OBTENCION DE PLANTAS A PARTIR DE EMBRIONES SOMATICOS DE QUERCUS SUBER L.

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1 CONGRESO FORESTAL ESPAÑOL - Lourizán Ponencias y comunicaciones. Tomo II 337 OBTENCION DE PLANTAS A PARTIR DE EMBRIONES SOMATICOS DE QUERCUS SUBER L. B. Fernández Guijarro; C. Celestino & M. Toribio Subdirección General de Investigación Agraria. Consejería de Economía. Comunidad de Madrid. Apdo ALCALA DE HENARES (España) Resumen En esta comunicación se ha pretendido establecer un protocolo para la regeneración de plantas de alcornoque vía embriogénesis somática. Los embriones somáticos se obtuvieron a partir de hojas de plantas de dos meses y de fragmentos cotiledonares de bellotas maduras, cultivados en tres medios consecutivos con concentraciones decrecientes de reguladores del crecimiento. Para la germinación, se sometió a los embriones a distintos tratamientos, de entre los cuales se escogieron la desecación y el cultivo en medio con bajo contenido en sales por proporcionar los mejores resultados. P.C.: Quercus suber, Embriogénesis somática, Regeneración, Medios de cultivo Abstract This paper gives a procedure to regenerate plants of cork oak through somatic embryogenesis. The somatic embryos were obtained in leaves from young seedlings and cotyledonary fragments from mature acorns of cork oak. The explants were cultured in three stage process in wich BA and NAA concentration were decreasing. Different methods were used to germinate the embryos. Dessication and culture in low salt concentration medium were chosen to give the best results. K.W.: adventive embryogenesis, cork oak, secondary embryogenesis, culture media, plant regeneration INTRODUCCION El incremento de la demanda de corcho y la escasa regeneración del alcornoque como consecuencia del aprovechamiento combinado de tipo forestal, agrícola y ganadero de las dehesas, justifican la plantación intensiva con material mejorado de esta especie. Las corrientes actuales, dentro del campo de la mejora forestal, ponen especial énfasis en técnicas combinadas de mejora y clonación (PARK & BONGA, 1992). Al ser el alcornoque una especie claramente recalcitrante a su propagación vegetativa, la obtención de embriogénesis somática, sin duda el método más eficiente de propagación vegetativa, abre un prometedor futuro en la regeneración de individuos sobresalientes de Quercus suber.

2 338 MATERIAL Y METODOS,. Obtención de líneas embriogénicas Se partió de hojas apicales de plantas de cuatro meses de edad procedentes de semilla, que se esterilizaron en una disolución al 10% de NaOCl (7% de cloro activo) y unas gotas de Tween 20 durante 15 min, y de fragmentos cotiledonares de bellotas maduras que se esterilizaron en una disolución al 25 % de NaOCl y unas gotas de Tween 20 durante 15 mino Los explantos se cultivaron en distintas condiciones, siendo las variaciones principales el cultivo con fotoperiodo o en oscuridad y la composición del medio de cultivo (formulación de macronutrientes y tipo y concentración de hormonas vegetales). Las líneas embriogénicas se mantuvieron por embriogénesis repetitiva. Los subcultivos se hicieron mensualmente en un medio con macronutrientes de SH (SCHENK & HILDEBRANDT, 1972), micronutrientes, Fe-EDTA, cofactores, inositol y sacarosa de MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), agar 6 gil Y sin reguladores del crecimiento. Los cultivos se situaron en cámara de cultivo a 25 ± 1 oc y 16 h de fotoperiodo. Germinación de embriones Se aislaron embriones dicotiledonares bien conformados y se cultivaron en medios con distintas formulaciones de macronutrientes. A los 40 días de cultivo se observó la respuesta morfogénica según el siguiente criterio: embriones sin respuesta (NR); embriones que mostraban embriogénesis adventicia hubieran germinado o no (AE); embriones con elongación de raíz o tallo (R/T); embriones con germinación coordinada de raíz y tallo (CG). Con los datos obtenidos se estableció un periodo de maduración de 20 días (periodo de tiempo necesario para que los embriones crezcan y adquieran un color opaco blancoamarillento). Los embriones maduros se sometieron, de forma aislada o combinada, a los siguientes tratamientos: 30 o 15 días a 4 oc y oscuridad; desecación al aire durante una semana; maduración en un medio con bajo contenido en sales (macronutrientes de GAMBORG, 1966) y germinación en un medio rico (macronutrientes de SH); germinación en un medio con giberalinas (30 J.'M de GA); germinación en un medio con bencilaminopurina (0.5 y 1 J.'M de BA).. La respuesta morfogénica de los embriones se midió a los 30 días despues de situarlos en el medio de germinación. Se utilizó una media de 30 embriones por tratamiento (le). Los datos se analizaron por el test de independencia de Chi-cuadrado. RESULTADOS Y DISCUSION Inducción de embriogénesis somática Entre los reguladores de crecimiento ensayados, el IBA (ácido indolbutírico) no fu~ efectivo, el 2,4-D (ácido 2,4-Diclorofenoxiacético) indujo callo no embriogénico y la quinetina más IBA indujo callo y raíces en los cotiledones. Las líneas embriogénicas se obtuvieron en un medio con macronutrientes de G y el resto de los componentes de MS con la siguiente secuencia: 30 días en oscuridad en el medio con 10 J.'M de BA y 10 J.'M de NAA (ácido naftalenacético); 30 días en condiciones de fotoperiodo en el medio con 0.5 J.'M de BA y 0.5 J.'M de NAA. Despues los explantos se sub cultivaron en el medio sin reguladores de crecimiento y en condiciones de fotoperiodo. A los 120 días desde el inicio del cultivo aparecieron las primeras estructuras embriogénicas. El porcentaje de inducción fué muy bajo, un 1.3% del callo formado en los cotiledones fué embriogénico y un 5.9 % en hojas, porcentaje muy parecido al obtenido por EL MAÁTAOUI y ESPAGNAC (1987) en segmento nodal de alcornoque.

