*Olivera, M.S. 1, Brandizzi, D. 2, Carpano, M. 2, Dagrosa M. A. 2, Portu, A. 2,3, Cabrini, R.L. 2,4

Transcripción

1 BIODISTRIBUCION DEL BORO EN RATAS WISTAR. ESTUDIO COMPARATIVO DE SU CAPTACIÓN POR DIFERENTES TEJIDOS, ESPECIALMENTE CALCIFICADOS, ADMINISTRADO COMO ACIDO BORICO Y COMO BOROFENILALANINA. *Olivera, M.S. 1, Brandizzi, D. 2, Carpano, M. 2, Dagrosa M.A. 2, Portu, A. 2,3, Cabrini, R.L. 2,4 (1) Dpto. Coordinación BNCT y (2) Dpto. de Radiobiología de la Comisión Nacional de Energía Atómica (CNEA); (3) Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; (4) Cátedra de Anatomía Patológica de la Facultad de Odontología de la Universidad de Buenos Aires. olivera@cnea.gov.ar Res ume n Dada la importancia del boro en cuanto a su utilización en el tratamiento de tumores por terapia por captura neutrónica en boro (BNCT), en dónde es administrado en compuestos enriquecidos con 10 B, es necesario conocer su biodistribución en los diferentes tejidos. En nuestro estudio, nos interesamos especialmente en tejidos calcificados, con la finalidad del posible tratamiento de ciertos tumores óseos, por ejemplo, aquellos que tengan sectores en osteoformación como los sarcomas osteoblásticos. El compuesto más ampliamente utilizado en tratamientos clínicos es un complejo D-fructosa/ p- borofenilalanina (BPA). En experiencias anteriores (AATN 2014) hemos encontrado altas concentraciones de B en tejidos calcificados, cuando los animales fueron infundidos con una solución de ácido bórico. El objetivo del presente trabajo ha sido estudiar la captación de dichos tejidos y otros de importancia metabólica, administrando el boro en dosis comparativas, como dos compuestos diferentes: ácido bórico (BA) y BPA. Hemos encontrado grandes cantidades de boro en diáfisis y patela, del orden de las 200 ppm para el grupo 200 BA. Una relación tejido óseo/ hígado (o riñón) alrededor de 2.5 y relación tejido óseo/piel de entre 2 y 3 para los grupos 200 y 40 BA. Para el caso de los animales infundidos con solución de BPA, grupo 40 BPA, se encontró una relación tejido óseo/ hígado y tejido óseo/piel menor o igual a 1. Los datos obtenidos son especialmente importantes tanto para el enfoque terapéutico cómo el radiotóxico en el tratamiento con BNCT de tumores óseos. BIODISTRIBUTION OF BORON IN WISTAR RATS. COMPARATIVE STUDY OF ITS UPTAKE BY DIFFERENT TISSUES, ESPECIALLY CALCIFIED TISSUES, ADMINISTRATED AS BORIC ACID AND BORONOPHENYLALANINE. *Olivera, M.S. 1, Brandizzi, D. 2, Carpano, M. 2, Dagrosa M. A. 2, Portu, A. 2,3, Cabrini, R.L. 2,4 (1) Dept. Coordination BNCT and (2) Dept. Radiobiology, National Atomic Energy Commission (CNEA); (3) National Council of Scientific and Technological Research (CONICET); (4) Pathology Department, Faculty of Dentistry, University of Buenos Aires. olivera@cnea.gov.ar

