Protocolo de pirosecuenciación IDH 1

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1 Protocolo de pirosecuenciación IDH 1 Cykowski M, Allen R, Fung K, Harmon M, Dunn S. Pyrosequencing of IDH1 and IDH2 Mutations in Brain Tumors and Non-neoplastic Conditions. Diagnostic Molecular Pathology. 2012;21(4): Amplificación de IDH1: Reactivos para 1 muestra. Volumen final: 25 μl. Añadir un control normal y un NTC en la amplificación. 8 μl H μl PyroMark PCR Master Mix, 2x 2.5 μl CoralLoad Concentrate, 10x 1 μl PCR Primer Mix IDH1 25uM Forward Primers 5 -GCTTGTGAGTGGATGGGTAAA-3 biotinylated reverse primers 5 -TTGCCAACATGACTTACTTGATC ng de DNA genómico (1uL DNA control) Termociclador BioRAD. Programa IDH1PyroQiagen (42 ciclos de 95(20s)-54(30s)-72(20s), tras una desnaturalización inicial de 15 min a 95º. Extensión final: 5 minutos 72º). Amplicon 75bp. Comprobación de la amplificación en un gel de acrilamida al 5% Pyrosecuenciación IDH1 Encender el termobloque a 80ºC por la cara plana. Binding 1-. Reactivos para 1 muestra: 38 μl BindingBfr (rotulado en negro) 2 μl Streptavidin-agarose 30 μl agua Vf= 70 μl 2-. Alicuotar los 40 μl de BindingBuffer + StrA en tubos de 0,2mL con tapa. 3.-Añadir 30µL de agua (el volumen se puede ajustar en función del ppcr) 4-. Con una pipeta postpcr en la sala de electroforesis, añadir 10μl de ppcr. 5-. Colocar los tubos bien cerrados en el agitador. Ajustar las muestras con los elásticos del soporte. 6-. Cambiar el programa predeterminado manteniendo pulsado Program. Aparecerá la opción 1400rpm durante 5-10 minutos. Start. Preparar la estación del pirosecuenciador. 7-. Llenar las cubetas hasta la marca (aprox. la mitad). En el fondo de cada una de ellas aparece el reactivo que debe utilizarse. Agua, Etanol 70%, Denaturing Buffer, Washing Buffer. Una vez comience la pirosecuenciación, desechar todos los reactivos. 1

2 Preparar la placa de secuenciación. 8-. Reactivos por muestra 25 μl Annealing Buffer (rotulado en rojo) 0.8 μl Seq Primer IDH1 10uM SeqPrimers 5 -GGGTAAAACCTATCATCATA Dispensar 25 μl en el pocillo correspondiente de la placa QIAGEN. El volumen no cubre completamente el fondo del pocillo. Estación de trabajo 10-. Colocar el peine de vacío en una de las cubetas de agua durante 30seg. Recoger los tubos 0,2mL del agitador Aspirar con el peine de vacío el contenido de los tubos Pasar el peine por las soluciones. 1. Etanol 70% durante 5seg. 2. Denaturing Buffer durante 5seg. 3.Washing Buffer 10seg Colocar el peine en vertical para que el líquido que quede sea aspirado Apagar la llave de vacío del peine y el aspirador Colocar el peine sobre la placa de pirosecuenciación. Mantenerlo 10s mientras se mueve con suavidad Tapar la placa con otra de las ya utilizadas. Colocarlas sobre una plancha previamente caliente y llevarlas al termobloque durante 2 minutos Tras dos minutos, pasar las placas a otra plancha a temperatura ambiente durante al menos minutos. Software + Pirosecuenciador 18-. Encender el pirosecuenciador Abrir el programa PyroMark Q 24 en el ordenador. a) New Run (signo Play en verde o File-New Run) b) Instrument Method: PyroMark Method 003 c) Arrastrar hasta Assay la prueba IDH1codon132. Nombrar los pocillos de acuerdo con el orden que se ha seguido al aspirar las muestras. d) Save as en un pendrive. e) Tools: Pre run info. Comprobar el volumen de Enzimas, sustrato y nucleótidos necesarios para la prueba Cargar el cartucho del pirosecuenciador con el volumen adecuado de Enzime, Substrate, A, C, T, G Colocar el pen en el pirosecuenciador. Esperar hasta que lo reconozca y seleccionar Run. Elegir el archivo que se acaba de crear Confirmar que se quiere iniciar esa prueba. Empezará automáticamente. Al principio comprueba la presión, la temperatura, la oscuridad de la cámara Cuando las barras de esos parámetros aparezcan en verde, comenzará a dispensar reactivos. Durante la prueba, se puede comprobar el progreso de cada muestra haciendo click en las flechas arriba y abajo Cuando la prueba haya finalizado, extraer el pendrive (el aparato avisa), apagar el pirosecuenciador (Shutdown y después el interruptor) y retirar del soporte el exceso de reactivos. Lavar tres veces. Presionar ligeramente en la parte superior para comprobar que los 2

