Modesto Alfredo Estrada Urbina Unidad Académica Preparatoria No.32, Universidad Autónoma de Guerrero.

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1 Tlamati Sabiduría Volumen 8 Número Especial 2, Octubre r. Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Memorias Antagonismo in vitro de Trichoderma spp., sobre hongos patógenos del cultivo de la Jamaica (Hibiscus sabdariffa L.) Modesto Alfredo Estrada Urbina estrada_urbina_ma@hotmail.com Unidad Académica Preparatoria No.32, Universidad Autónoma de Guerrero. Dra. Teolincacihuatl Romero Rosales romerot@colpos.mx Unidad Académica de Ciencias Agropecuarias y Ambientales Universidad Autónoma de Guerrero. Introducción Los cultivos agrícolas están expuestos al ataque de diversos agentes patógenos microbiológicos que se reproducen y se expanden de manera masiva, limitando la producción y disminuyendo los rendimientos para el consumo del ser humano. de organismos microbiológicos conocidos como Agentes de Control Biológico que atacan de manera natural a agentes patógenos regulando así las poblaciones de los mismos (Ibarra et al.,2006). Trichoderma es uno de los géneros fúngicos más estudiados y aplicados como Agente de Control Biológico, debido a sus cualidades como su capacidad reproductiva, su estimulo en el crecimiento y desarrollo de los cultivos, así como su inducción de resistencia a las plantas contra fitopatógenos (Romero, 2014). El hongo Trichoderma se caracteriza por tener un color blanco en estado inicial que se torna a verde oscuro o amarillento según su madurez, El hongo se encuentra presente en todas las latitudes, desde las zonas polares hasta la ecuatorial, debido a su gran capacidad enzimática de degradar sustratos y por su resistencia a los inhibidores microbianos (Infante et al. 2009)

2 Tlamati Sabiduría Volumen 8 Número Especial 2, 2017 Dentro de los mecanismos de defensa de Trichoderma se encuentra el Micoparasitismo, cuya acción se da de manera directa por la secreción de enzimas que degradan la pared celular del patógeno provocando una lisis. En algunas ocasiones, las hifas del hongo penetran la membrana del patógeno, provocando una debilidad al mismo limitando así su periodo de vida, cabe hacer mención que en el proceso micoparasítico se encuentran involucradas diferentes interacciones hifales tales como: enrollamiento, penetración, vacuolización, granulación, coagulación, desintegración y lisis (Martínez, 2003). El proceso Micoparasítico de acuerdo con Infante et al (2009), cumple con las siguientes etapas: 1.- Crecimiento quimiotrófico: Trichoderma detecta al hospedante y se dispone a crecer hacia él en respuesta a un estímulo químico 2.- Reconocimiento: En esta etapa se realiza una interacción entre lectinas-carbohidratos 3.- Adhesión y enrollamiento: Cuando el reconocimiento es positivo, las hifas de Trichoderma se adhieren al hospedante mediante la formación de estructuras parecidas a ganchos, y enrollándose alrededor de ellas. Esto ocurre gracias a la asociación de un azúcar de la pared del antagonista con una lectina presente en la pared del patógeno 4.- Actividad lítica: Ocurre una producción de enzimas líticas extracelulares (glucanasas, quitinasas y proteasas) que degradan las paredes celulares del hospedante favoreciendo así la penetración de sus hifas Cabe destacar que el proceso de micoparasitismo puede verse favorecido por diversos mecanismos como la antibiosis y la competencia por espacio y nutrientes, es decir, se pueden efectuar más de dos tipos de mecanismos de acción de defensa tanto directos como indirectos. No obstante, ello depende de la capacidad enzimática que posea la cepa de Trichoderma México produce aproximadamente siete mil toneladas de Jamaica anualmente, siendo el Estado de Guerrero el principal productor, de manera especial los municipios de Tecoanapa, Ayutla, Juan R.

