables (de meses a varios años (hasta 2 años en P. vivax, 4 en P. ovale), originando nuevos esquizontes y, de ellos, merozoítos, los cuales inician nuevos cuadros clínicos de la enfermedad ( recidivas o recaídas ). P. falciparum, P. malariae y P. knowlesi no desarrollan hipnozoítos en el hígado y por tanto no originan recaídas. Sin embargo, P. malariae puede causar recrudescencias debido a infecciones crípticas que se pueden convertir en sintomáticas años o décadas más tarde, por ello P. malariae constituye la causa más común de paludismo por transfusión. Después de la replicación inicial en el hígado, un determinado número de merozoítos pasan a sangre e invaden los eritrocitos iniciando un ciclo de multiplicación asexual denominado ciclo esquizogónico intraeritrocítico. La duración de este ciclo depende de la especie de Plasmodium: 24 horas (P. knowlesi), 48 horas (P. vivax, P. ovale, P. falciparum) o 72 horas (P. malariae). Los parásitos no penetran los hematíes sino que pasan la membrana celular mediante endocitosis y permanecen encerrados en una membrana parasitófora. En el interior del glóbulo rojo, el merozoíto digiere proteínas hemáticas, principalmente la hemoglobina, elabora un pigmento hemático oscuro y adquiere una forma típica anillada, vacuolada, más o menos ameboide llamada trofozoíto. Éste crece y evoluciona a esquizonte multinucleado eritrocitario con un número de merozoítos que es característico de cada especie: 8-32 en P. falciparum, en los casos de P. vivax, 6-14 en los de P. ovale y 6-12 en P. malariae. En 24, 48 ó 72 horas se rompen los eritrocitos parasitados y los merozoítos quedan libres en la sangre pudiendo infectar a nuevos eritrocitos, con lo que empieza un nuevo ciclo sexual y aumenta progresivamente la parasitemia. Después de varios ciclos intraeritrocíticos, algunos merozoítos se transforman en gametocitos (formas sexuadas), diferenciados en microgametocitos (gametos masculinos) y macrogametocitos (femeninos). Tienen forma globosa, son más grandes que los merozoítos y no poseen capacidad para infectar a nuevos hematíes. Los gametocitos son la forma infectiva para el mosquito pero son células inmaduras que habitualmente mueren a las dos semanas si no son ingeridos por el vector. Con estas fases alternantes, asexuada en el hombre enfermo y sexuada en el interior del mosquito, queda cerrado el ciclo evolutivo del parásito. 6. PATOGENIA La patogenia del paludismo es consecuencia de la infección eritrocitaria y varía según la especie de Plasmodium. La agresividad de las infecciones está relacionada con el número de hematíes parasitados. Mientras P. vivax y P. ovale tienen predilección por los hematíes jóvenes y P. malariae sólo por los maduros, P. falciparum parasita hematíes de todas las edades, lo que explica el alto grado de parasitación que puede alcanzarse durante la infección por este último. La enfermedad provocada por P. falciparum es más grave y cualitativamente diferente a la provocada por las otras especies de Plasmodium. Esta patogenicidad se debe a la capacidad del parásito de producir daño microvascular a través de los siguientes mecanismos: 4

7 Figura 3. Ciclo biológico de Plasmodium. Fuente: Adaptación de: y ) 6.1. Mecanismos patogénicos La parasitación por P. falciparum origina en los hematíes: alteraciones de su membrana, incremento de la permeabilidad, aumento de la fragilidad, pérdida de elasticidad y disminución del transporte de oxígeno. Los mecanismos patogénicos derivados de la alteración de la membrana eritrocítica son: 5

8 Figura 4. Ciclos exo e intraeritrocíticos de Plasmodium. Fuente: a) Citoadherencia o secuestro: Los mecanismos de patogenia de la malaria grave se deben principalmente a las propiedades de adhesión que adquieren los eritrocitos infectados (EI) por P. falciparum. Los EI se alteran morfológicamente tras la penetración del merozoíto y son capaces de unirse a las células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos mediante un fenómeno de adhesión conocido como citoadherencia o secuestro. Al evolucionar P. falciparum dentro del hematíe, desde la forma anillada a trofozoíto maduro y esquizonte, induce la formación en la membrana del hematíe parasitado de pequeñas protuberancias electrodensas llamadas knobs (ligando). Los knobs disminuyen la carga eléctrica del eritrocito y con esto aumenta la adhesividad endotelial con receptores de membrana en las células epiteliales. Los knobs están ausentes en los hematíes parasitados por formas jóvenes en anillo, por lo que éste es el único estadio que se encuentra en sangre periférica. Los knobs están compuestos de proteínas producidas por el parásito, como el PfEMP-1, PfEMP-2, KAHRP, y RESA así como proteínas del huésped (espectrina, actina). Las protuberancias anclan el hematíe parasitado a receptores de distintos tipos celulares de los capilares y vénulas, incluidas las células del endotelio vascular, bloqueando la microcirculación sanguínea. Los receptores más destacados para la unión de los EI son: ICAM-1 (molécula de adhesión intercelular) en endotelio vascular, CD36 en endotelio y plaquetas, CSA (condroitín sulfato A) en placenta, TSP (trombospondina), E-selectina, AH (ácido hialurónico) y VCAM-1 (molécula de adhesión celular vascular). Esta citoadherencia se estimula por la integrina LFA-1 procedente de la superficie de las plaquetas y por citocinas circulantes como -TNF (factor de necrosis tumoral) producidas por los macrófagos activados. Las citocinas macrofágicas, no sólo activan los receptores endoteliales, sino que producen daño endotelial directo y estimulan la producción de óxido nítrico (NO), existiendo una evidente correlación entre los niveles séricos de -TNF (>200 pg/ml) y la mortalidad. 6

