Evaluación de la actividad insecticida de formulados a base de Metarhizium anisopliae en larvas de Spodoptera frugiperda.

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1 Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016) 4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016 Memorias Evaluación de la actividad insecticida de formulados a base de Metarhizium anisopliae en larvas de Spodoptera frugiperda. Adalid Ramírez Casarrubias (Becario) Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas de la UAGro Programa Academia Mexicana de Ciencias adalid-raca@hotmail.com Área II. Biotecnología y Ciencias Agropecuarias Dr. Víctor Manuel Hernández Velázquez (Asesor) Profesor- Investigador del Centro de Investigación en Biotecnología, Universidad Autónoma del Estado de Morelos vmanuelh@uaem.mx Dra. Karla Tatiana Murillo Alonso (Asesor) Estancia Posdoctoral. Laboratorio de Micología Básica, Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México. Resumen El maíz es uno de los cultivos más importante a nivel mundial, pero es afectado por insectos barrenadores como Spodoptera frugiperda que provoca pérdidas superiores al 60% y los métodos convencionales para su control son principalmente los insecticidas químicos, sin embargo este tipo de control ha generado problemas de salud al hombre, contaminación ambiental y la resistencia de los insectos hacia estos, por lo que el control biológico es una alternativa viable, ya que no afecta la salud de hombre, ni al me bacterias, virus, nematodos y hongos entomopatógenos. Se han empleado diferentes especies de hongos entomopatógenos destacando Metarhizium anisopliae ya que se ha demostrado que S. frugiperda es susceptible a este hongo. Sin embargo la utilización de hongos entomopatógenos como agentes de control biológico presenta una limitante, son susceptibles a condiciones ambientales: la luz ultravioleta y temperaturas superiores a 35ºC. Por ello, en este trabajo se desarrollaron y evaluaron tres formulaciones (A, AC y BB) que contienen como principio activo conidios de M. anisopliae de la cepa EH 473/4 a una concentración de 1x conidios y como componentes de formulación

2 4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016 aceite vegetal, emulsificantes, agente humectante y agente adyuvante. El mejor formulado es el BB, debido a que ocasionó una mortalidad del 100% en comparación de los demás formulados a los siete días del bioensayo, todos los formulados ocasionaron mortalidad en larvas de primer estadio de S. frugiperda. La formulación BB, contiene la cantidad adecuada de aceite vegetal y emulsificantes, ya que actuó de manera eficiente; mientras que las formulaciones A y AC, pueden tener algún componente o proporción que no ayude al óptimo funcionamiento. Palabras Clave: formulación, Metarhizium anisopliae, control biológico, Spodoptera frugiperda. Introducción El maíz es uno de los cultivos más importante a nivel mundial, empleado en la alimentación humana y animal, se destina para su producción una superficie aproximada 140,11 millones de hectáreas a nivel mundial. Sus granos constituyen un alimento energético típico, debido a que son ricos en carbohidratos, principalmente almidón. También se emplea como forraje en la elaboración de ensilados y derivados como aceite, isoglucosa, elaboración de papel, materiales de construcción, textiles, pinturas, explosivos, productos farmacéuticos, cerámicos entre otros. El maíz es afectado por diversos insectos plaga, principalmente por barrenadores como S. frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) también llamado gusano cogollero; este insecto es polífago y de amplia distribución geográfica. Las larvas son muy activas y atacan la planta en la etapa de plántulas hasta la floración prefiriendo hojas y brotes tiernos especialmente los cogollos según el momento de su desarrollo, y producen daños directos cuando se alimentan de los granos de la espiga ocasionando grandes pérdidas económicasy para su control se emplean insecticidas químicos, sin embargo el mal uso de estos ha ocasionado serios problemas de contaminación ambiental y la resistencia de este insecto hacía estos insecticidas, por lo anterior el control biológico se presenta como una alternativa viable ya que se emplean microorganismos entomopatógenos como hongos que son capaces de causar la enfermedad y muerte de dichos insectos (Mitchell et al., 1991; Willink et al., 1993; Pimentel, 1995; Carvalho et al., 2010). Se han empleado diferentes especies de hongos entomopatogenos como: B. bassiana, I. fumosorosea, L. lecanii, N. rileyi y M. anisopliae para el control de S frugiperda, destacando ampliamente M. anisopliae ya que se ha demostrado que S. frugiperda es susceptible a este hongo en los estados biológicos de huevo y larva, con porcentajes de mortalidad del 100% y

