Tabla 4. Métodos de ensayo. A continuación se describen brevemente cada uno de los ensayos de toxicidad que se llevaron a cabo:

Transcripción

1 4. MÉTODOS DE ENSAYO La elección de los métodos de ensayo para determinar la toxicidad de los vertidos objeto de estudio se realizó en base a su disponibilidad comercial en forma de kit miniaturizado, lo que facilita su implantación en laboratorios no especializados, y a la existencia de normas de referencia sobre las que se apoyan. De este modo, en la Tabla 4 se presentan los métodos elegidos con su norma de referencia correspondiente: Tabla 4. Métodos de ensayo ENSAYO Toxicidad aguda en crustáceo de agua dulce Daphnia magna Toxicidad aguda en crustáceo de agua dulce Thamnocephalus platyurus Toxicidad aguda en crustáceo de aguas salobres y saladas Artemia salina NORMA DE REFERENCIA ISO 6341 (1996) Thamnotoxkit. Protocolo estándar Artoxkit M. Protocolo estándar Toxicidad aguda en rotífero marino Brachionus plicatilis ASTM E (2004) Inhibición del crecimiento del alga de agua dulce Selenastrum capricornutum Ensayo de inhibición de la bioluminiscencia sobre Vibrio fischeri ISO 8692:2004 ISO :2007 A continuación se describen brevemente cada uno de los ensayos de toxicidad que se llevaron a cabo: 4.1. ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA EN DAPHNIA MAGNA Se trata de un bioensayo rápido y simple para la evaluación ecotoxicológica de aguas residuales y lixiviados de residuos, así como para disoluciones de sustancias y preparados. Es uno de los ensayos estandarizados más utilizados en toxicología acuática de aguas continentales, ya que tiene una buena sensibilidad ante un elevado número de sustancias químicas y es especialmente sensible frente a diversos metales.

2 Figura 2. Daphnia Magna En este ensayo se obtiene una curva concentración-efecto a partir de la cual se puede calcular la C(E)L50 aguda de la muestra para los organismos de ensayo. Para ello, se emplean individuos juveniles del crustáceo Daphnia magna procedentes de efipias de dicho organismo. Así, tras la eclosión de estas efipias se seleccionan larvas de menos de 24 horas de vida, que se exponen por duplicado a una serie de diluciones de la muestra a ensayar. La exposición de los organismos a las distintas concentraciones de la muestra se lleva a cabo en frascos de vidrio o plástico de unos 60 ml de capacidad, durante un periodo de 24 h, a 20 ±2 ºC y en ausencia de luz. Tras este periodo se cuenta y registra el número de larvas inmovilizadas para cada concentración, para finalmente calcular la C(E)L50 mediante análisis estadístico de los datos ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA EN THAMNOCEPHALUS PLATYURUS Bioensayo rápido y simple para la evaluación ecotoxicológica de aguas residuales y lixiviados de residuos, así como para disoluciones de sustancias y preparados. La sensibilidad del crustáceo de agua dulce Thamnocephalus platyurus es comparable a la de otros invertebrados de agua dulce, superándola a menudo. En este ensayo se obtiene una curva concentración-efecto a partir de la cual se puede calcular la C(E)L50 aguda de la muestra para los organismos de ensayo. Para ello, tras la eclosión de las efipias de este crustáceo se obtienen individuos juveniles que se exponen, por triplicado, a una serie de diluciones de la muestra a ensayar. Esta exposición se realiza en placas de poliestireno de 24 pocillos, durante un periodo de 24 horas, a 25±1 ºC y en ausencia de luz. Tras este periodo se cuenta y registra el número de larvas inmovilizadas en cada concentración, y se calcula la C(E)L50 mediante análisis estadístico de los datos.

