ARA-CANTHUS: PUEDEN LOS GENES DE

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1 ARA-CANTHUS: PUEDEN LOS GENES DE Arabidopsis AFECTAR EL METEBOLISMO SECUNDARIO DE Catharanthus? Cázares Flores, Paulo E.; de Folter, Stefan & Marsch Martínez, Nayelli Facultan de Ciencias Químicas Universidad Autónoma de Querétaro / Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, Unidad Irapuato RESUMEN Durante las últimas décadas ha habido un gran interés en conocer y manipular las rutas biosintéticas de diversos compuestos con actividad biológica sintetizados por las plantas. Catharanthus roseus es una de las fuentes más importantes de estos compuestos la cual produce poderosos antineoplásicos: Vincristina y vinblastina. Debido a que los métodos alternativos como la síntesis química son muy costosos, las plantas siguen siendo la mejor fuente de estos compuestos. El objetivo principal de este proyecto es estudiar de que manera genes involucrados en la floración de Arabidopsis thaliana pueden afectar el metabolismo secundario de Catharanthus roseus principalmente en las rutas involucradas con la síntesis de alcaloides. Para llevar a cabo este proyecto se propone realizar construcciones de sobreexpresión inducibles de los diversos genes seleccionados y transformarlas en un cultivo de raíces mediante Agrobacterium rizhogenes, finalmente cuantificar los niveles de alcaloides mediante HPLC. INTRODUCCIÓN Catharanthus roseus (Periwinkle), originaria de Madagascar, es un sub-arbusto perenne del cual se han aislado diversos compuestos antineoplásicos como la vincristina y la vinblastina. La vincristina es un poderoso alcaloide que se une a la tubulina impidiendo la polimerización de los dímeros de tubulina, interrumpiendo la formación de los microtúbulos (Warber, S. 1999) los cuales son críticos para la formación del huso en las células que se preparan para la mitosis. La formación del complejo tubulina-alcaloide trae como consecuencia que la célula sea detenida en la fase M del ciclo celular (Warber, S. 1999). Los alcaloides están formados por diversas clases de compuestos nitrogenados los cuales se encuentran en muchas plantas y normalmente exhiben actividad fisiológica (Hughes, E. 2002). Su biosíntesis dentro de las plantas ha atraído la atención de diversos grupos de investigación, ya que representa uno de los más grandes retos de la ingeniería metabólica, hasta ahora solo se conocen 20 de los 50 pasos requeridos en la síntesis de los alcaloides más importantes de Catharanthus roseus (Loyola-Vargas y col. 2007). Una de las alternativas para aumentar la producción de estos compuestos, es el uso de cultivo de tejidos, principalmente el de raíces, ya que no se necesita de toda la planta completa y se puede mejorara el tiempo de generación de biomasa bajo condiciones que son controladas. El reto se encuentra en que cada uno de los pasos enzimáticos de la ruta metabólica de Catharanthus roseus normalmente se encuentra en compartimentos específicos de la planta (Hughes, E. 2002), esto quiere decir que para poder obtener la vincristina se necesita de toda la planta. Los órganos que forman el cuerpo de la planta consisten en diferentes tipos de células, los cuales están organizados en relación uno a otro, lo cual confiere funciones específicas formando un órgano (St-Pierre y col. 1999). En adición a la morfogénesis, el proceso de

2 desarrollo resulta en una especialización bioquímica de las células para la biosíntesis y/o acumulación de metabolitos secundarios (St-Pierre y col. 1999). Fig1. Ruta biosintética de alcaloides tipo indol de Catharanthus roseus Fig. 2 Ubicación de las enzimas involucradas en la ruta biosintética, según el estudio realizado por St-Pierre y col 1999 Por otra parte se ha demostrado que el tratamiento con metil-jasmonato MJ, el cual es una fito-hormona producida por la planta, aumenta la acumulación de alcaloides en plántulas de C. roseus (Loyola-Vargas y col. 2007). El factor de transcripción con dominio AP2/ERF ORCA3, controla la expresión responsiva a ácido jasmónico AJ de algunos genes involucrados en el metabolismo primario y secundario de C. roseus (Van der Fits y col 2000). Por lo cual en este proyecto se desean analizar más genes de la misma familia de factores de transcripción tipo AP2, y conocer más acerca del metabolismo secundario de Catharanthus roseus. OBJETIVO GENERAL Determinar si los genes de Arabidopsis thaliana involucrados en la floración, principalmente factores de transcripción tipo AP2, pueden afectar el metabolismo secundario de Catharanthus roseus principalmente en las rutas involucradas en la síntesis de alcaloides. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Realizar las construcciones de sobre-expresión inducible y constitutiva de los diferentes genes de Arabidopsis thaliana. ᵝ