3 339 Genninación de los embriones La germinación de embriones aislados cultivados sin ningún tratamiento específico fué nula o muy escasa (3.7% CG y 3.7% R/T en 1/2 MS). Aunque el tratamiento en frio de los embriones somáticos ha resultado ser infectivo en algunos casos (GINGAS & LINEBERGER, 1989), nuestros resultados (Tabla 1) indicaron que en el caso del alcornoque un periodo de frio es necesario para romper la dormición, aunque no es suficiente para cambiar el "patron" de embriogénesis repetitiva de los embriones hacia la germinación de los mismos en un porcentaje satisfactorio. La adición de giberelinas al medio de germinación, después del tratamiento en frio, no aumentó la germinación coordinada. Igualmente, la adición de BA no aumenta la germinación de manera significativa respecto al blanco en ningún caso, además de tener un efecto negativo en cuanto a la conformación de los brotes. Los mejores resultados se obtuvieron con los tratamientos de desecación al aire durante 7 días, previo al periodo de 30 días en frio, el cual se confirma como tratamiento necesario para la obtención de altos porcentajes de germinación (Tabla 2). Se obtienen los mismos porcentajes en el caso de realizar la maduración de los embriones en un medio pobre en sales (1/2 G) y la germinación, despues de un periodo de 30 días en frio, en un medio rico (SH) (Tabla 3). CONCLUSIONES La obtención de embriones somáticos de alcornoque a partir de tejidos tan variados como embriones inmaduros (BUENO et al., 1992), segmentos nodales (EL MAÁTAOUI & ESPAGNAC, 1987) y hojas, demuestran la viabilidad de su propagación vía embriogénesis somática. Por otra parte, el haber conseguido embriogénesis en tejidos de hoja de árbol maduro en algunas especies como Quercus ilex (FÉRAUD-KELLER & ESPAGNAC, 1989) abre la posibilidad de clonar árboles selectos de alcornoque en el futuro. Esta comunicación proporciona un protocolo para la obtención de embriones somáticos de Quercus suber a partir de tejidos no embriónicos y su ulterior germinación en altos porcentajes. En el cambio de proceso embriogénico a proceso germinativo parece jugar un papel importante el stress por falta de nutrientes, yen la posterior ruptura de la dormición el almacenamiento en frio. BIBLIOGRAFIA AMMlRATO P.V. (1983). Embryogenesis. In: Evans D. A., Sharp V.R. Ammirato P.V. Yama da Y. (Eds.). Handbook of Plant Cell Culture 1: ). Macmillan Publ. Company, New York. BONGA 1.M. (1991). In vitro propagation of conifers: fidelity of the clonal offspring. In: Ahuja M.R. (Ed.). Woody Plant Biotechnology: Plenum Press, New York. BUENO M.A., AS TORGA R. & MANZANERA 1.A. (1992). Pla,nt regeneration through soma tic embryogenesis in Quercus suber. Physiol. Planto 85: CHALUPA V. (1990). Plant regeneration by somatic embryogenesis from cultured inmature embryos of oak (Quercus robur L.)and linden (Tilia cordata Mill.). Plant Cell Rep. 9: EL MAATAOUI M. & ESPAGANAC H. (1987). Néoformation destructures de type embryons somatiques sur des cultures de tissues de chene liege (Quercus suber L.). C. R. Acad. Sci. Pans 304 (111) 3:

4 340 FERAUD-KELLER C. & ESPAGNAC H. (1989). Conditions d'apparition d'une embryogénese somatique sur des cals issus de la culture de tissus foliaires du chene vert (Quercus izex). Can. J. Bot. 67: GINGAS V.M. (1991). Asexual embryogenesis and plant regeneration from male catkins of Quercus. Bort. Sci. 26 (9): GINGAS V.M. & LINEBERGER R.D. (1989). Asexual embryogenesis and plant regeneration in Quercus. Plant Cell Tiss. Org. Culto 17: MERKLE S.A. (1991). Maturation ofyellow poplar somatic embryos. In: Ahuja M.R. (Ed.). Woody Plant Biotechnology: ). Plenum Press, New York. MERKLE S.A. & WIECKO A. T. (1989). Regeneration of Robinia pseudoacacia via somatic embryogenesis. Can. J. For. Res. 19: 285:288. PARK Y.S., POND S.D.& BONGA J.M. (1992). Initiation of somatic embryogenesis of white spruce (Picea glauca): genetic control, culture treatment effects and implications for tree breeding. Theor. Appl. Genet. (in press). THOMPSON R.G.& VON ANDERKAS P. (1992). Somatic embryogenesis and plant regenera tion from inmature embryos of western larch. Plant Cell Rep. 11: TORIBIO M. & CELESTINO C. (1989). Cultivo in vitro del alcornoque. Scientia Gerundensis 15: TORIBIO M. (1986). Callus initiation and primary morphogenic responses from Quercus suber L. cotyledons cultured in vitro. ProC. 18th. IUFRO World Congress 2 (1): 863. Jubljana, Yugoslavia. TULECKE W. & McGRANAHAN G. (1985). Somatic embryogenesis and plant regeneration from cotyledons of walnut, Junglans regia L. Plant Sci. 40: TABLA 1. Efecto del periodo en fria sobre la embriogénesis adventicia y la germinación.los embriones inmaduros fueron aislados y madurados en cámara de cultivo. Después de un periodo de 15 (C15) y 30 (C30) días en fria se situaron en la cámara de cultivo para la germinación. Todos los subcultivos se hicieron en medio con macronutrientes de SH. Algunos tratamientos incluyeron 0.05 ~M de BA en el medio de germinación. El control (Ca) no tuvo tratamiento en fria. Los datos se recogieron a los 30 días en condiciones de germinación y se dan en % de respuesta sobre los embriones iniciales (le). re NR AE CG R/T *** C * C15+BA * C *** C30+BA * Ca Chi-cuadrado=21.15 (01=0.05)

5 341 TABLA 2. Efecto de la desecación al aire sobre la germinac~on. Los embriones inmaduros fueron aislados y madurados en cámara de cultivo. Todos los subcultivos se hicieron en medio con macronutrientes de SH. El tratamiento 1 tuvo, despues de la maduración, un periodo de desecación de 7 dfas y un periodo posterior de frio de 3 O dfas. El tratamiento 11 tuvo únicamente 7 dfas de desecación. En el control (Co) no hubo desecación y si el periodo de frio de 30 días. Los datos se recogieron a los 30 dfas en condiciones de germinación y se dan en % de respuesta sobre los embriones iniciales (le).. le NR AE CG R/T * * * Co Chi-cuadrado=56.98 (a=o. 05) TABLA 3. Efecto de la maduración en un medio pobre y de la presencia de BA (0.5 J.LM) sobre la germinación. Los embriones inmaduros fueron aislados y madurados en cámara de cultivo. En todos los casos hubo un periodo,de frio de 30 días y la germinac~on se efectuó en cámara de cultivo en un medio con macronutrientes de SH con o sin citoquinina (0.05 J.LM de BA). En los dos primeros casos la maduración tuvo lugar en un medio pobre (macronutrientes de 1/2G). En el control la maduración se realizó en un medio rico en sales (macronutrientes de SH). Los datos se recogieron a los 30 días en condiciones de germinación y se dan en % porcentaje de respuesta sobre los embriones iniciales (le). le NR AE CG R/T * 1/2 S * 1/2 S+BA * Co Chi-cuadrado=12.81 (a=0.05)