3 dispensadores no están obstruidos Abrir PyroMark Q24 en el ordenador, Open File, seleccionar el archivo con el que se está trabajando. Análisis de resultados 25-. Seleccionar los pocillos con muestras, hacer click en Analyze selected Wells (icono de Play gris con fondo punteado a la derecha de la pantalla). Nucleótido 1 del codón 132 de IDH1 Análsis automático por defecto. Dispensation Order CGTGCAGTCAT Seq to Analize Posición 1 codon 132: GGTNGTCATGCTTAT Posición 2 codon 132: GGTCNTCATGCTTAT Position 3 codon 132: No cambia el aa wt, arginina Histograma Posición 1 codon 132 IDH1 Pirograma Caso WT Nucleótido 2 del codón 132 de IDH1 Dispensation Order CGTGCAGTCAT Seq to Analize Posición 1 codon 132: GGTNGTCATGCTTAT Posición 2 codon 132: GGTCNTCATGCTTAT Position 3 codon 132: No cambia el aa wt, arginina 3

4 26.- Seleccionar las todas muestras en las que se ha escogido la prueba IDH1codon Hacer click en: Analysis Setup 28.- Cambiar la opción Sequence to Analyze desde la automática a la modificada para el nucleótido 2 del codon 132. Aceptar la ventana emergente que avisa de que se están realizando cambios en los parámetros de la prueba Hacer Click en Apply. 30.-Hacer click en To selected Wells en la nueva ventana emergente. En este momento se realiza un análisis automático de la calidad de la prueba Click en Overview para comprobar los resultados. En las muestras aparecerá una señal que advierte del cambio de parámetros. Histograma Posición 2 codon 132 IDH1 Pirograma Caso WT 4

5 Protocolo de pirosecuenciación IDH 2 Cykowski M, Allen R, Fung K, Harmon M, Dunn S. Pyrosequencing of IDH1 and IDH2 Mutations in Brain Tumors and Non-neoplastic Conditions. Diagnostic Molecular Pathology. 2012;21(4): PENDIENTE DE CORRECCIÓN.- PYRO ROJO Amplificación de IDH1: Reactivos para 1 muestra. Volumen final: 25 μl. Añadir un control normal y un NTC en la amplificación. 8 μl H μl PyroMark PCR Master Mix, 2x 2.5 μl CoralLoad Concentrate, 10x 1 μl PCR Primer Mix IDH2 25uM Forward Primers 5 -TCCGGGAGCCCATCATCT-3 biotinylated reverse primers 5 -CCTGGCCTACCTGGTCGC ng de DNA genómico (1uL DNA control) Termociclador BioRAD. Programa IDH2PyroQiagen (42 ciclos de 95(20s)-58(30s)-72(20s), tras una desnaturalización inicial de 15 min a 95º. Extensión final: 5 minutos 72º). Amplicon 102bp. Comprobación de la amplificación en un gel de acrilamida al 5% Pyrosecuenciación IDH1 Encender el termobloque a 80ºC por la cara plana. Binding 1-. Reactivos para 1 muestra: 38 μl BindingBfr (rotulado en negro) 2 μl Streptavidin-agarose 30 μl agua Vf= 70 μl 2-. Alicuotar los 40 μl de BindingBuffer + StrA en tubos de 0,2mL con tapa. 3.-Añadir 30µL de agua (el volumen se puede ajustar en función del ppcr) 4-. Con una pipeta postpcr en la sala de electroforesis, añadir 10μl de ppcr. 5-. Colocar los tubos bien cerrados en el agitador. Ajustar las muestras con los elásticos del soporte. 6-. Cambiar el programa predeterminado manteniendo pulsado Program. Aparecerá la opción 1400rpm durante 5-10 minutos. Start. Preparar la estación del pirosecuenciador. 7-. Llenar las cubetas hasta la marca (aprox. la mitad). En el fondo de cada una de ellas aparece 5