3 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016) valores de TL50 de 2.5 a 2.9 días en huevo y 1.3 a 3.1 días en larvas, a la concentración de 1x10 8 conidias por ml (Lezema et al., 1996).La utilización de hongos entomopatógenos como agentes de control biológico presenta una limitante, por ser microorganismos lábiles a las condiciones ambientales: la luz ultravioleta y temperaturas superiores a 35ºC. Por ello, es importante acondicionar los microorganismos para su óptimo funcionamiento, mediante una adecuada formulación: que no limite su vialidad y virulencia; que estabilice a los conidios para ser almacenados, envasados y distribuidos; y que facilite su uso y aplicación (Ravensberg, 2011; Murillo, 2015). Para la formulación de hongos entomopatógenos se emplean aceites de origen vegetal y derivados del petróleo que son intrínsecamente compatibles, también son ingredientes esenciales para realizar formulaciones liquidas y tienen la ventaja de ser aceptables para los sistemas de producción orgánica; los aceites parafínicos se evaporan rápidamente y dejan menos residuos (Bateman, 1997; Ibrahim et al., 1999; Wraight et al., 2001). El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de tres formulados de M. anisopliae sobre larvas de S. frujiperda, ya que en ocasiones al desarrollar una formulación, se puede inhabilitar la función del microorganismo, dependiendo la composición de la formulación y las condiciones en la cuales fue desarrollada. Materiales y métodos Cría de Spodoptera frugiperda En el laboratorio de control biológico del Centro de Investigación en Biotecnología se tiene una colonia de S. frugiperda. La crianza de adultos se realiza en recipientes forrados impidiendo la entrada de luz, su alimentación es a base de una solución azucarada al 10% (Agua destilada: azúcar). Cada tercer día se cambian de recipiente para la obtención de huevecillos estos se extraen recortando el área del papel donde fueron ovipocitados, los huevecillos se dejan eclosionar en cajas de Petri. Una vez eclosionados todo su estado larvario se les alimenta con dieta artificial (Greene et al.,1976). Aislamiento fúngico Se utilizó la cepa EH-473/4 de M. anisopliae proveniente de glicerol; para reactivarla se inoculó en cajas Petri con medio de cultivo Agar Dextrosa Papa (PDA) y posteriormente se propago en arroz, para poder obtener la cantidad necesaria para el desarrollo de las formulaciones.

4 4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016 Formulación Se realizaron tres formulaciones, la formulación A esta constituida de: Aceite vegetal + Emulsificantes + Agente humectante, la formulación AC : Aceite vegetal + Emulsificantes + Agente humectante + Agente adyuvante; la formulación BB : Aceite vegetal + Emulsificantes. Estas formulaciones contienen 1x conidios y se realizaron en porciones de 10g (p/p) a 5000 rpm, con tres repeticiones. Viabilidad Se tomó una muestra de 0.1 ml de cada formulación, se suspendió en 10 ml de agua con Tween 80 al 0.01%, se tomó 0.1 ml y se dispersó en placas de PDA, las cajas fueron incubadas a 25± 2ºC durante a los 24 horas se contabilizó el número de conidios que desarrollaron tubo germinativo, utilizando el microscopio óptico con el objetivo 40X. Evaluación de la funcionalidad de la formulación en laboratorio Para evaluar la funcionalidad de las formulaciones de M. anisopliae, se realizaron bioensayos sobre larvas de primer estadio de S. frugiperda en condiciones de laboratorio. Se utilizó un diseño completamente al azar, con cuatro tratamientos y tres repeticiones independientes. Los tratamientos evaluados fueron: T1: agua destilada con Tween 20 al 0.05 %, T2: 10% Formulación A + 90% agua destilada, T3: 10% Formulación AC+ 90% agua destilada y T4: 10% Formulación BB+ 90% agua destilada. Se llevó a cabo la desinfección de las ninfas por inmersión: agua destilada estéril (30 s), solución de hipoclorito de sodio al 0.5% (30 s) y agua estéril (30 s X 2), los insectos fueron colocados en caja Petri estéril con papel filtro (previamente esterilizado) hasta colocar a los insectos en la unidad experimental. Posteriormente se realizaron los bioensayos sumergiendo cuadros de 1cm 2 de hojas de maíz en los diferentes tratamientos durante 30 segundos como se muestra en la figura 1. La unidad experimental consistió de 12 cuadros de 1cm 2 colocados en 12 pozos con 1.5 ml de agar, posteriormente se colocó una larva por pozo. Las unidades experimentales se colocarán a una temperatura de 27 C ± 2 C y una humedad relativa de 90%. Se monitorea el bioensayo con ayuda del estereoscopio cada 24 horas durante 10

