ES GNETALES GRUPO HERMANO DE ANGIOSPERMAS?: ANÁLISIS FILOGENÉTICO DE GNETALES

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1 ES GNETALES GRUPO HERMANO DE ANGIOSPERMAS?: ANÁLISIS FILOGENÉTICO DE GNETALES Félix A. Álvarez-Torres, Jessica T. Calderón-Patiño, Oscar Y. Hernández-Lagos, Catalina L. Rivera-Giraldo Universidad Industrial de Santander, Facultad de Ciencias, Escuela de Biología RESUMEN Se realizó la filogenia de las plantas con semilla en busca de la posición del orden Gnetales, representado por tres géneros Ephedra, Welwitschia y Gnetum, con caracteres morfológicos y genes nucleares (18s, 26s), mitocondriales (atp1, cox1) y cloroplásticos (rbcl, atpb), mediante análisis de máxima parsimonia (MP), máxima verosimilitud (ML) e Inferencia Bayesiana (IB). En el análisis de MP Gnetales está más relacionado con coníferas que con angiospermas, en IB es grupo hermano de coníferas (sin incluir Pinaceae) y en ML se muestran diferentes topologías, la mayoría lo relacionan más con coníferas que con angiospermas. INTRODUCCIÓN El orden gnetales está conformado por 70 especies distribuidas en tres géneros, Ephedra, Welwitschia y Gnetum [1]. Estudios morfológicos sugieren que Gnetales es grupo hermano de angiospermas (hipótesis antophyta) [2,3], soportado por caracteres como estructuras reproductivas similares a flores, vasos en el leño, química de la lignina, características del polen y la megaspora, entre otros, aunque algunos autores rechazan ésta hipótesis [8,9] sugiriendo que los caracteres han evolucionado en paralelo. Pocos análisis moleculares han apoyado esta hipótesis con bajo soporte estadístico [4], pruebas de ML y otros métodos sugieren que puede ser un resultado de atracción de ramas largas [4 6]. Algunos posicionan a Gnetales en la base de las plantas con semillas [4,6,7] y la mayoría, con evidencia total, como grupo hermano de coníferas (hipótesis gnetifera) [6 10,13] o dentro de ellas como hermano de Pinaceae (hipótesis gnepines) [6,8,9,11 14] (asumiendo que algunos caracteres de coníferas se han perdido en Gnetales [5,6]). Aunque hoy día algunos caracteres morfológicos (traqueidas con punteaduras escalariformes, hojas lineares, esporofilos reducidos, entre otros) [2] apoyan la asociación con coníferas [15,16], es evidente que la posición de Gnetales en la filogenia de plantas con semillas es controversial y por eso es importante resolver esta incógnita mediante diferentes análisis (MP, ML e IB) y utilizando datos morfológicos y moleculares.