6 el reactivo que debe utilizarse. Agua, Etanol 70%, Denaturing Buffer, Washing Buffer. Una vez comience la pirosecuenciación, desechar todos los reactivos. Preparar la placa de secuenciación. 8-. Reactivos por muestra 25 μl Annealing Buffer (rotulado en rojo) 0.8 μl Seq Primer IDH2 10uM SeqPrimers 5 -AGCCCATCACCATTG Dispensar 25 μl en el pocillo correspondiente de la placa QIAGEN. El volumen no cubre completamente el fondo del pocillo. Estación de trabajo 10-. Colocar el peine de vacío en una de las cubetas de agua durante 30seg. Recoger los tubos 0,2mL del agitador Aspirar con el peine de vacío el contenido de los tubos Pasar el peine por las soluciones. 1. Etanol 70% durante 5seg. 2. Denaturing Buffer durante 5seg. 3.Washing Buffer 10seg Colocar el peine en vertical para que el líquido que quede sea aspirado Apagar la llave de vacío del peine y el aspirador Colocar el peine sobre la placa de pirosecuenciación. Mantenerlo 10s mientras se mueve con suavidad Tapar la placa con otra de las ya utilizadas. Colocarlas sobre una plancha previamente caliente y llevarlas al termobloque durante 2 minutos Tras dos minutos, pasar las placas a otra plancha a temperatura ambiente durante al menos minutos. Software + Pirosecuenciador 18-. Encender el pirosecuenciador Abrir el programa PyroMark Q 24 en el ordenador. f) New Run (signo Play en verde o File-New Run) g) Instrument Method: PyroMark Method 003 h) Arrastrar hasta Assay la prueba IDH2codon172. Nombrar los pocillos de acuerdo con el orden que se ha seguido al aspirar las muestras. i) Save as en un pendrive. j) Tools: Pre run info. Comprobar el volumen de Enzimas, sustrato y nucleótidos necesarios para la prueba Cargar el cartucho del pirosecuenciador con el volumen adecuado de Enzime, Substrate, A, C, T, G Colocar el pen en el pirosecuenciador. Esperar hasta que lo reconozca y seleccionar Run. Elegir el archivo que se acaba de crear Confirmar que se quiere iniciar esa prueba. Empezará automáticamente. Al principio comprueba la presión, la temperatura, la oscuridad de la cámara Cuando las barras de esos parámetros aparezcan en verde, comenzará a dispensar reactivos. Durante la prueba, se puede comprobar el progreso de cada muestra haciendo click en las flechas arriba y abajo. 6

7 23-. Cuando la prueba haya finalizado, extraer el pendrive (el aparato avisa), apagar el pirosecuenciador (Shutdown y después el interruptor) y retirar del soporte el exceso de reactivos. Lavar tres veces. Presionar ligeramente en la parte superior para comprobar que los dispensadores no están obstruidos Abrir PyroMark Q24 en el ordenador, Open File, seleccionar el archivo con el que se está trabajando. Análisis de resultados 25-. Seleccionar los pocillos con muestras, hacer click en Analyze selected Wells (icono de Play gris con fondo punteado a la derecha de la pantalla). Nucleótido 1 del codón 172 de IDH2 Análsis automático por defecto. Dispensation Order CGTCACTGTACACG Seq to Analize Position 1 codon 172: GCNGGCACGCCCATGG Position 2 codon 172: GCANGCACGCCCATGG Position 3 codon 172: GCAGNCACGCCCATGG Histograma Posición 1 codon 172 IDH2 Pirograma Caso WT FALTA Nucleótido 2 del codón 172 de IDH2 Dispensation Order CGTCACTGTACACG Seq to Analize Position 1 codon 172: GCNGGCACGCCCATGG Position 2 codon 172: GCANGCACGCCCATGG Position 3 codon 172: GCAGNCACGCCCATGG 26.- Seleccionar las todas muestras en las que se ha escogido la prueba IDH1codon Hacer click en: Analysis Setup 28.- Cambiar la opción Sequence to Analyze desde la automática a la modificada para el nucleótido 2 del codon 172. Aceptar la ventana emergente que avisa de que se están realizando cambios en los parámetros de la prueba Hacer Click en Apply. 30.-Hacer click en To selected Wells en la nueva ventana emergente. En este momento se realiza un análisis automático de la calidad de la prueba. 7

8 31.- Click en Overview para comprobar los resultados. En las muestras aparecerá una señal que advierte del cambio de parámetros. Histograma Posición 2 codon 172 IDH2 Pirograma Caso WT FALTA Nucleótido 3 del codón 172 de IDH2 Repetir pasos 26 a 31. Dispensation Order CGTCACTGTACACG Seq to Analize Position 1 codon 172: GCNGGCACGCCCATGG Position 2 codon 172: GCANGCACGCCCATGG Position 3 codon 172: GCAGNCACGCCCATGG Histograma Posición 3 codon 172 IDH2 Pirograma Caso WT FALTA 8