9 La citoadherencia le permite al parásito quedar secuestrado en el endotelio vascular, obtener un ambiente microaerofílico, evadir la respuesta inmune y evitar la destrucción en el bazo. b) Formación de rosetas y autoaglutinación: Además del fenómeno de secuestro, los EI pueden adherirse a través de los knobs con eritrocitos no parasitados para formar rosetas, o bien, unirse a otros EI y constituir complejos de autoaglutinación. Estos mecanismos patogénicos conducen a la alteración del flujo sanguíneo, lo que promueve las disfunciones metabólicas que producen las principales manifestaciones del paludismo. c) Toxicidad tisular por pigmentos parasitarios: Cuando el parásito se desarrolla en el interior del hematíe, se acumulan numerosas sustancias de desecho como el pigmento producido por el parásito llamado hemozoína. El pigmento malárico es un producto de digestión de la hemoglobina absorbida por el parásito, constituido por hematina y proteína (durante la fase intraeritrocitaria, Plasmodium digiere hasta el 70% de la hemoglobina del hematíe). Este pigmento aparece como gránulos oscuros, especialmente en los estadios tardíos de desarrollo del parásito. Al lisarse los hematíes parasitados, se liberan los merozoítos junto con los pigmentos a la circulación. La hemozoína y otras sustancias tóxicas como la glucosafosfatoisomerasa (GPI) estimulan la producción por los macrófagos de citoquinas y factores solubles, lo que además de generar la fiebre, probablemente influya en la grave fisiopatología asociada a la malaria. Los pigmentos son transportados hasta diversos tejidos donde se acumulan (hígado, riñón, cerebro, etc.) y ejercen un efecto hiperpigmentario tóxico. En casos graves, el depósito de pigmentos en órganos vitales puede llevar a la muerte del paciente Mecanismos de defensa Naturales A pesar de que la susceptibilidad al paludismo es universal, existen determinados rasgos genéticos relacionados con la hemoglobina y con los antígenos eritrocitarios que pueden proteger al individuo frente a la malaria: hemoglobinopatías: ovalocitosis (frecuente en el sudeste asiático), eliptocitosis hereditaria, rasgo drepanocítico (hemoglobinopatías HbS, HbC, HbF, talasemia alfa y beta), esferocitosis, mutaciones enzimáticas de los hematíes como el déficit de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (G6PD) (al no producir 6-fosfoglucona lactona y productos subsiguientes se impide la dotación energética para el plasmodio) o de piruvatokinasa. antígenos eritrocitarios: grupo de sangre O, grupo Duffy negativo. La mayoría de los habitantes del oeste de África muestran inmunidad natural al P. vivax, ya que la mayor parte no presenta en sus hematíes el antígeno Duffy, determinante del grupo sanguíneo que facilita su penetración. En ese área geográfica, P. vivax ha sido sustituido por P. ovale, un parásito muy similar que si infecta a individuos Duffy negativos Adquiridos Los individuos que viven en áreas endémicas desarrollan una inmunidad adquirida contra la malaria. Esta inmunidad es difícil de conseguir (se tardan años, ya que se deben producir infecciones repetidas), es parcial (sólo frente a los parásitos a los que se ha estado expuesto) y es temporal (se pierde en gran medida al salir de la zona endémica e interrumpirse la inoculación). Por ello, se habla de semi-inmunidad. 7. MANIFESTACIONES CLÍNICAS En la malaria hay que tener en cuenta que: Es una enfermedad febril aguda cuyos primeros síntomas (fiebre, dolor de cabeza, escalofríos, 7

