TECNICAS DE FERTILIZACIÓN IN VITRO SEMINARIO DE PROFUNDIZACIÓN ERIKA JULIETH SALGADO CRUZ

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1 1 TECNICAS DE FERTILIZACIÓN IN VITRO SEMINARIO DE PROFUNDIZACIÓN ERIKA JULIETH SALGADO CRUZ UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA VILLAVICENCIO 2018

2 2 TECNICAS DE FERTILIZACIÓN IN VITRO SEMINARIO DE PROFUNDIZACIÓN ERIKA JULIETH SALGADO CRUZ ASESOR RICAUTE LOPERA VÁSQUEZ MVZ, Esp, MSc, PhD UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA VILLAVICENCIO 2018

3 3 TÉCNICAS DE FERTILIZACIÓN IN VITRO IN VITRO FERTILIZATION TECHNIQUES Erika J Salgado Cruz 1 (Universidad Cooperativa de Colombia) RESUMEN La producción de embriones in vitro es una técnica utilizada para la multiplicación de líneas de animales genéticamente superiores. Para obtener embriones viables, es necesario un protocolo que brinde las pautas necesarias de producción in vitro con el uso de medios de cultivo, tiempo y condiciones ambientales que simulen el escenario real de la producción natural de embriones en la madre y así lograr resultados eficientes. (Calva Guaman & Guaman Gutierrez, 2015). Esta producción de embriones consta de 3 etapas, maduración in vitro (MIV) de los ovocitos, fecundación in vitro (FIV) y cultivo in vitro (CIV) de los posibles cigotos, las cuales pueden ser desarrolladas por diferentes técnicas pero siempre manteniendo la temperatura, ph Y CO2 requerido para cada procedimiento. (Palma, 2008). La finalidad de estos embriones dependerá de las necesidades del productor, es por esto que se brindan diferentes alternativas como ser transferidos, criopreservados, vitrificados, clonarse o someterse a efectos de ingeniería genética (Reyes 1995). PALABRAS CLAVE: Maduracion in vitro, fertilización in vitro, capacitación espermática, cultivo invitro, medios de cultivo.

4 4 ABSTRACT In vitro embryo production is a technique used for the multiplication of genetically superior animal lines. To obtain viable embryos, a protocol is necessary that provides the necessary in vitro production guidelines with the use of culture media, time and environmental conditions that simulate the real scenario of the natural production of embryos in the mother and thus achieve efficient results. (Calva Guaman & Guaman Gutierrez, 2015) This production of embryos consists of 3 stages, in vitro maturation (IVM) of the oocytes, in vitro fertilization (IVF) and in vitro culture (IVC) of the possible zygotes, which can be developed by different techniques but always maintaining the temperature, Ph and CO2 required for each procedure. Palma. G, (2008). The purpose of these embryos will depend on the needs of the producer, which is why different alternatives are offered such as being transferred, cryopreserved, vitrified, cloned or subjected to genetic engineering. Reyes. S (1995). KEYWORDS: In vitro maturation, in vitro fertilization, sperm capacitation, invitro culture, culture media.

5 5 INTRODUCCIÓN La industria de la (TE) bovina fue establecida en Estados Unidos en los inicios de los años 70, aproximadamente 80 años después de la primera transferencia de embriones exitosa reportada en mamíferos. (Larocca, 1999).Para esta época, el creciente campo de TE puede considerarse como la contraparte femenina de la inseminación artificial. Sin embargo, el avance en el desarrollo de técnicas de transferencia de embriones en comparación a la IA ha sido lento. Durante los últimos 10 años, la TE ha continuado realizando avances importantes, sobre todo en la producción in vitro de embriones y en las técnicas de manejo embrionario (Hafez, 2003). Se han encontrado varios estudios en los cuales han utilizando diferentes técnicas de FIV, dando la posibilidad de ser utilizados con fines de estudio (desarrollo embrionario temprano, transgénesis, clonación) o mejor aun con propositos comerciales. El desarrollo de nuevas biotecnologías para producir animales transgénicos, o para la multiplicación in vitro de selección de animales genéticamente superiores, se basa en el avance de las técnicas de fertilización in vitro (FIV) y en el cultivo de embriones. Fernández. A. et al. (2007). El objetivo de este trabajo es recopilar las técnicas mas utilizadas en cada procedimiento de la fertilización in vitro además, de sugerir al lector la técnica mas apropiada o que por algunos estudios ha dado mejores resultados.

6 6 TECNICAS DE FERTILIZACIÓN IN VITRO El proceso de producción in vitro de embriones bovinos puede dividirse en tres pasos fundamentales, los cuales son: Maduración in vitro Fertilizacion in vitro Cultivo in vitro Estos tres pasos, comprenden una compleja serie de procesos fisiológicos, muchos de los cuales son aún desconocidos, condicionando cada uno el éxito o el fracaso del siguiente. Peláez (2011). A continuación, se hará énfasis las técnicas disponibles para cada paso: Maduración in vitro: El éxito de la fecundación, división y desarrollo embrionario depende en gran parte del desarrollo de los ovocitos madurados in vitro. Aponte. J, et al. (2010). Cerca del 95% de los ovocitos puede alcanzar la maduración y de ellos aproximadamente el 80% el estadio 2 de células en condiciones óptimas, sin embargo, solo la mitad alcanza al estado blastocisto. Palma, (2008). Estos porcentajes se pueden ver altamente afectados por muchos factores; entre estos la temperatura, el tiempo de transporte desde su colecta hasta la llegada al laboratorio, el tamaño y diámetro del ovocito, su etapa de desarrollo, tiempo de maduración, composición del medio y sueros utilizados. Otros factores que se debe tener en cuenta en la maduración son osmolaridad, ph, temperatura y hormonas. Dentro de las técnicas de maduración de ovocitos Gonzales, P. (1992) suguiere que para el cultivo de estos se debe tener en cuenta: el soporte físico sobre el que se va a realizar la