3 Figura 3. Thamnocephalus platyurus 4.3. ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA EN ARTEMIA SALINA Bioensayo rápido, simple y económico para la evaluación ecotoxicológica de aguas residuales y lixiviados de residuos, así como para disoluciones de sustancias y preparados, a través de la exposición del crustáceo de agua salada y salobre Artemia salina. Figura 4. Artemia salina Su objetivo, al igual que el de los dos ensayos anteriores, es obtener una curva concentración-efecto a partir de la cual poder calcular la C(E)L50 aguda de la muestra para estos pequeños organismos versátiles, pertenecientes al grupo de especies eurihalinas (se encuentran

4 habitualmente en biotopos de elevada salinidad y son capaces de crecer y reproducirse tanto en aguas saladas como en salobres y dulces). Tras la eclosión de efipias de estos organismos, se seleccionan estadios larvales tempranos, generalmente II-III (ver Figura 5), y se exponen por triplicado a una serie de diluciones de la muestra a ensayar. Esta exposición se lleva a cabo en placas de poliestireno de 24 pocillos de 3 ml de capacidad, durante un periodo de 24 horas, a 25±1 ºC y en ausencia de luz. Tras este periodo se cuenta y registra el número de larvas inmovilizadas en cada concentración, y se calcula la C(E)L50 mediante análisis estadístico de los datos. Figura 5. Estadios de la Artemia Salina: : nauplio (I), metanauplio (II), juvenil (III) y adulto (IV) 4.4. ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA EN BRACHIONUS PLICATILIS Bioensayo rápido, simple y económico para la evaluación toxicológica de aguas residuales y lixiviados de residuos, así como para disoluciones de sustancias y preparados, a través de la exposición del rotífero de agua marina Brachionus plicatilis. El objetivo de este ensayo es obtener una curva concentración-efecto a partir de la cual poder calcular la C(E)L50 aguda de la muestra para estos pequeños organismos marinos. Para ello, tras la eclosión de efipias se obtienen individuos juveniles que se exponen por sextuplicado, en grupos de 5 organismos, a una serie de diluciones de la muestra a ensayar. La exposición de los organismos a las distintas diluciones se lleva a cabo en placas de PVC de 36 pocillos de aproximadamente 1 ml de capacidad, durante un periodo de 24 horas, a 25±1 ºC y en ausencia

5 de luz. Tras este periodo se cuenta y registra el número de larvas inmovilizadas en cada concentración, y se calcula la C(E)L50 mediante análisis estadístico de los datos. Figura 6. Brachionus plicatilis 4.5. ENSAYO DE INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DEL ALGA SELENASTRUM CAPRICORNUTUM Bioensayo rápido y simple para la evaluación ecotoxicológica de aguas residuales y lixiviados de residuos, así como para disoluciones de sustancias y preparados. Figura 7. Selenastrum capricornutum Tiene como objetivo obtener una curva concentración-efecto a partir de la cual poder calcular la CEb,50 (concentración que inhibe en un 50% el crecimiento, medido como biomasa, del alga) de la muestra para el alga unicelular de agua dulce Selenastrum capricornutum. Para ello,

6 a partir de un precultivo se obtiene una suspensión de algas con una densidad de cel/ml. Posteriormente, estas algas se exponen por triplicado a una serie de diluciones de la muestra a ensayar. La exposición de las algas a las distintas concentraciones de la muestra se lleva a cabo en cubetas de 25 ml de volumen y 10 cm de paso de luz, durante un periodo de 72 horas, a 23±2 ºC y bajo iluminación constante (aproximadamente lux). La medida de la inhibición del crecimiento de las algas en presencia de la muestra se realiza indirectamente a través de la medida de la absorbancia de cada concentración y del control (cultivo sin presencia de muestra) a 670 nm. Estas mediciones se realizan al inicio, a las 24, 48 y 72 horas siguientes. Finalmente se calcula la CEb,50 mediante el análisis estadístico de los datos EFECTOS DE LA SALINIDAD EN LOS ENSAYOS REALIZADOS CON SELENASTRUM CAPRICORNUTUM Una vez determinada la conductividad 1 de los primeros lotes de muestras, resultó evidente que mucho de los vertidos tenían influencia marina, estando constituidos por aguas salobres y/o saladas. Este dato obligó a replantear la realización de ensayos con el alga unicelular de agua dulce Selenastrum capricornutum, dado el previsible efecto tóxico causado por la propia salinidad de la muestra. Aún así, se consideró de utilidad llevar a cabo este ensayo al objeto de determinar el umbral de efecto debido exclusivamente a la salinidad de la muestra, ensayándose únicamente aquellos vertidos cuya salinidad 2 (valorada a partir de su conductividad) era suficientemente baja como para no causar efectos agudos que interfirieran en la valoración de la toxicidad sistémica real, debida a otros solutos. Los resultados del ensayo de inhibición de crecimiento en Selenastrum capricornutum realizado sobre una serie de diluciones de agua marina sintética (Instant Ocean ) concluyeron lo siguiente: La concentración efectiva de sal (salinidad) que inhibe en un 50% el crecimiento del alga al cabo de 72 horas de exposición es del 6,5. Es decir, CEb,50 CE (72 h) = 6,5. La concentración efectiva de sal (salinidad) que inhibe en un 20% el crecimiento del alga al cabo de 72 horas de exposición es del 4. Es decir, CEb,50 CE (72 h) = 4. En base a estos resultados se decidió adoptar un valor umbral de efecto del 20%, por lo que no se procesaron aquellas muestras que presentaban una salinidad superior al 4. 1 Ver apartado 4.7 de este Capítulo 2 Ver apartado 4.8 de este Capítulo