10 diarrea y vómitos) pueden ser ligeros e inespecíficos ya que asemejan a un estado gripal y dificultan su diagnóstico. La fase exoeritrocítica del parásito a nivel hepático es asintomática (no produce ictericia pero si aumento de transaminasas) mientras que las formas parasitarias sanguíneas son las responsables de las manifestaciones clínicas de la enfermedad. Los signos y síntomas de la enfermedad así como la gravedad y periodicidad de la parasitación varían en función de la especie de Plasmodium, la carga parasitaria y el estado inmune del paciente. El periodo de incubación (tiempo transcurrido desde la picadura de un mosquito infectante e inoculación de los esporozoítos y la aparición de síntomas) varía según la especie de Plasmodium: el más corto es el de P. falciparum (entre 8-12 días, pero puede ser más largo cuando existe una inmunidad parcial o se ha administrado quimioprofilaxis) y el más largo para P. malariae (18-40 días); de 10 a 17 días para P. vivax y P. ovale. Algunas cepas de P. vivax y P. ovale pueden permanecer sin síntomas tras la infección debido a la presencia de hipnozoitos latentes en el hígado. El periodo de incubación de la malaria inducida por transfusión puede oscilar entre 10 horas y 60 días dependiendo de la especie de Plasmodium y del número de parásitos inoculados. Las manifestaciones comunes para todas las formas de malaria son: fiebre, anemia, ictericia, esplenomegalia, hepatomegalia y paroxismo palúdico (escalofríos). La rotura sincrónica de los hematíes parasitados cada 24, 48 ó 72 horas (en función de la especie de Plasmodium que infecte) es la desencadenante del cuadro típico de paludismo. El pródromo se caracteriza por malestar general, cefaleas y mialgias seguido de los siguientes períodos: período frío (dura entre minutos), caracterizado por escalofríos intensos; período caliente (puede durar entre 2-6 horas) caracterizado por rubefacción facial, piel seca y temperatura elevada (puede alcanzar los 40º- 41ºC) y, finalmente, por un período de sudoración profusa, descenso de la temperatura, abatimiento y somnolencia que dura de 2-4 horas MALARIA NO COMPLICADA La malaria no complicada es típica de P. vivax, P. ovale y P. malariae y tratada adecuadamente tiene una tasa de mortalidad del 1%. El inicio de los síntomas es gradual y ocasionalmente abrupto. Durante uno o dos días precede un cuadro de cefalea, malestar general y mialgias (simulando un estado gripal), luego aparece la fiebre, que en ocasiones se acompaña de dolor abdominal, diarrea o tos. Estos signos inespecíficos pueden dilatar el diagnóstico clínico de paludismo. La fiebre a menudo es irregular. A la semana, más o menos, de fiebre errática, la esquizogonia hemática se sincroniza y aparece el patrón clásico de fiebre paroxística periódica característico de cada especie: cada 24 horas en P. knowlesi, 48 horas en el caso de P. vivax y P. ovale (producen las llamadas fiebres tercianas benignas) y P. falciparum, que origina las fiebres tercianas malignas y 72 horas en P. malariae, especie responsable de las fiebres cuartanas. Cada fase de rotura de los eritrocitos parasitados y liberación masiva en sangre de merozoitos y productos del metabolismo del plasmodio se corresponde con una fase de escalofrío y de elevación de la temperatura. En los viajeros, P. falciparum no sigue con frecuencia estos patrones clásicos y el curso de la infección suele ser impredecible; en caso de no ser tratado, la enfermedad progresa y se complica, pudiendo provocar la muerte. P.vivax y P. ovale infectan sólo los reticulocitos, por lo que el nivel de parasitemia es menor. A diferencia de P. falciparum, no producen malaria cerebral, edema pulmonar o insuficiencia renal. La rotura esplénica puede ser una complicación tardía de la infección por P. vivax. Está descrito un síndrome nefrótico de etiología inmune asociado a la parasitación crónica por P. malariae. Datos analíticos: lo más frecuente en los análisis iniciales es la trombopenia (< plaquetas/µl), aumento de bilirrubina, anemia, aumento de transaminasas y leucopenia. La combinación de trombopenia y esplenomegalia o de hipocolesterolemia en viajeros febriles al regreso del trópico pueden ser indicadores de la presencia de malaria. 8

11 7.2. MALARIA COMPLICADA P. falciparum es la especie que con más frecuencia produce infecciones complicadas de malaria, siendo la responsable de la mayoría de los casos fatales en viajeros, seguida en menor medida por P. vivax. La parasitación por P. knowlesi puede progresar rápidamente desde una infección no complicada a un cuadro severo de malaria con hiperparasitemia atribuible a su ciclo replicativo de 24 horas; se han publicado casos mortales originados por esta especie. La evolución de la infección por P. falciparum es más impredecible, y con frecuencia no sigue el patrón clásico de fiebre periódica cada 48 horas. La progresión desde la infección asintomática al desarrollo de complicaciones graves puede ser extremadamente rápido (36-48 horas). Los criterios de gravedad de la OMS en los casos de malaria complicada se detallan en la Tabla 1. La mortalidad en estos casos complicados es superior al 30%. Los hematíes con esquizontes de P. falciparum se adhieren al endotelio vascular, lo que origina obstrucción de los capilares y anoxia tisular en diversos órganos. Las complicaciones afectan generalmente al sistema nervioso central, respiratorio, renal y hematopoyético: Alteraciones neurológicas: Constituyen la complicación más frecuente. En la mayoría de los casos hay una encefalopatía difusa con alteración del nivel de conciencia, a veces aparecen signos neurológicos focales y en el 60-80% de los casos se producen convulsiones. El cuadro suele durar de dos horas a varios días, es más corto en niños que en adultos y deja secuelas neurológicas en el 10% de los casos. Con el fin de aunar criterios, la OMS califica a una malaria como cerebral sólo cuando el paciente se encuentra en coma profundo no atribuible a otra causa. Como datos analíticos: el líquido cefalorraquídeo suele ser claro, con menos de 10 células/µl, proteínas ligeramente elevadas y el ácido láctico alto. Alteraciones respiratorias: Hay que diferenciar dos cuadros pulmonares que conllevan diferente pronóstico: el edema agudo de pulmón que tiene buen pronóstico y el distress respiratorio. Esta complicación implica un mal pronóstico, con una mortalidad próxima al 80%. Se debe a un aumento de la permeabilidad vascular pulmonar y con frecuencia aparece cuando disminuye la parasitemia. Alteraciones renales: El depósito de la hemozoína y complejos inmunes en el glomérulo genera una glomerulonefritis e insuficiencia renal aguda. Se observa necrosis tubular aguda y engrosamiento de la membrana basal. En personas que toman profilaxis y tratamientos intermitentes con quinina puede producirse una enfermedad grave llamada fiebre de los pantanos ( black water fever ) caracterizada por hemólisis intravascular, hemoglobinuria y fracaso renal. Alteraciones hematopoyéticas: La anemia en las infecciones por P. falciparum es más severa ya que el parásito infecta hematíes de todas las edades y la parasitemia en esta infección puede ser mucho más elevada que en las producidas por las otras especies. La anemia es normocítica y normocrómica y de causa multifactorial: la anemia y la ictericia se deben a la hemólisis intravascular de los hematíes infectados durante la liberación de los merozoítos, al secuestro de los eritrocitos infectados y no infectados en el bazo, a la menor supervivencia de los hematíes y a la aplasia medular transitoria. o Postración, alteración de la conciencia, coma o Anemia intensa (Hb <5 g/dl; hematocrito <15%) o Insuficiencia renal (diuresis < 12 ml/kg/día o creatinina > 3 mg/dl) o Edema agudo de pulmón, síndrome de distress respiratorio agudo (SDRA) o Hipoglucemia (glucemia <40 mg/dl) o Shock (hipotensión, hipoperfusión) o Coagulación intravascular diseminada (CID), hemorragias espontáneas o Convulsiones repetidas (>2 convulsiones/día) o Acidosis metabólica (ph <7.35; bicarbonato <5 meq/l; lactato > 5 meq/l) o Hemoglobinuria (sin deficiencia de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa) o Parasitemia (>5% en no inmunes; >20% en semi-inmunes) Fuente: Severe falciparum malaria. World Health Organization, Communicable Diseases Cluster. Trans R Soc Trop Med Hyg 2000; 94 Suppl 1: S1-90. Tabla 1. Criterios de gravedad en los casos de malaria complicada 9