3 Memorias del 4 Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Escudero y San Marcos. Su cultivo se realiza en la época de primavera-verano al inicio del temporal, mientras que su cosecha se realiza en los meses de octubre y noviembre (SIAP,2016). Su origen yace del sur de África, no obstante, Ruiz-Ramírez et al (2015), señala que su origen proviene del continente asiático, específicamente en Malasia e Indonesia. Fue introducida a México por los españoles en el año 1707 durante la colonia (Morton, 1987). El cáliz de la Jamaica es el más común para su consumo en bebidas refrescantes, saborizante natural, gelatinas, pasteles, jaleas, mermeladas; También, las hojas tiernas y tallos suelen ser aprovechadas para preparar ensaladas (Martínez, 2010). No obstante, el cultivo de Jamaica, al igual que muchos otros; es susceptible a la invasión de incontables patógenos. Aquellos que inducen a una pudrición negra en tallo y raíz son los que aportan mayores problemas, siendo Phytophtora parasítica y Fusarium Oxysporum (Ortega,2012) los principales agentes responsables de la enfermedad pata prieta ; Reportada por Hernández y Romero en 1990 en México por vez primera, señalando a Phytophtora parasítica como el causante de esta enfermedad, sus síntomas se detectan por una necrosis en la base del tallo, marchitez en las hojas y finalmente la muerte de la plata(osorio, 2014); y se estimó una incidencia del 40% de la enfermedad Pata Prieta con respecto a un estudio realizado en parcelas del estado de Guerrero. (González-Satín, 2008). Por otra parte, la enfermedad que ha sido de mayor riesgo para el cultivo de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) y de mayor preocupación para los Guerrerenses debido a su gran incidencia en los cultivos de Jamaica y que ataca de igual o mayor magnitud que la enfermedad Pata Prieta es el Manchado de Cáliz la cual provoca una deficiencia en la calidad de los cálices (Trujillo-Tapia, 2015), quienes son mayormente aprovechados para su venta y consumo del mismo. Se caracteriza por la aparición de manchas blanquecinas o grisáceas rodeadas de un halo rojizo en el follaje, con respecto a reportes de Hernández et al (2008), en plantaciones de Guerrero. De igual manera señalaron a los hongos Leptosphaerulina americana, Corynespora cassicola y Glomerella cingulata como los responsables de esta enfermedad.

4 Tlamati Sabiduría Volumen 8 Número Especial 2, 2017 Un estudio realizado en el estado de Guerrero por Martínez (2010), sobre la etiología e incidencia de hongos asociados al manchado de Cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) señala los siguientes puntos: a) se encontraron 2 tipos de manchas en los cálices: * Manchas blancas abultadas redondeadas a irregulares de 1-2mm de diámetro con aspecto corchoso. * Manchas de color negro ligeramente hundidas, de forma irregular de aproximadamente 1-5mm de diámetro y conforme la infección avanza, evolucionan en tamaño y número e invaden la superficie del cáliz. b) se detectó que Fusarium sp provoca la pudrición del fruto y que phomopsis sp induce a una muerte regresiva en tallos y follaje en especies de Hibiscus de Florida (Alfieri jr et al., 1984; Citado por Martínez, 2010). Objetivos generales: 1. Obtener cepas nativas de Trichoderma spp. Que contrarresten a los hongos causantes de las enfermedades Pata prieta (Phytophthora parasítica, Fusarium Oxysporum) y Manchado de cáliz (Corynespora cassicola, Phoma sp., Lasiodiplodia sp.) 2. Obtener cepas de los hongos causales de las enfermedades Pata prieta (Phytophthora parasítica, Fusarium Oxysporum) y Manchado de cáliz (Corynespora cassicola, Phoma sp., Lasiodiplodia sp) Objetivos específicos: 1. Extracción de cepas nativas de Trichoderma spp. De suelo cultivado con Jamaica. 2. Evaluar la capacidad antagónica de las cepas nativas obtenidas de Trichoderma spp. Contra los agentes patógenos causantes de las enfermedades Pata prieta y Manchado de cáliz