2 Abs tract Given the importance of boron in treating tumors by boron neutron capture therapy (BNCT), in which it is administered as 10 B-enricched compounds, it is necessary to assess its biodistribution in the different tissues. Our study focuses especially on calcified tissues, in view of potential treatment for certain bone tumors, e.g. those which have sectors undergoing bone formation, such as osteoblastic sarcoma. The most widely used compound in clinical therapy is a D-fructose / p-boronophenylalanine (BPA) complex. In previous studies (AATN 2014), we found high concentrations of B in calcified tissues when animals were infused with a solution of boric acid. The aim of this study was to analyze boron uptake in these tissues and other metabolically important tissues by administrating boron in comparative doses in the form of two different compounds: boric acid (BA) and BPA. We found large quantities of boron in diaphysis and patella, in the order of 200 ppm for Group 200 BA. A bone tissue/liver (or kidney) ratio of about 2.5 and bone tissue/skin ratio of 2-3 were found for Groups 200 and 40 BA. For animals infused with BPA solution, Group 40 BPA had bone tissue/ liver and bone tissue/skin ratios equal to or lower than 1. The data obtained are particularly important to both the therapeutic approach and the radiotoxic approach in BNCT treatment of bone tumors. Introducción El boro (B), mezcla isotópica de átomos de boro de masa atómica 10 y 11, en proporción aproximada 20 y 80 % respectivamente, se halla ampliamente distribuido en la naturaleza, siendo considerado como un importante microelemento para vegetales y animales. Existen datos bibliográficos que indicarían la importancia del boro para el normal crecimiento de plantas y animales (estudios realizados en pollos, ratas, sapos), se ha documentado en conejos que afecta positivamente la fortaleza de los huesos, probablemente por modificación de la concentración de otros elementos implicados en su mantenimiento como calcio, manganeso y fósforo (1-3). Especial consideración merece la relación del boro con tejidos calcificados (huesos y dientes), hasta el momento es poco clara la intervención directa en el proceso de calcificación, tampoco hay datos precisos sobre su exacta distribución en las matrices calcificadas (2-5). En los trabajos realizados desde el año 2013 nos hemos enfocado en estudiar la biodistribución del B en tejidos óseos especialmente, administrándolo cómo ácido bórico (BA), hemos encontrado una alta captación por parte del sector diafisiario de la tibia, y en menor proporción en otros tejidos. Esto nos lleva a interesarnos en la posible aplicación de BA para el tratamiento de tumores óseos por la terapia por captura neutrónica en boro (BNCT), cuya eficacia depende en gran medida, de la relación de con ión de 10 B en el tejido tumoral respecto al tejido normal y en la cual el compuesto borado más utilizado es un complejo formado entre D-fructosa y p-borofenilalanina (6). Dentro de los tumores de hueso, el osteosarcoma es el tipo de tumor más común en cáncer de hueso en niños y adolescentes, especialmente en el rango de 10 a 19 años de edad (7). En Argentina entre , según el Instituto