12 Otras complicaciones: o Hipoglucemia: es una complicación infrecuente en viajeros, salvo en embarazadas. Se debe en gran medida al consumo metabólico excesivo de la glucosa circulante por el parásito y a la disminución de la glucogenolisis durante la enfermedad. Se define como severa cuando las cifras de glucemia son <40 mg/dl. Al producir alteración del estado de consciencia, puede confundirse con una malaria cerebral, sobre todo en niños. La infusión de quinina estimula directamente las células ß del páncreas, produciendo un hiperinsulinismo que agrava la hipoglucemia, por ello durante la infusión de quinina intravenosa al paciente debe administrarse suero glucosado al 10%. o Shock o colapso circulatorio: Es una complicación frecuente en viajeros. Se define cuando la tensión arterial sistólica es <70 mm de Hg ó <50 en niños de 1-5 años de edad. Es de origen multifactorial: hiponatremia, deshidratación, sepsis asociada, hemorragias, etc. o Acidosis metabólica grave o Trastornos de la coagulación: la trombopenia es una manifestación frecuentísima de la enfermedad y raramente se produce una coagulación intravascular diseminada. Los sangrados espontáneos más frecuentes son del tubo digestivo. En la infección por P. falciparum también se pueden producir unas complicaciones más específicas como: Esplenomegalia malárica reactiva: se produce en sujetos que viven en áreas endémicas como resultado de una respuesta inmunológica aberrante a los antígenos maláricos tras una exposición prolongada. Paludismo congénito: se debe a la infección local en la placenta, dado que los hematíes parasitados quedan secuestrados en ella a través del receptor sulfato de condroitina A (CSA), sumamente enriquecido en este órgano. La consecuencia de este secuestro es un pobre desarrollo fetal que conduce a que los recién nacidos tengan bajo peso al nacer o a que las madres sufran abortos espontáneos o incluso se produzca la muerte en gestantes no inmunes. Hasta en el 60% de los embarazos hay repercusiones fetales y la mortalidad materna llega al 10% Factores pronósticos El riesgo de complicaciones asociadas a una mayor gravedad y muerte se incrementa en: pacientes no inmunes, niños menores de 5 años, embarazadas, esplenectomizados, y sujetos que no han recibido quimioprofilaxis eficaz. Los principales factores que van a determinar la supervivencia del paciente son el diagnóstico precoz y el acceso a un tratamiento efectivo. En individuos no inmunes existe además una relación entre el porcentaje de parasitemia en sangre y el riesgo de muerte. La mortalidad en los viajeros también se correlaciona con la edad y la presencia de enfermedades de base DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL La sintomatología de la malaria es variada, por lo que el diagnóstico diferencial es extenso. En la tabla 2 se enumeran los síntomas que pueden acompañar a un paciente de malaria y las enfermedades a descartar. La fiebre es el síntoma cardinal que aparece en la mayoría de los casos. Por ello, se debe sospechar malaria en aquellas personas que han visitado zonas endémicas y que, entre los 7 días de haber iniciado la estancia, hasta los 2-3 meses de haberla terminado, presentan fiebre u otros síntomas inespecíficos, no atribuibles a ninguna otra causa concreta, de ahí la frase: toda fiebre en un viajero procedente de una zona de riesgo es malaria mientras no se demuestre lo contrario. La presencia de fiebre >38ºC, esplenomegalia y trombopenia en un paciente procedente de una zona palúdica aumenta la sospecha de malaria, y todavía más si se asocia a anemia y a una cifra de leucocitos normales o bajos. La trombopenia, como único dato, es el mejor indicador de malaria, pero puede confundirse con dengue, otra enfermedad febril frecuente en viajeros y que también cursa con trombopenia marcada. 10