2 MATERIALES Y MÉTODOS La matriz morfológica [15] se modificó basándose en publicaciones anteriores [2,17], se eliminaron los fósiles y se obtuvo un total de 29 taxa (outgroups: cycadales y ginkgoales) y 117 caracteres (anexo1). Para los datos moleculares se usaron seis genes: dos cloroplasticos (atpb, rbcl) [4,18], dos mitocondriales (cox1, atp1) [8,18] y dos nucleares (18S [8,18], 26S) [4]. Los códigos de acceso y los FASTA (anexos2,3) se obtuvieron mediante búsqueda en la base de datos del GenBank. Se realizó un análisis de sensibilidad con evidencia total mediante el software POY v [19], con 3 costos diferentes de ts:tv:gap-morfo (1:1:1-1, 1:2:2-2, 1:2:4-4) para el cálculo del Índice de Incongruencia de Longitudes (I.L.D.) [20], con el fin de encontrar el mejor costo (anexo4), una vez hallado se realizó un análisis de máxima parsimonia con una mejor búsqueda de Wagner (build=100), swap TBR+SPR y bootstrap=100 con build=45. El alineamiento de las secuencias nucleotídicas se realizó mediante el software Seaview v4.3.3 [21], bajo los parámetros de Muscle, posteriormente se analizaron mediante el software JmodelTest v0.1.1 [22] para obtener el modelo evolutivo de cada gen bajo el criterio de información Akaike (AIC). El análisis de máxima verosimilitud se hizo para cada gen con el software PhyML v.3.0 [23] con árbol inicial BioNJ, la mejor búsqueda entre NNI y SPR, test jerárquico de longitud de ramas S-H y optimización de topología, longitud de las ramas y tasas de parámetros. Finalmente se realizó un análisis de inferencia bayesiana con evidencia total utilizando el software MrBayes v.3.2 [24], con de generaciones, frecuencia de muestreo de , dos cadenas de Markov Montecarlo bajo el algoritmo de Metropolis-Hastings (MCMC) y burn-in de RESULTADOS Y DISCUSIÓN El resultado del análisis de sensibilidad muestra que el costo óptimo fue ts1:tv1:g1-morf1 con un I.L.D=0,1453 (anexo4), la topología obtenida en el análisis de MP (figura1) con evidencia total, con dicho costo, muestra que Gnetales está más relacionado con coníferas que con angiospermas [8,10,18], como grupo hermano de coníferas excluyendo a Pinaceae, congruente con un estudio poco soportado del gen cox1 [8], esto difiere de varios estudios de MP que posicionan a Gnetales en la base de las plantas con semilla [4-7] y otros dentro de coníferas como grupo hermano de Pinaceae [11,12]. Una fuerte contradicción de este análisis con otros es la no monofilia de Gnetales, la cual está muy poco documentada [25] y pudo ser resultado de asumir que todos los genes tenían los mismos costos de ts:tv:g o de la calidad de las secuencias obtenidas del Genbank, ya que el análisis de MP con solo morfología (anexo5) soporta fuertemente (0.94) la monofilia de Gnetales mientras que el análisis de datos moleculares (anexo6) muestra no monofilia, indicando que posiblemente son las secuencias de genes las que generan este resultado.

3 Figura 1. Análisis de Máxima Parsimonia con evidencia total. Los números sobre las ramas corresponden al soporte de bootstrap. El modelo evolutivo obtenido según AIC para los genes atpb, atp1, cox1 y 26s fue GTR+Γ, y el de los genes rbcl y 18s fue GTR+I+Γ, estos dos últimos congruentes con [7,12], quienes utilizan GTR+I+Γ para todos los genes. Con base en estos modelos se obtuvieron las topologías individuales para cada gen mediante análisis de ML y se resumieron tres topologías en la figura2 (las seis topologías en anexo7). La topología del gen mitocondrial atp1 (figura2) posiciona a Gnetales dentro de las coníferas como grupo hermano de Pinaceae [8,9], mostrando que la hipótesis gnepine está soportada por ADNmitocondrial, sin embargo para el gen cox1 (anexo7) Gnetales está relacionado con coníferas pero no es hermano de Pinaceae. La topología del gen nuclear 26s (figura2) soporta la hipótesis antophyta al igual que [4], quien lo demostró con bajo soporte estadístico y análisis de MP,

4 esto indica que ésta hipótesis no puede ser totalmente descartada y que no sólo los estudios morfológicos la soportan; el gen nuclear 18s (anexo7) relaciona a Gnetales con coníferas al igual que [8,9,18], quienes trabajaron con este gen y lo situaron como grupo hermano de coníferas. Con el gen cloroplástico rbcl (anexo7) Gnetales está en la base de las plantas con semillas, esta hipótesis también ha sido soportada en estudios anteriores [4,6,7,18]; en la topología del gen atpb (figura2) es grupo hermano de coníferas exceptuando Pinacea, esto es congruente con los resultados obtenidos en IB. Las diferencias de estas topologías pueden ser resultado de los tipos de genes utilizados (nucleares, mitocondriales y cloroplasticos) que tienen distintas tasas mutacionales. Figura 2. Resumen de las topologías de tres genes: atp1 (mitocondrial), 26s (nuclear) y atpb (cloroplástico), obtenidas mediante el análisis de Máxima Verosimilitud. En el resultado de inferencia Bayesiana con evidencia total (figura3) Gnetales es grupo hermano de coníferas (sin incluir Pinaceae), similar a estudios anteriores realizados con datos moleculares [7,18], y a los resultados obtenidos en este estudio de ML para el gen atpb (figura2).