3 Nacional del Cáncer (INC), la incidencia de tumores óseos en niños ha sido alrededor del 4.8 % del cáncer infantil. En este trabajo presentamos los primeros datos sobre la distribución fisiológica del B en diferentes tejidos de importancia metabólica y muy especialmente en tejidos calcificados o en vías de calcificación, administrado en dos compuestos diferentes, en un tiempo post infusión más corto que el estudiado anteriormente (8) y comparable a los tiempos normalmente practicados en trabajos realizados en ratones, hamsters, en donde se aplicó BNCT (9, 10). En el mismo sentido, Hsu y colaboradores reportaron datos de biodistribución en algunos órganos y tejidos óseos, pero con la administración de una dosis más baja que la utilizada en el presente trabajo y comparando otros compuestos (11, 12). También hemos realizado el estudio comparativo de captación de B, cuando el mismo es administrado en dosis equivalentes de B como el complejo BPA-Fru y como BA, poniendo especial interés en los resultados obtenidos en piel ya que es el órgano limitante de dosis al momento de la irradiación con neutrones. Materiales y mé todos Las experiencias se realizaron con 4 grupos de 5 ratas Wistar de entre g de peso. Las diferentes soluciones, dos de de ácido bórico (BA), una de BPA-Fru y solución fisiológica, fueron administradas por vía intraperitoneal, las concentraciones y volumen administrado de las mismas fueron tales que resultaran las siguientes dosis: 40 mg de B/ Kg animal ( grupo 40 BPA), 40 mg de B/ Kg animal ( grupo 40 BA) y 200 mg de B/ Kg animal ( grupo 200 BA), el grupo control fue infundido con solución fisiológica. Todas las soluciones fueron preparadas a ph fisiológico (~7.4) y filtradas con filtros de 0.2 µm. La solución de L-p-borofenilalanina (BPA) enriquecida en 10 B (99%) se preparó formando un complejo con D-fructosa (1:1) según lo descripto por Coderre (13). Este compuesto tiene limitada solubilidad, y fue considerada al momento de administrar dosis equivalentes de B por parte de los dos compuestos. Los animales fueron sacrificados 3 hs post infusión. En todos los casos se tomaron muestras de la diáfisis (sin médula ósea), patela (zona de crecimiento endocondral), hígado, riñón, músculo, piel y pelo (tomadas del lomo del animal) para hacer las determinaciones de boro en equipo ICP-OES (Perkin Elmer). Las muestras fueron pesadas en tubos falcon de 15 ml y luego sometidas a digestión ácida con HNO 3 65% en baño ultrasónico termostatizado a 70-80º C, durante 1 h aproximadamente. Se dejó enfriar, posteriormente se le agregó H 2 O 2 30 % y se llevó a baño ultrasónico a ~ 60º C durante 35 min. Una vez frías, fueron diluidas hasta un volumen final de 10 ml con agua MQ. También se realizaron los primeros ensayos en diáfisis con la técnica de autorradiografía desarrollada por Portu (14), para ello se hicieron cortes transversales de aproximadamente 0.5 mm. de espesor. Los cortes son colocados sobre un detector de policarbonato (Lexan) e irradiados con un haz de neutrones, luego el detector es revelado con una solución alcohólica de KOH y esto permite observar la distribución espacial del elemento, en nuestro caso el 10 B, infiriendo sobre las trazas que este genera sobre dicho detector. Res ultados

4 Hemos encontrado grandes cantidades de boro en diáfisis y patela, del orden de las 200 ppm para el grupo 200 BA. Una relación tejido óseo/ hígado (o riñón) alrededor de 2.5 y relación tejido óseo/piel de entre 2 y 3 para los grupos 200 y 40 BA. Para el caso de los animales infundidos con solución de BPA, grupo 40 BPA, se encontró una relación tejido óseo/ hígado y tejido óseo/piel menor o igual a 1. En la figura 1 se muestra la distribución natural del boro en los diferentes tejidos, observándose similar cantidad en el hueso compacto y en el pelo del animal y pequeñas cantidades en hígado, riñón y músculo. En la Figura 2, se observa la biodistribución encontrada para el Grupo 200 BA, la dosis más alta de B infundida, donde se observan cantidades similares para hígado, piel y músculo, y poco más del doble para el hueso compacto (diáfisis). Grupo Control B mg/kg tejido patela diáfisis hígado riñón piel músculo pelo F ig. 1 : D is tribución d e boro en los diferentes tejid os, 3 hs p ost infus ión, anim ales infundidos c on s olu ción fis io ló gic a. V alores prom edio, n=5 p ara todo s los tejidos, excep t p ara p elo, n= 2. Las barra s m ues tran el d esv ío están dar. Grupo 200 BA B mg/kg tejido patela diáfisis hígado riñón piel músculo pelo Fig. 2 : Distribución de boro en los diferentes tejidos, 3 hs post infusión, animales infundidos con solución de BA, 200 mg B/ Kg animal. Valores promedio, n=5 para todos los tejidos, excepto para pelo, n=2. Las barras muestran el desvío estándar. Comparativamente, entre los dos compuestos estudiados, habiéndose administrado dosis de B equivalentes, siempre se observa una cantidad de B mayor en los tejidos óseos que en los demás en el caso de BA y, al revés en el