13 Síntoma Fiebre Enfermedades a descartar Arboviriasis, hepatitis virales, rickettsiosis, leptospirosis, fiebre tifoidea, neumonía, pielonefritis, colangitis, absceso hepático amebiano. Confusión, coma Hemorragias Hepatitis, ictericia Náuseas, vómitos, diarrea Dolor abdominal Hemoglobinuria Fracaso renal agudo Shock Tos (frecuente en malaria) Meningoencefalitis viral, bacteriana, fúngica o parasitaria (enfermedad del sueño, meningitis eosinofílica por helmintos ), absceso cerebral, encefalopatías metabólicas o tóxicas (diabetes, hipoglucemia, hiponatremia, uremia,hepática.) Sepsis bacteriana, fiebres virales hemorrágicas, rickettsiosis maligna Hepatitis virales, fiebre amarilla, leptospirosis, fiebre recurrente, sepsis, colangitis, necrosis hepática tóxica Disentería, diarrea del viajero, fiebre entérica, enfermedad inflamatoria intestinal Rotura esplénica, fiebre entérica, absceso hepático amebiano, peritonitis, perforación intestinal, pancreatitis Por drogas antipalúdicas, déficit de G6PD, mioglobinuria Sepsis bacteriana, fiebre amarilla, leptospirosis, hantavirosis, por tóxicos Sepsis bacteriana, shock hipovolémico, miocarditis, deshidratación Infecciones respiratorias, tuberculosis, histoplasmosis, absceso hepático amebiano, hantavirosis pulmonar Tabla 2. Diagnóstico diferencial de los síntomas que puede presentar un paciente de malaria 8. DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO La malaria no puede ser confirmada ni excluida solamente por los datos clínicos. En inmigrantes o en viajeros en los que ha fracasado la profilaxis, los períodos de incubación se alargan, la clínica suele ser más inaparente y puede existir mayor dificultad en el diagnóstico. Por ello, el papel de los profesionales del laboratorio clínico a los que se les solicite un diagnóstico urgente de paludismo es fundamental para instaurar un tratamiento precoz que reduzca las graves complicaciones de esta enfermedad. Desde que Alphonse Laveran publicó la primera descripción del agente etiológico de la malaria en 1880, el diagnóstico de esta enfermedad se ha realizado mediante la observación de las distintas formas del parásito en el examen microscópico de extensiones de sangre periférica teñidas con diversos colorantes. Hoy día, 130 años después, esta técnica sigue siendo el método de referencia. Sin embargo, la laboriosidad que precisa el entrenamiento de un buen microscopista y la dificultad que entraña observar parasitemias bajas, ha impulsado el desarrollo de nuevas técnicas cuyas ventajas e inconvenientes se describen a continuación Métodos directos Están basados en la detección de antígenos parasitarios de Plasmodium. Los principales métodos disponibles para el diagnóstico del paludismo de menor a mayor coste son: 11

14 Diagnóstico microscópico Las técnicas microscópicas se basan en la observación de los estadios sanguíneos del parásito mediante tinción de su material genético. Para lograrlo, se debe realizar frotis y gota gruesa de sangre del paciente, obtenida preferentemente, poco antes del paroxismo palúdico, momento en el que estarán parasitados la mayor parte de los eritrocitos, y por tanto será mucho más fácil localizarlos. a) Preparación de las muestras: A partir de la muestra de sangre podemos realizar: 1) Extensión sanguínea Se deposita una gota de sangre sobre un portaobjetos limpio y desengrasado (para facilitar la adherencia) a 1 ó 2 cm de uno de los extremos. Se coloca el extremo de otro portaobjetos (de extremo esmerilado) sobre dicha gota formando un ángulo de 45º respecto al primero. Se espera a que la gota de sangre se extienda a lo largo del ángulo que forman los dos portaobjetos y se hace deslizar suave y rápidamente el segundo sobre el primero. Se deja secar bien la extensión al aire antes de fijarla. La película del frotis debe ser fina y progresiva. El grosor de la extensión variará con el ángulo formado por los dos portaobjetos. Así, si el ángulo es superior a 45º, el frotis será más corto y grueso, mientras que si es inferior a 45º, el frotis será más largo y fino. Ventajas : Bajo coste Fácil realización Permite diferenciar especies mediante análisis morfológico de los parásitos presentes Permite conocer el grado de parasitemia del paciente : técnica cuantitativa Inconvenientes : Escasa sensibilidad : No detecta parasitemias bajas, se requiere una parasitemia mínima de 50 parásitos/µl de sangre Requiere personal experto en diagnóstico microscópico de malaria Es díficil la detección de parasitemias mixtas 2) Gota gruesa Se deposita una gota de sangre en el centro de un portaobjetos limpio y desengrasado (para facilitar la adherencia). Con una esquina de otro portaobjetos se extiende excéntricamente en movimientos circulares hacia los bordes del portaobjetos para conseguir la desfibrinización de la sangre, hasta que el diámetro de la gota extendida sea de unos 2 cm. Se deja secar muy bien al aire. No se debe secar por calor, ya que los eritrocitos pueden fijarse sobre el cristal y no lisarse durante el proceso de tinción. El enlace: permite visualizar la forma de realizar una extensión sanguínea y una gota gruesa. 12