7 4.6. ENSAYO DE INHIBICIÓN DE LA BIOLMINISCENCIA SOBRE VIBRIO FISCHERI Bioensayo estandarizado, rápido, simple y económico para la evaluación ecotoxicológica de aguas residuales y lixiviados de residuos, así como para disoluciones de sustancias y preparados, a través de la exposición de la bacteria marina bioluminiscente Vibrio fischeri. Su objetivo es obtener una curva de concentración-efecto a partir de la cual poder determinar la CI50 (Concentración Inhibitoria) aguda de la muestra para este microorganismo. Figura 8. Vibrio fischeri Para evitar interferencias debidas a la turbidez de la muestra, ésta se puede filtrar a través de un filtro de 0,45 µm. Si la muestra no es de origen marino, debe también salarse (al 2%). Además, para evitar que el efecto observado en el ensayo esté influenciado por el ph de las muestras, hay que ajustar el ph al intervalo 6,0-8,5. Las muestras ya preparadas y sus diluciones seriadas sucesivas (por ejemplo 1/2, 1/4, 1/8, 1/16) se ponen en contacto (por duplicado) con un volumen equivalente de un cultivo de la referida bacteria marina bioluminiscente, previamente reconstituido y activado a partir de bacterias congeladas. Tras el tiempo de contacto establecido (generalmente 15 minutos), se miden secuencialmente y se registran las intensidades de emisión luminosa iniciales y finales para cada una de las concentraciones (por duplicado), y se calcula la CI50 de la muestra por regresión lineal e interpolación en la recta correspondiente. El ensayo se realiza en bloque termostático a una

8 temperatura de 15 ºC. La expresión de resultados se realizará en términos de unidades tóxicas (U.T.), equivalente a Equitox/m MEDIDA DE LA CONDUCTIVIDAD Y DEL ph La determinación del primero de estos parámetros se realizó mediante un conductímetro equipado con celda de conductividad y sonda de temperatura (marca CRISON), previamente calibrado. Las mediciones con este equipo se realizaron introduciendo la celda de conductividad y la sonda de temperatura en la muestra, tras lo cual éste suministró el valor de la conductividad a la temperatura de referencia elegida y a la temperatura de la muestra. La medida del ph de las muestras tomadas se realizó con un ph-metro (marca CRISON) previamente calibrado. Este equipo se compone de un par de electrodos conectados a un medidor capaz de medir pequeños voltajes, del orden de milivoltios. El valor de ph se obtiene a través de la medida del potencial que alcanza un electrodo de vidrio al ser sumergido en la muestra RELACIÓN ENTRE CONDUCTIVIDAD Y SALINIDAD Al objeto de determinar la salinidad de las muestras de vertidos con influencia marina a partir de sus valores de conductividad, se procedió a la realización de un ensayo que permitiese correlacionar estos dos parámetros. Para ello, se realizaron una serie de diluciones de agua marina sintética (Instant Ocean ) y se midió la conductividad de las mismas. Los resultados de este ensayo se resumen en la Tabla 5, mientras que en la Figura 9 se representa la recta de regresión obtenida. Tabla 5. Resultados del experimento conductividad/salinidad SALINIDAD AD CONDUCTIVIDAD (µs/cm) 0 0 0, , , , , , , ,

9 Conductividad (µs/cm) SALINIDAD AD CONDUCTIVIDAD (µs/cm) Salinidad-Conductividad a T ambiente y = 1219,5x + 773,01 R 2 = 0, Salinidad ( ) Figura 9. Regresión Conductividad A partir de esta recta y de las lecturas de conductividad se calcularon los valores de salinidad de cada una de las muestras de vertidos con influencia marina.