5 caso del BPA, mayor en los tejidos blandos, especialmente en riñón y músculo (Fig 3). En los tres grupos siempre se destacó una apreciable concentración en riñón, evidencia de la eliminación del compuesto borado. Biodidstribución comparativa entre BA y BPA B mg/kg tejido ácido bórico (BA) borofenilalanina-fructosa (BPA) 10 0 patela diáfisis hígado pelo riñón piel músculo Fig. 3 : Distribución de boro en los diferentes tejidos, 3 hs post infusión, animales infundidos con solución de BA y BPA, 40 mg B/ Kg animal. El gráfico muestra el resultado prom edio de 5 animales por grupo de dosis. La piel es el órgano de gran importancia a la hora de prescribir la dosis para un tratamiento por BNCT (15), en la Fig. 4 se muestran los valores promedios encontrados para dicho órgano, comparado con aquellos obtenidos en el hueso compacto de la tibia (diáfisis) B mg/ Kg tejido BA [B] final promedio 40 BPA [B] final promedio 200 BA [B] final promedio diáfisis piel Fig. 4: Comparativo entre la cantidad de B encontrada en pie sis administradas. Relación tejido óseo/piel= 3.0 y 2.1 para 40 y 200 mg B/Kg de animal (BA) respectivamente y, tejido óseo/piel= 0.4 para el caso de 40 mg B/Kg de animal (BPA). Las autorradiografías confirman la presencia de 10 B mostrando una intensa captación en forma difusa en toda la estructura ósea, en la zona diafisiaria, la cual es una de las zonas de menor remodelación del tej seo.

6 Dis cus ión Ha sido especialmente interesante el estudio simultáneo, es decir, el análisis del contenido de boro en diferentes tejidos en un mismo animal, por un lado en condiciones naturales y con la administración de B en 3 niveles, es decir: dosis alta con BPA, condiciones equivalentes con BA y una dosis cercana a la tóxica. No hay dudas, el hueso se destaca en todos los casos explorados con ácido bórico, evidenciando la condición del B como micronutriente y su preferente captación en dosis mayores, cercana a la toxicidad. Es además evidente que hay una distribución particular y que, por lo tanto, hay órganos target en donde se acumula, aquí se puede destacar el tejido calcificado y el pelo para el caso del BA, y la piel y el músculo para el caso del BPA. Esto último concuerda con lo expuesto por Bortolussi y colaboradores, en ensayos hechos en ratas Sprague-Dawley, 4 hs post infusión, una alta captación de BPA por parte del músculo sano, aunque también por el tumor óseo (16). Estos resultados nos hacen pensar que en futuros estudios, los ensayos en animales con osteosarcoma, darían una alta relación tumor/tejido sano, dada la selectividad del BA por cada tipo de tejido. El empleo de altas dosis de ácido bórico, resulta en una alta captación por parte del tejido óseo y, a pesar de su decaimiento rápido observado en los estudios previos, vemos que en 3 hs post infusión la concentración de B sigue siendo llamativamente alta. Datos preliminares han indicado por autorradiografía del sector del hueso diafisiario, que el boro se encuentra de alguna manera mayormente en la matriz mineral. Son necesarios nuevos estudios al respecto para conocer con mayor exactitud la microdistribución espacial del boro y su eventual relación con los tejidos circundantes y especialmente el tejido tumoral, para efectos de tratamientos oncológicos. Sería necesario distinguir los cuadros osteogénicos de los puramente osteolíticos ya que, extrapolando estos resultados, los tumores osteoformadores serían los de mayor afinidad por el B. Respecto a la piel, órgano que determina la dosis de irradiación en un tratamiento, hemos encontrado como era de esperar por la naturaleza de ambos compuestos, que para dosis equivalentes de B, tiene menor afinidad por el BA y que además la relación hueso/piel es cinco veces mayor para BA que para BPA (Fig. 4), otro resultado a favor del uso terapéutico del BA en BNCT. No obstante, la mayor relación hueso/piel fue para la menor dosis de BA. También se observa una marcada diferencia en la eliminación de uno y otro compuesto, dónde dio más alta la retención de BPA que de BA en el riñón, el doble de concentración respecto uno de otro. Conclus iones Los datos aportados dejan claro que hay una captación de boro en algún sector de la matriz ósea y que esta captación es muy superior a otros órganos como los estudiados, riñón, hígado y piel. Resulta de especial interés la posible utilización BA en la terapia con 10 B, BNCT, para tumores de hueso. En general el tumor maligno óseo de mayor incidencia es el osteosarcoma, no obstante existen dos tipos los osteoformadores y otros que no lo son. En este sentido deberíamos pensar que lo ideal serían tumores que produzcan hueso, dada la alta captación de B