15 Ventajas : Bajo coste Fácil realización Permite analizar una mayor cantidad de sangre, facilitando la detección de parasitemias bajas y ahorra tiempo de examen microscópico Inconvenientes : Al estar los hematíes lisados, resulta más difícil la identificación de especie (salvo que se vean los gametocitos de P. falciparum) Requiere personal experto en diagnóstico microscópico de malaria Es díficil la detección de parasitemias mixtas b) Tinciones de sangre periférica: Son muchas las tinciones que se aplican al diagnóstico del paludismo, desde las convencionales de Giemsa, May-Grünwald-Giemsa, Field y Leishman, hasta las fluorescentes con naranja de acridina o el sistema QBC: Tinción de Giemsa: es la técnica diagnóstica de referencia y se utiliza tanto para teñir frotis como gota gruesa. La diferencia es que en el frotis se fija éste con metanol durante 5 minutos y se tiñe con colorante de Giemsa al 10% durante 10 minutos, mientras que en la gota gruesa no se fija con metanol para que se lisen los hematíes en el proceso de tinción con la solución acuosa del colorante (al 3% durante 30 minutos). La solución diluida de trabajo del colorante se prepara extemporáneamente en el momento de realizar la tinción, a partir de una solución de Giemsa comercial o solución stock en agua tamponada a ph 7.2 y sólo es apta durante un día. Se debe utilizar agua tamponada a este ph tanto en la dilución del colorante como en los lavados, debido a que, con otro ph, puede verse alterada la morfología del parásito, impidiendo la observación de las granulaciones de Schüffner, tan importantes para la diferenciación de especie. Esta tinción tiene buena sensibilidad (92-98%) y especificidad (85-99%). Tinción de Field: es una técnica de tinción sencilla y rápida, especialmente recomendada para laboratorios donde es necesaria una observación urgente, ya que permite efectuar las tinciones en muy poco tiempo. Presenta la ventaja de utilizar dos soluciones tintoriales: A y B, que no necesitan ser diluidas y que ni en la preparación de los colorantes ni para los lavados que se efectúan durante la tinción, es imprescindible el agua tamponada (por ello, no siempre permite observar el punteado de Schüffner presente en P. vivax y P. ovale). Los colorantes se almacenan separados y se utilizan durante varios días. La técnica de tinción sirve tanto para la gota gruesa como para el frotis. En la gota gruesa es donde tiene más utilidad la tinción de Field. En este caso, la deshemoglobinización de los hematíes se realiza por efecto de las soluciones acuosas que incorporan los colorantes. Aunque esta técnica de tinción es bastante usada en extensiones sanguíneas, se prefiere por calidad el método de Giemsa. La tinción se realiza del siguiente modo: a) Gota gruesa: - Se prepara la gota sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, como se ha expuesto anteriormente. - Se deja secar al aire. - Introducir el portaobjetos en el vaso que contiene la solución A de Field (mezcla de azures). Esperar 3 segundos, sacar y escurrir en el borde del vaso. - Enjuagar por introducción en un vaso con agua (no es imprescindible que sea tamponada, puede ser del grifo). Escurrir. - Introducir el portaobjetos en el vaso que contiene la solución B de Field (eosina amarilla). Mantener 3 segundos, sacar y escurrir en el borde del vaso. - Enjuagar por introducción en un vaso con agua, dejar escurrir verticalmente y secar a temperatura ambiente. 13

16 b) Frotis: - Se realiza la extensión y se deja secar al aire. - Se fija con metanol durante 1 minuto, se escurre el resto de metanol. - Se añade con una pipeta Pasteur solución B diluida a 1/5 con agua (que cubra la extensión). - A continuación por el otro extremo del portaobjetos, añadir solución A y mover el portaobjetos para que se mezclen ambas soluciones. - Lavar abundantemente con agua del grifo. - Se deja secar al aire. La coloración de Field tiene la particularidad de permitir cambiar el tono de la extensión, variando ligeramente el tiempo de exposición a sus colorantes, el A que contiene color azul y el B que aporta coloración rosa. En el enlace: y se puede visualizar la realización de la tinción de Field en gota gruesa y frotis, respectivamente. Otros métodos de tinción: Tinción con colorantes fluorescentes: Se utilizan soluciones de naranja de acridina (técnica descrita por Kawamoto) o purina de benzocarboxilo (BCP) en tampón ácido, que tiñen los ácidos nucleicos y permiten distinguir claramente la fluorescencia de los glóbulos rojos parasitados. Se usan únicamente para teñir frotis, ya que precisan de una fijación previa de la extensión sanguínea con metanol. Estas técnicas de tinción fluorescente tienen el inconveniente del elevado coste del reactivo y la exigencia de un microscopio con dicha luz para su lectura. o El sistema QBC (Quantitative Buffy Coat System, Becton Dickinson): Esta prueba en capilar teñido con naranja de acridina se basa en la tinción del ADN (en rojo) y ARN (en verde) de los parásitos cuando los observamos con un microscopio de luz ultravioleta. Se utiliza la concentración por gradiente de densidad de los eritrocitos parasitados mediante la centrifugación de un capilar impregnado de heparina y naranja de acridina, al que se le añade un flotador de plástico que comprime el buffy coat, permitiendo la observación de la capa fina que queda entre las paredes del flotador y las del interior del capilar. Se necesita por tanto, una microcentrífuga de capilares, un objetivo especial para poder observar directamente sobre los capilares, y un sistema de epifluorescencia con lente especial, lo que encarece la técnica sin aportar mucho al frotis y gota gruesa (sensibilidad del 88-98% y especificidad del 58-90%). c) Examen microscópico: Durante su presencia en sangre, podemos observar distintas formas morfológicas de Plasmodium: trofozoítos (que pueden ser jóvenes, en desarrollo o maduros), esquizontes, macrogametocitos y microgametocitos. Para poder detectar la parasitosis y determinar la especie de Plasmodium infectante, es imprescindible que cada una de estas formas parasitarias sea reconocida por los profesionales del laboratorio clínico responsables de realizar el diagnóstico. En las siguientes figuras (Fig. 5-8), podemos observar las características que presentan las formas parasitarias de Plasmodium en la extensión fina y en la gota gruesa teñidas con Giemsa y en la Tabla 3. se detallan las características diferenciales de las especies de Plasmodium en el frotis de sangre periférica. 14