5 MATERIALES Y MÉTODOS Memorias del 4 Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Colecta de la muestra Se tuvieron cinco sitios de muestreo en Ayutla y Tecoanapa, zonas donde se siembra la jamaica, en cada sitio de muestreo se tomaron 1 kg de suelo bajo el método cinco de oros, los cuales se mezclaron y homogenizaron. De esta muestra se tomó 1 kg, cada toma se realizó a 20 cm de profundidad y se eliminó la materia orgánica de los primeros 5 cm de suelo. Las tomas de suelo se transportaron en bolsas de plástico al laboratorio de Microbiología de la Maestría en Ciencias Agropecuarias y Gestión Local de la Facultad de Ciencias Agropecuarias y Ambientales UAGro. (Universidad Autónoma de Guerrero), mismas que se mantuvieron en refrigeración a 10 C hasta el momento de su procesamiento. Preparación de medio de cultivo (PDA) El PDA se preparó en el laboratorio utilizando dos matraces de 500 ml, Para ello se preparó la solución con 1000 ml de agua destilada y en ella se le aplico el PDA y una pastilla de antibiótico en una botella para poder agitar hasta que la solución se mostró homogénea para que se pudiera vaciar en los dos matraces cuidando que en cada matraz se tenga 500 ml para que no se derramara con la ebullición en el autoclave, se procedió a esterilizar las muestras esperando a que llegará a los 121 C, una vez a esa temperatura, se mantuvo por 20 minutos y se apagó, esperando que se enfriara el autoclave para poder sacar cada matraz, una vez hecho todo el procedimiento se vacío en cajas Petri dentro de la campana de flujo laminar para que no se contamine, poco después el medio se solidifico. Aislamiento de Trichoderma spp. Los aislados de Trichoderma spp. se obtuvieron mediante el método de dilución de esporas en caja Petri, tomándose de cada muestra compuesta 1 gr de suelo diluido en 10 ml de agua destilada estéril hasta obtener diluciones 1/100 y 1/1000, de estas se tomó una alícuota de 0.5 ml y se hizo una distribución homogénea sobre una caja Petri que tuviera medio de cultivo PDA. Estas se incubaron a temperatura ambiente por 10 días. Se utilizaron en total 10 cajas Petri por cada muestra compuesta de suelo. Las colonias de Trichoderma spp. se reconocieron por su forma de crecimiento en parches verdes y formación de anillos concéntricos. De cada aislado se realizó la purificación por medio de cultivos monospóricos.

6 Tlamati Sabiduría Volumen 8 Número Especial 2, 2017 Cepas en el estudio Se aislaron 2 cepas nativas de Trichoderma de suelo cultivado con Jamaica que se extrajeron de las muestras del colectadas, la cepas fitopatogenas, fueron proporcionadas por la Dra. Romero quien ha trabajado con enfermedades del cultivo de la jamiaca. Evaluación de la actividad antagónica in vitro de diferentes cepas de Trichoderma spp., contra cepas de Fusarium oxysporum. Para evaluar la actividad antagónica se empleó la técnica de cultivos duales. Se utilizaron cajas Petri con medio de cultivo PDA y se depositó a 2 cm de el extremo de la caja y en condiciones asépticas, un disco de micelio de 5 mm de diámetro de cada cepa de F. oxysporum con crecimiento activo. Dos días después, en forma equidistante se colocó un disco de micelio de 5 mm de diámetro de cada aislado de Trichoderma spp. con 10 días de crecimiento. En los testigos se colocaó un disco de micelio de 5 mm de diámetro de Phytophthora parasítica, F. oxysporum, Corynespora cassicola, Phoma sp., Lasiodiplodia sp., con crecimiento activo. Una vez colocados ambos organismos fungosos en las cajas Petri, se incubarón a temperatura ambiente (± 23 C) y se observarón cada 24 horas, en las cuales se evaluaron variables, las cuales fueron: días al primer contacto entre hifas, zona de intersección, clasificación del antagonismo, capacidad de esporulación de las diferentes especies de Trichoderma sobre las cepas de F. oxysporum, e interacción del organismo antagónico con el patógeno. Resultados: Se obtuvieron 2 cepas distintas de Trichoderma spp., de las cuales por estudios de cultivos apareados ambas presentaron actividad antagónica contra Phytophthora parasítica, F. oxysporum, Corynespora cassicola, Phoma sp., Lasiodiplodia sp. Los resultados obtenidos indican que Trichoderma spp. tiene variación específica y está adaptado a los suelos asociados a jamaica, pero no todas las especies nativas de Trichoderma pueden controlar a los hongos patógenos que afectan al cultivo. El comportamiento de las cepas nativas de Trichoderma contra los hongos fitopatógenos causales de la pata prieta y del manchado de cáliz, en el cual se observaron las cepas que presentaron mayor actividad antagónica dado que el micelo de Trichoderma creció 2/3 en la caja Petri dejando a las cepas patogenas en un tercio sin dejarlos crecer, esta observación se llevó a cabo con las Clases de Antagonismo de Bell et al., 1982: 1= Trichoderma sobrecrece al patógeno 2= Trichoderma sobrecrece 2/3 partes del medio 3= Ningún organismo es dominante