5 Figura 3. Análisis de Inferencia Bayesiana de evidencia total. Los números sobre las ramas corresponden a la probabilidad posteriori. La ambigua posición de Gnetales es conocida por varios estudios que muestran topologías contradictorias, esto depende de la escogencia de los taxa, los datos analizados y los métodos analíticos. Además se debe tener en cuenta que no hay información molecular de los fósiles de gimnospermas y hay sesgo en sus datos morfológicos, por eso, al realizar estudios como éste se está dejando a un lado taxa que podrían ser realmente el grupo hermano de Gnetales o de las angiospermas. CONCLUSIONES Es difícil posicionar a Gnetales en la filogenia de las plantas con semillas, está claro que con análisis de evidencia total se encuentra más relacionado con coníferas que con angiospermas, pero su posición exacta está aún sin resolver, todo esto depende de la escogencia de los taxa, los genes y los caracteres

6 morfológicos. Para estudios futuros se podría reevaluar los taxa y genes utilizados con el fin de llegar a una sola respuesta y conocer cuál es el verdadero grupo hermano de Gnetales. BIBLIOGRAFÍA 1. Donoghue, M.J. & Doyle, J. a Seed plant phylogeny: Demise of the anthophyte hypothesis? Current biology : CB 10, R106-R109 (2000). 2. Doyle, J.A. SEED PLANT AND THE RELATIONSHIPS of Gnetales. International Journal of Plant Sciences 157, S3-S39 (1996). 3. Crane, P.R. Phylogenetic Analysis of Seed Plants and the Origin of Angiosperms. Annals of the Missouri Botanical Garden 72, (1985). 4. Rydin, C., Kallersjo, M. & Friis, E.M. Seed Plant Relationships and the Systematic Position of Gnetales Based on Nuclear and Chloroplast DNA: Conflicting Data, Rooting Problems, and the Monophyly of Conifers. International Journal of Plant Sciences 163, (2002). 5. Burleigh, J.G. & Mathews, S. Phylogenetic signal in nucleotide data from seed plants: implications for resolving the seed plant tree of life. American journal of botany 91, (2004). 6. Magallón, S. & Sanderson, M.J. Relationships among Seed Plants Inferred from Highly Conserved Genes : Sorting Conflicting Phylogenetic Signals among Ancient Lineages RELATIONSHIPS AMONG SEED PLANTS INFERRED FROM HIGHLY CONSERVED GENES : SORTING CONFLICTING PHYLOGENETIC SIGNALS AMONG AN. America 89, (2002). 7. Rydin, C. & Korall, P. Evolutionary Relationships in Ephedra (Gnetales), with Implications for Seed Plant Phylogeny. International Journal of Plant Sciences 170, (2009). 8. Bowe, L.M., Coat, G. & depamphilis, C.W. Phylogeny of seed plants based on all three genomic compartments: extant gymnosperms are monophyletic and Gnetales closest relatives are conifers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, (2000). 9. Chaw, S.M., Parkinson, C.L., Cheng, Y., Vincent, T.M. & Palmer, J.D. Seed plant phylogeny inferred from all three plant genomes: monophyly of extant gymnosperms and origin of Gnetales from conifers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, (2000). 10. Chaw, S.-maw & Zharkikh, A. Molecular Phylogeny of Extant Gymnosperms and Seed Plant Evolution :Analysis of Nuclear 18s rrna Sequences. Molecular Biology (1997). 11. Nickerson, J. & Drouin, G. The sequence of the largest subunit of RNA polymerase II is a useful marker for inferring seed plant phylogeny. Molecular phylogenetics and evolution 31, (2004).

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