17 Figura 5. Aspecto de las formas parasitarias de P. falciparum 15

18 Figura 6. Aspecto de las formas parasitarias de P. malariae 16

19 Figura 7. Aspecto de las formas parasitarias de P. vivax 17

20 Figura 8. Aspecto de las formas parasitarias de P. ovale 18

21 Distribución geográfica Tipo de hematíe que parasita Tamaño del hematíe infectado P. falciparum P. vivax P. ovale P. malariae P. knowlesi * Tropical, zonas templadas Hematíes tanto jóvenes como maduros Normal Tropical, zonas templadas, ausente en África Occidental Hematíes jóvenes (reticulocitos) Aumentado Tropical, endémico en África Occidental, presente en Filipinas, Indonesia y Papua Nueva Guinea Hematíes jóvenes (reticulocitos) Aumentado. Eritrocitos infectados son ovales y/o fimbriados (forma irregular de los bordes) Tropical Hematíes maduros Normal o más pequeño Sur y sudeste asiático * Hematíes de todas las edades Normal Formas accolé Trofozoítos Anillos jóvenes pequeños, finos, algunos con puntos dobles de cromatina. Hematíes con infección múltiple (varios anillos). Formas periféricas frecuentes: formas accolé. Trofozoíto maduro: Anillo agrandado y ligeramente irregular Anillo grueso ameboide, a menudo irregular, 1 punto de cromatina. Trofozoíto maduro: irregular, ameboide Anillo grueso, 1 punto de cromatina. Trofozoíto maduro: Redondeado, compacto con gran masa cromatínica Anillo grueso, 1 punto de cromatina. Trofozoíto maduro: Redondeado, compacto, con cromatina central y forma de banda Trofozoítos no ameboides Formas en banda No No No Si Si 19

22 P. falciparum P. vivax P. ovale P. malariae P. knowlesi * Nº de merozoítos del esquizonte Media (rango) Gametocitos 24 (8-32) Alargados o en forma de media luna o banana. Masculino: rojizo con cromatina difusa; Femenino: azulado con cromatina compacta 16 (14-24) ** dispuestos irregularmente Ovalados o redondeados. Masculino: con cromatina difusa; Femenino: con cromatina excéntrica compacta 8 (6-14) dispuestos irregularmente Ovalados o redondeados. Masculino: con cromatina difusa; Femenino: con cromatina excéntrica compacta 8 (6-12) a menudo dispuestos en forma de roseta Ovalados o redondeados. Masculino: con cromatina difusa; Femenino: con cromatina excéntrica compacta 10 (8-16) Ovalados o redondeados. Masculino: con cromatina difusa; Femenino: con cromatina excéntrica compacta Pigmento Negro, basto e intenso en los gametocitos Pardo dorado, poco visible Pardo oscuro, visible, granuloso Pardo oscuro, basto, visible, generalmente en el centro del esquizonte Pardo oscuro Estadios encontrados en sangre periférica Anillos y/o gametocitos. Los esquizontes no se observan en sangre periférica excepto en infecciones graves Todos los estadios. Amplia gama de fases visibles en el frotis Todos los estadios Generalmente no se ve gran variedad de estadios. Suelen observarse pocas formas anulares o gametocitos Parasitemia Puede ser muy alta Generalmente <2% Generalmente <2% Generalmente muy baja Puede ser alta Recidivas desde el hígado No Si Si No No Período de incubación 8-12 días días (ocasionalmente meses) días (ocasionalmente días) días (ocasionalmente meses a años) Desconocido en humanos infectados de forma natural Duración del ciclo intraeritrocítico 48 horas 48 horas 48 horas 72 horas 24 horas? Desconocido en humanos infectados de forma natural 20

23 Punteado de Schüffner No hay. Ocasionalment e puntos de Maurer (moteado grueso e irregular basófilo intenso azulado) Frecuente. Gránulos pequeños, redondos, rosados o rojizos distribuidos de forma uniforme en todo el eritrocito. Presente en todos los estadios excepto formas anulares iniciales Siempre presente en todos los estadios excepto formas anulares iniciales No hay, raramente se observan pequeños puntos o manchas de Ziemann? * La infección por P. knowlesi debe considerarse siempre en pacientes con manifestaciones de malaria severa inicialmente diagnosticada por microscopía como P. malariae y antecedente de viaje a zonas boscosas del sudeste asiático habitadas por macacos, incluidos los viajes a las zonas donde la malaria no es endémica ** La identificación de un esquizonte con más de 12 merozoítos en un frotis de sangre periférica es una clave diagnóstica para P. vivax. En general, los esquizontes de P. falciparum son raramente vistos en las extensiones sanguíneas; generalmente están ausentes en la circulación periférica excepto en los casos graves con hiperparasitemias. Tabla 3. Características diferenciales de las especies productoras de malaria En el enlace: están disponibles casos clínicos con autoevaluaciones para poner en práctica las claves diagnósticas de diferenciación de especies de Plasmodium. d) Cálculo de la parasitemia: La parasitemia es un factor determinante en la selección del tratamiento y en la posterior evaluación de la respuesta terapeútica y debería estar presente en el informe analítico junto a la identificación del parásito. La parasitemia se puede expresar como porcentaje (%) o bien contando en paralelo el número de parásitos en relación con el número de leucocitos (WBC) o bien de hematíes (RBC) y expresando el resultado como numero de parásitos/µl: Nº de parasitos contados x Nº de WBC o de RBC/µL Nº de WBC o de RBC contados = Nº de parásitos /µl Si un hematíe está infectado por múltiples parásitos sólo debe contarse como un hematíe parasitado WBC: leucocitos, RBC: eritrocitos Técnicas inmunocromatográficas Son pruebas de diagnóstico rápido (Rapid Diagnostic Tests-RDTs) de detección de antígenos de Plasmodium basadas en la migración de líquidos a través de la superficie de una membrana de nitrocelulosa (dipstick). Todas están basadas en la captura de un antígeno parasitario a partir de una muestra de sangre periférica que ha sido lisada, usando anticuerpos monoclonales preparados contra dicho antígeno o diferentes familias antigénicas, conjugando a ambos un liposoma que contiene selenio como colorante o partículas de oro coloidal en fase móvil. Posteriormente se aplica un segundo o tercer anticuerpo monoclonal a una tira de nitrocelulosa que actúa como fase inmóvil. La migración del complejo antígeno-anticuerpo en la fase móvil a través de la tira facilita que sea capturado el antígeno marcado por el anticuerpo monoclonal que está situado en la fase inmóvil. Esta unión produce una coloración en forma de línea en la tira (Figuras. 9-12). 21