5 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016) días, anotando el día que el hongo comienza a producir micelio en la superficie y el día de la muerte del insecto. A B Figura 1. Bioensayo. A) Inmersión de las hojas de maíz en los formulados, B) Unidades experimentales del bioensayos. Resultados Las tres formulaciones presentaron porcentajes de germinación mayores al 95% a las 24 horas, siendo estadísticamente iguales entre ellas, el desarrollo de los conidios se muestra en la figura 2. El análisis de varianza del porcentaje de mortalidad mostró diferencias significativas para los tratamientos evaluados a los tres, cinco y siete días. Al realizar la comparación de medias, al día tres, el formulado BB ocasionó una mortalidad del 77.77% siendo estadísticamente diferentes con respecto a la mortalidad ocasionada por los formulados A y AC como se observa en la Figura 3 A. Al día cinco, los formulados A, AC y BB ocasionaron mortalidades del 25, 17 y 97% respectivamente, siendo estadísticamente diferentes entre ellos como se observa en la Figura 3 B. Al día siete, los formulados A, AC y BB ocasionaron mortalidades del 78, 47 y 100% respectivamente, siendo estadísticamente diferentes entre ellos como se observa en la Figura 3 C.

6 4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016 A B C Figura 2. A) Conidios de M. anisopliae a las 12 h con tubo germinativo; B) Conidios germinados a las 24 h; C) UFC de M. anisopliae a 96 h. A continuación se muestran en imágenes del seguimiento del bioensayo, las larvas se alimentaron de las hojas de maíz durante todo el bioensayo, las larvas control terminaron con la hoja sin presentar signos de infección como se muestra en la figura 4 A; en la figura 4 B, se muestra las larvas al tercer día del bioensayo que se alimentan de la hoja tratadas con el formulado BB de M. anisopliae, estas presentaron escasa movilidad y oscurecimiento ; en la figura 4 C se muestra que las larvas están cubierta de micelio de M. anisopliae.

7 % de Mortalidad % de Mortalidad % de Mortalidad Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016) A) Día 3 a b b A AC BB Formulaciones B) Día 5 a b c A AC BB Formulaciones b C) Día 7 a 60 c A AC BB Formulaciones Figura 3. Porcentaje de Mortalidad (medias ± error estándar) en larvas de primer estadio de S. frugiperda por el efecto de diferentes formulaciones, a)mortalidad al día tres, b)al día cinco, c) Al día siete. *Letras distintas indican diferencias significativas de acuerdo a la prueba de Tukey (P 0.05).

8 4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016 A B C Figura 4.A) Larva control B) larva a la que se le aplicó el formulado BB, escasa movilidad y oscurecimiento, C) Micosis ocasionada por el formulado BB de M. anisopliae en larvas de S. frugiperda. Discusión y conclusiones La formulación es probablemente el obstáculo técnico más significativo que superar en el desarrollo de agentes de control biológico debido a que son microorganismos; una formulación adecuada debe ser capaz de satisfacer los requisitos de eficacia, vida útil, así como un manejo seguro y fácil (Wraight et al., 2001). Glare y colaboradores (2012), realizaron una estimación global de mercado para el 2014 de bioinsecticidas; los micoinsecticidas constituyen una pequeña fracción, el 8.75%. Por lo que desarrollar formulaciones de cualquier tipo a base de microorganismos es de gran impacto en la agricultura, ya que se permitirá que los agricultores tengan a su disposición bioinsecticidas para impulsar la agricultura orgánica. Para usar hongos entomopatógenos como agentes de control microbiano, es necesario tener una viabilidad > 80% (Goettel e Inglis, 1997; Jenkins, 1998). En este trabajo se evaluó la germinación conidial y se obtuvo porcentajes de germinación mayores al 95%, el porcentaje de germinación no se vio afectado en ninguna formulación. Tal como lo han demostrado Alves y colaboradores (2002), la mayoría de los emulsificantes, dispersantes, aceites minerales y vegetales, no causan efectos adversos en la germinación de conidios de M. anisopliae.