3 Transformar Catharanthus r. mediante Agrobacterium r. Crecer el cultivo de raíces en un biorreactor Cuantificación de los alcaloides mediante HPLC ᵝ Parte del trabajo que se tiene concluida. EXPERIMENTAL Se realizó la construcción del plásmidos de sobre-expresión constitutiva con el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor Sobre-expresión con 35S A partir de 2 plásmidos diferentes, el pbi121 y el pgem-t se realizaron digestiones con el fin de extraer del plásmido pgem-t el gen de nuestro interés y ligarlo dentro del vector pbi121 donde se encuentra el promotor constitutivo 35S. Después de las digestiones se paso a correr la muestra dentro de un gel de Agarosa al 1% y de ahí cortar las bandas correspondientes al gen y al vector para después purificarlas y mediante una reacción de ligación unir los 2 fragmentos. Una vez que se tuvo el plásmido listo se paso a transformar células de E.coli DH5α en cajas de LB/kanamicina 50mg/L para reproducir nuestro plásmido. Se corroboró mediante PCR de colonia con primers específicos para el gen AP2. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 4kb 2.5kb 1kb pbi121 Gen / Factor de transcripción tipo AP2 Fig. 3 Electroforesis en gel de agarosa 1% se muestran las bandas correspondientes al gen AP2 y el pbi121 En el resultado de la digestión se puede ver claramente como la banda corresponde al marcador de peso molecular lo cual nos indica que tuvimos una digestión exitosa. Una de las partes más difíciles se encontró al momento de hacer la purificación de las bandas, ya que teníamos una cantidad muy pequeña de DNA el cual no era suficiente para

4 hacer la ligación. Se encontró que el problema era que las soluciones que se utilizaban eran demasiado viejas, por lo cual se opto por preparar nuevas soluciones, lo cual mejoro bastante el resultado ya que tuvimos ligaciones positivas, como se puede observar en la figura no kb 1kb Gen/Factor de transcripción AP2 Fig. 4 Electroforesis en gel de agarosa 1% se muestran las bandas correspondientes al PCR de colonia de 10 muestras CONCLUSIONES El proyecto sigue en marcha, solo se cuenta con una de las 2 construcciones de sobreexpresión necesarias. Catharanthus roseus representa un reto muy grande para la ingenieria metabólica, ya que muchos de sus compuestos no se pueden obtener mediante síntesis química, ya que sería demasiado costoso y no tendrian la misma actividad biológica. La transformación de plantas y el cultivo de tejidos son una alternativa muy atractiva, pero hasta que no se conozca las enzimas involucradas y los lugares específicos de su síntesis y sobre todo sus reguladores genético sigue habiendo lugar para más investigación.

5 REFERENCIAS Hughes, E., Shanks, J.V. Metabolic engineering of plants for alkaloid production Metabolic Engineering 4, 41-48, Loyola-Vargas, V., Galaz-Ávalos, R., Kú-Cauich, R. Catharanthus biosynthetic enzymes: the road ahead Phytochem Rev 6, , 2007 St-Pierre, B., Vazquez-Flota, F., De Luca, V. Multicellular compartmentation of Catharanthus roseus alkaloid biosynthesis predicts intercellular translocation of pathway intermediate The plant cell Vol 11, , 1999 Van der Fits, L., Memelink, J. ORCA3, a jasmonate-responsive transcriptional regulator of plant primary and secondary metabolism. Science 289, , Warber, S. Models of action at target site, Natural products from plants USA:CRC Press, , 1999.