24 Figura 9. Esquema de una técnica inmunocromatográfica rápida para la detección de antígeno parasitario de Plasmodium. Adaptación de: Ventajas : Rápidas (resultado en 20 minutos) Fáciles de realizar Reproducibles Se requiere poca sangre No precisan microscopio Inconvenientes : Alto coste La sensibilidad decrece al 50-70% en parasitemias bajas (<100 parásitos/µl) Pueden dar falsos negativos en parasitemias muy altas por efecto prozona y con ciertas poblaciones parasitarias que poseen una expresión muy baja de la proteína-2 rica en histidina (HRP- 2) sí se utilizan los métodos basados en su detección Se observan falsos positivos en presencia de factor reumatoide Son técnicas cualitativas, no cuantitativas, no miden el grado de parasitemia (que se relaciona con la gravedad) por lo que impiden al clínico adoptar las medidas terapeúticas oportunas con la consiguiente morbilidad y mortalidad que ello entraña Aunque la sensibilidad y especificidad de estas pruebas es del 90-96%, la mayoría de ellas son específicas para detectar P. falciparum o en algún caso, P. vivax, por lo que no son útiles para el diagnóstico de P. ovale y P. malariae ni para el diagnóstico de parasitemias mixtas. Existen dos tipos de pruebas rápidas inmunocromatográficas según el antígeno principal detectado: a) Detección de la proteína rica en histidina 2 (HRP-2): es un antígeno circulante secretado por P. falciparum (P. f.) a la sangre. Algunos kits añaden una segunda banda para detectar aldolasa, una enzima producida por todos los plasmodios. En este caso la prueba utiliza dos anticuerpos inmovilizados en la tira reactiva: uno, específico para el antígeno del P. f. (P.f. HRP-2), y otro, específico para el antígeno común. Las pruebas disponibles más comunes son: ParaSight F (Becton Dickinson) PaluQuick (ICT Diagnostics) ICT Malaria P.f. (ICT Diagnostics) PaluQuick_kombi (AMRAD-ICT) MalaQuick (Stanby Diagnostics) BinaxNow Malaria (BinaxInc.) 22

25 Figura 10. Prueba rápida ICT Malaria P. f. Figura 11. Prueba rápida BinaxNow Este tipo de pruebas no se puede utilizar para controlar el tratamiento. El antígeno HRP-2 puede persistir y la prueba mantenerse positiva hasta 4 semanas después de un tratamiento satisfactorio, a pesar de la curación clínica y microscópica. b) Detección de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH): producida por P. falciparum (PfLDH). Estos kits suelen incorporar también la LDH producida por todas las especies de Plasmodium (PLDH). No hay reacción cruzada con la LDH humana. La prueba es positiva cuando en la sangre hay parásitos vivos, por lo tanto es útil para verificar la eficacia del tratamiento. Se realizan varias determinaciones: a los 2 días y de nuevo a los 4-5 días de haber comenzado el tratamiento y se comparan los resultados con los obtenidos antes del tratamiento. Si tras 5-7 días permanece la prueba positiva, debe considerarse la posibilidad de que se trate de una cepa resistente al tratamiento. El nombre comercial es OptiMAL-IT (DiaMed). 23

26 Figura 12. Prueba rápida OptiMAL: fundamento y resultados posibles Diagnóstico molecular Son pruebas diagnósticas basadas en el uso de la técnica reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante amplificación sencilla o múltiple del ADN, bien sea de genes que codifican para antígenos o proteínas concretas de P. falciparum o en amplificación del gen ADNr. Los métodos más utilizados son los basados en la subunidad pequeña (18s) del ADNr ribosómico. La secuencia de bases de este ADNr es muy similar en todos los organismos aunque hay zonas cuya secuencia de bases es específica de cada plasmodio. Esta dualidad secuencias específicas/secuencias comunes permite el diseño de oligonucleótidos (primers) con diversos niveles de especificidad (primers universales, con especificidad de género, de especie, etc.) y usarlos en un sistema denominado Multiplex PCR o detección de las cuatro especies en un único proceso de amplificación. Este sistema consiste en una primera amplificación para detectar al nivel de género (Plasmodium) y una Multiplex PCR a partir de ésta que nos va a permitir diferenciar en un gel de agarosa los fragmentos correspondientes para cada especie de plasmodio. Actualmente es el método más sensible de detección (permite detectar parasitemias bajas (5 o menos parásitos/µl de sangre) y más específico (en torno al 100%), identifica parasitaciones mixtas y diferencia las especies, por lo que es útil para el control del tratamiento. Al ser una técnica potencialmente cuantitativa, permite controlar la eficacia del tratamiento al detectar las resistencias a antipalúdicos. Las desventajas radican en el coste y la infraestructura necesaria (equipamiento y personal especializado) y el tiempo en que se emite el diagnóstico, aunque éste queda mitigado en laboratorios de referencia, por el amplio número de muestras que se puede analizar al mismo tiempo. Su uso está en expansión, habiéndose desarrollado técnicas de PCR en tiempo real que minimizan el retraso diagnóstico. 24