7 encontrada en las zonas de osificación y hueso compacto libre de médula. Además dadas las relaciones obtenidas para un compuesto y otro, y suponiendo que éstas se mantuvieran para estudios en tejidos tumorales, podríamos decir que el tratamiento por BNCT en este tipo de tumores tendría una eficacia terapéutica mayor. Nos proponemos para futuras experiencias, la determinación del microambiente donde se encontraría el B dentro del hueso, por medio de la técnica de autorradiografía. Nuevos estudios son necesarios para estudiar la distribución de boro en tumores de hueso y su relación con tejido sanos. Referencias 1. Nielsen, F.H., Nutrition Reviews, 66 (2008) Nielsen, F.H., J Trace Elem Med Biol, 28 (2014) Hakki, S.S.; Dundar N.; Kayis S.A.; Hakki E.E.; Hamurcu, M; Kerimoglu, U.; Baspinar, N.; Basoglu, A.; Nielsen, F.H., J Trace Elem Med Biol, 27 (2013) Ku, W.W.; Chapin, R.E.; Moseman, R.F.; Brink R.E.; Pierce K.D.; Adams K.Y., Toxicol Appl Pharm acol, 111 (1991) Moseman, R.F., Environ. Health Pers pec., 102 (7) (1994) Coderre, J.A.; Morris, G.M., Radiat Res, 151 (1999) Cancer Facts & Figures Olivera, M.S.; Brandizzi, D.; Carpano, M.; Dagrosa M. A.; Cabrini, R.L; AATN Molinari, A. J.; Pozzi, E.; Monti Hughes, A.; Heber, E.M.; Garabalino, M.A.; Thorp,S.I.; Miller, M.; Itoiz, M.E.; Aromando, R.F.; Nigg, D.W.; Trivillin, V.A.; Schwint, A.E., Radiation Res earch, 177 (2012) Carpano, M.; Perona, M.; Rodriguez, C.; Nievas, S.; Olivera, M.; Santa Cruz, G.A.; Brandizzi, D.; Cabrini, R.; Pisarev, M.; Juvenal, G.J.; Dagrosa, M.A., Int J R adiat Oncol Biol Phys, 93 (2015) Hsu, C.F.; Lin, S.Y.; Peir, J.J.; Liao, J.W.; Lin, Y.C.; Chou, F.I., App. Radiat. Is ot., 69 (2011) Chou, F.I.; Chung, H.P.; Liu, H.M.; Chi, C.W.; Lui, W.Y., Is ot., 67 (2009) S150-S108. App. Radiat. 13.Coderre, J.A.; Chanana, A.D.; Joel, D.D.; Elowitz, E.H.; Micca, P.L.; Nawrocky, M.M.; Chadha, M.; Gebbers, J.; Shady, M.; Peress, N.S.; Slatkin, D.N., Radiation Res earch, 149 (1998)

8 14.Portu, A.; Bernaola, O.A.; Nievas, S.; Liberman, S.; Saint Martin, G., Rad. Meas., 46 (2011) Hiratsuka, J.; Fukuda, H.; Kobayashi, T.; Karashima, H.; Yoshino, K.; Imajo, Y.; Mishima, Y., Radiation Res earch, 128 (1991) Bortolussi, S.; Postuma, I.; Protti, N.; Ballarini, F.; Carante, M.; De Bari, A.; Bruschi, P.; Ferrari, C.; Cansolino, L.; Zonta, C.; Clerici, A.M.; Ciani, L.; Ristori, S.; Panza, L.; Gonzalez, S.J.; Galasso, O.; Gasparini, G.; Altieri, S., 16 th ICNCT, 2014, Finland.