7 Memorias del 4 Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT La inhibición del crecimiento se observó en todos los tratamientos al cuarto día (Fig. 4), aun cuando el antagonista se encontraba distante del patógeno, posiblemente a través de antibiosis, mecanismo característico para estas especies de biocontroladores. La forma en que Trichoderma probablemente inhibe el crecimiento radial, aun estando a distancia del patógeno, esta mediada por diversos mecanismos, destacándose la producción de compuestos inhibitorios al medio; antibiosis por producción de metabolitos volátiles y no volátiles entre los cuales se encuentran, pirones, isocianatos, pépticos, y trichocinas (Howell, 2003); además, la producción de enzimas extracelulares difundibles tales como peptinasas, cutinasas, glucanasas, y quitinasas e inactivación de las misma hacia el patógeno, tal como lo sugieren Durán et al. (2003). Fig. 1 Preparación de medio de cultivo

8 Tlamati Sabiduría Volumen 8 Número Especial 2, 2017 Conclusiones Cada una de las cepas que se extraen de suelos cultivados con Jamaica, y que muestran potencial como agente de control biológico, deben identificarse, por lo cual este trabajo es el inicio de una investigación que se llevara hasta la identificación molecular de las cepas de Trichoderma con potencial como antagonistas de hongos patógenos del cultivo de la Jamaica, dichas cepas se probaran ahora in vivo, el cual sigue en proceso y del cual forme parte para montar el experimento y ahora se puedan probar estas cepas nativas para el control de Phytophthora parasítica, F. oxysporum, Corynespora cassicola, Phoma sp., Lasiodiplodia sp. Referencias bibliográficas Andrews, J.H Control biológico en la filosfera. Revisión Anual de la Fitopatología 30: Avilán, R. L Nutrición y Fertilización del mango. Inernational Plant Nutrition Institute (IPNI). 73 p. Calistru, C., McLean, M. and Berjak, P Estudios in vitro sobre el potencial de control biológico de Aspergillus flavus y Fusarium moniliforme por especies de Trichoderma. Mycopathologia 139: Chet, I Trichoderma-aplicación, modo de acción y potencial como agente de biocontrol de los hongos patógenos de plantas transmitidas por el suelo. In: I. Chet (ed.). Innovative approaches to plant control disease. Willey and Sons. New York, USA. p Durán, E., F. Robles, J. Martínez y M. Brito Trichoderma Un hongo combatiente de patógenos. Revista Técnico Ambiental Teorema Ambiental 42: Howell, C.R Mecanismos empleados por las especies de Trichoderma en el control biológico de enfermedades de las plantas: La historia y la evolución de los conceptos actuales. Plant Disease 87(1): Ibarra J. E., Del Rincón C. Ma. C., Galindo E., Patiño M., Serrano L., García R., Carrillo J. A., Pereyra-Alférez B., Alcázar-Pizaña A., Luna-Olvera H., Galán-Wong L., Pardo L., Muñóz-Garay

9 Memorias del 4 Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT C., Gómez I., Soberón M., Bravo A Los microorganismos en el control biológico de insectos y fitopatógenos. Mexicana de Fitopatologia. Infante D., Mecanismos de acción de Trichoderma frente a hongos fitopatógenos Martínez S. C Etiología e incidencia de hongos asociados al manchado de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa L.) en Guerrero, México. Morton J Jamaica Cherry muntingia calabura l. Ruiz-Ramírez., Rubicela., Hernández-Morales J., Ayala-Escobar V., Soto-Rojas L., Leyva-Mir S. G., Hernández-Ruiz J Hongos Asociados a Cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa L.) Deshidratados y Almacenados en Guerrero, México. Ortega A. S. A Distribución y variabilidad genética de organismos asociados a la enfermedad Pata prieta de la Jamaica (Hibiscus sabdariffa), en Guerrero, México. Osorio H. E Efectividad de trichoderma spp. Sobre la enfermedad Pata prieta en Jamaica (hibiscus sabdariffa) in vitro e in vivo en Guerrero, México. Trujillo-Tapia Ma. N., Ramírez-Fuentes E Fitopatógenos asociados al manchado del cáliz de la jamaica (Hibiscus sabdariffa L.)