9 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016) El mejor formulado es el BB, esto se atribuye que fue el que ocasionó una mortalidad del 100% en comparación de los demás formulados a los siete días del bioensayo, todos los formulados ocasionaron mortalidad en larvas de primer estadio de S. frugiperda, a pesar que la composición de los formulados no fue la misma. La formulación BB, contiene la cantidad adecuada de aceite vegetal y emulsificantes, ya que actuó de manera eficiente; mientras que las formulaciones A y AC, pueden tener algún componente o proporción que no ayude al óptimo funcionamiento. Agradecimientos A la Academia Mexicana de Ciencias por otorgarme la beca para realizar el verano de Investigación Científica en el Centro de Investigación en Biotecnología de la UAEM, Al Dr. Víctor Manuel Hernández Velázquez por aceptarme en su laboratorio de Control biológico y a la Dra. Karla Tatiana Murillo Alonso por asesorarme en el trascurso de la estancia. Referencias Alves, R. T., Bateman, R. P., Gunn, J., Prior, C. y Leather S. R. (2002). Effects of different formulations on viability and medium-term storage of Metarhizium anisopliae conidia. Neotropical Entomology, 31(1): Bateman, R. (1997). Methods of applications of microbial pesticide formulations for the control of grasshoppers and locusts. Memoirs of the Entomological Society of Canada, 171: Carvalho, E.V., A.H. Gonçalves, F.S. Afférri, M.A. Dott, e J.M. Peluzio. 2010a. Influencia da lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda J.E. Smith), sobre híbridos de milho. no sul do Tocantins-Brasil. Revista Verde de Agroecologia e Desenvolvimento Sustentável 5: Glare T, Caradus J, Gelernter W, Jackson T, Keyhani N, Köhl J, Marrone P, Morin L, Stewart A Have biopesticides come of age? Trends in Biotechnology, 30(5): Goettel, M. S., & Inglis, G. D. (1997). Fungi: Hyphomycetes. In Lawrence A. Lacey (Ed.), manual of techniques in insect pathology (pp ). San Diego, CA: Academic Press. Greene, G.L.; Lepla, N.C.; Dickerson, W.A Velvetbean caterpillar: a rearing procedure and artificial medium. J. Econ. Entom. Lanham. 69(4): Ibrahim, L., Butt, T. M., Beckett, A. y Clark, S. J. (1999). Germination of oil-formulated conidia of the insect-pathogen, Metarhizium anisopliae. Mycological Research, 103:

10 4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016 Jenkins, N. E., Heviefo, G., Langewald, J., Cherry, A. J., & Lower C. J. (1998). Development of mass production technology for aerial conidia for use as mycopesticides. Biocontrol News and Information, 19, Lezema G.R., R.R. Alatorre, L.F. Bojalil, O.J. Molina, V.M. Arenas, R.M. González, D.O. Rebolledo Virulence of live entomopathogenic fungi (Hyphomycetes) against Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: noctuidae) eggs and neonate larvae. Vedalia. 3: Mitchell, E. R., J. N. Mcneil, J. K. Westbrook, J. F. Silvain, B. Lalanne-Cassou, R. B. Mitchell, E. R., J. N. Mcneil, J. K. Westbrook, J. F. Silvain, B. Lalanne-Cassou, R. B. Chalfant, S.D. Pair, V. H. Waddill, A. Sotomayor-Ríos & F. I. Proshold Seasonal periodicity of fall armyworm, (Lep.:Noctuidae) in the Caribbean Basin and Northward to Canada. Journal of Entomological Science 26 (1): Murillo A. K. T Producción y Formulación de conidios de Isaria fumosorosea cepa EH- 511/3 para el control Bemisia tabaci. Tesis de doctorado. Universidad Autónoma del Estado de Morelos. Pimentel, D Amount of perticide reaching target pests: Environmental impacts and ethics. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 8: Pucheta, D.M., Flores, M. A., Rodríguez, N.S. y de la Torre, M Mecanismo de acción de los hongos entomopatógenos. Interciencia 31(12): Ravensberg. J.W. (2011). A Roadmap to the successful development and commercialization of microbial pest control, products for control of arthropods. Springer Science, business Media. London New York, 383 p. Rojas, J.C., A. Virgen, and E. A. Malo Seasonal and nocturnal flight activity of Spodoptera frugiperda males (Lepidoptera: Noctuidae) monitored by pheromone traps in the coast of Chiapas, México. Fla. Entomol. 87: Willink, E., V.M. Osores y M.A. Costilla Daños, perdidas y niveles de daño económico por Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) en maíz. Rev. Ind. y Agric. de Tucumán 70(1-2): Wraight, S. P., Jackson, M. A y Kock, S. L. (2001). Production, stabilization and formulation of fungal biocontrol agents. In: Fungi as biocontrol agents: progress, problems and potential; Butt, T. M., Jacson, C. y Magan, N.(eds), CABI International, Wallingford; p.