7 7 maduración (placa, tubo, etc.), modo de colocación del método de cultivo, el número de oocitos por volumen de medio y si el cultivo se realiza de manera estática o con un ligero movimiento. Por otro lado, Lorenzo. P., (1992) indica dos métodos de cultivo: un cultivo en el que no se permite el intercambio gaseoso con la atmósfera, mediante el uso de un cierre hermético y un segundo tipo de cultivo que se realiza manteniendo un intercambio gaseoso continuo. El primero no es de mayor importancia puesto que no permite el intercambio gaseoso, necesario para la maduración de los oocitos, mientras que dentro del segundo grupo se pueden citar dos tipos: los sistemas abierto y cerrado. En el sistema abierto, se coloca el medio de cultivo en un recipiente que este en contacto directo con la atmosfera (placas Petri, cámaras de cultivo, tubos de cristal, etc.). El problema de esta técnica es que presenta una gran superficie de evaporación, la cual causa una elevación de la concentración de sodio y consecuente a esto un aumento de la osmolaridad; en cambio, en el sistema cerrado se recubre el medio de cultivo con aceites minerales, para evitar la evaporación del medio y permitir el intercambio gaseoso con la atmosfera. Aponte. J, Et Al. (2010) cita que el éxito de la fecundación, división y desarrollo embrionario depende en gran parte del desarrollo de los ovocitos madurados in vitro es por eso que se debe tener en cuenta el tiempo de maduración, ya que un tiempo inapropiado puede causar la formación anormal de la cromatina, el envejecimiento del ovocito y un desarrollo comprometido del mismo.

8 8 Fertilización In Vitro: Luego de tener los oocitos madurados por 24 horas se continua con la fertilización, donde la capacitación espermática es uno de los pasos mas importantes. La gran mayoría de estudios iniciales sobre fertilización in vitro, no fueron exitosos debido a que los espermatozoides no se encontraban capacitados de forma adecuada. González. N. (2000). Selección y Capacitación Espermática: Como se menciono anteriormetne un paso muy importante en la fertilización in vitro es la selección y capacitación espermática, ya que como su nombre lo dice permite la selección y adecuación de los espermatozoides de mejor condición para que lleven a cabo el proceso de fertilización. Existen cuatro técnicas para separar espermatozoides móviles y viables; las más utilizadas en Latinoamérica son: migración espermática como el procedimiento de Swim-Up, lavado selectivo de subpoblaciones a través de centrifugación de gradientes de densidad como Percoll, Auquilla. (SF)., que bajo diferentes fundamentos buscan los mismos objetivos. Palma. G. (2008). Uno de estos es separar los espermatozoides del líquido seminal y del diluyente, por otro lado, obtener los espermatozoides con un mínimo de 70% de motilidad rectilínea progresiva. Palma. G. (2008). Otras técnicas de capacitación espermática son la migración a través de una columna de ácido hialurónico Gardon, J.C. et al. (2001). y el empleo de sustancias adhesivas para eliminar espermatozoides muertos, como la filtración de fibra de vidrio o filtración de columnas Sphadex. Hernández. J. et al. (2015).

9 9 Método de Swim-Up: Esta técnica se basa en la capacidad migratoria de los espermatozoides por sus propios movimientos cuando son incubados en un medio de cultivo a 39 C. Palma. (2008). el procedimiento de esta consiste en colocar 1 ml de sperm-tl en seis tubos estériles de cristal (12 x 75 mm), previamente mantenidos a 39 C. Se introducen 0,25 ml de semen bajo el sperm-tl en cada tubo, utilizando para ello una pipeta estéril. Seguidamente, los tubos se llevan cuidadosamente a la incubadora de CO 2 donde se mantienen con una inclinación de 45, durante 1 hora a 39 C, 5% de CO 2 y 100% de humedad en el aire. Gonzales. (1992). Esto con el objetivo de que los espermatozoides con mejor motilidad puedan ascender el sobrenadante. Benavides (2008), cita que después de realizar el procedimiento anterior se deberá colocar los espermatozoides seleccionados en heparina durante 15 minutos para activar la capacitación. El ph del medio de cultivo debe ajustarse a 7.4 para la capacitación y 7.8 para la fecundación. Ventajas - Técnica sencilla - Usualmente se obtiene una fracción muy limpia y motil de espermatozoides Desventajas - Limitado a semen con altos valores de concentración, motilidad y vitalidad. - Bajo rendimiento - Disminución de espermatozoides con cromatina con condensación normal.

10 10 - Empleo de numerosos tubos plásticos descartables. Palma. (2008). Gradientes de Densidad: esta técnica se basa en la separación de los espermatozoides por medio de la sedimentación-centrifugación. Estas células son sedimentadas en un gradiente que se encuentra en equilibrio equivalente con su propia densidad; lo cual permite seleccionar a los espermatozoides viables y que estos lleguen al fondo del tubo, además de actuar como filtro para el plasma seminal, células redondas, detritos y aquellos espermatozoides con movilidad no progresiva. Auquilla. (S.F). Los métodos de sedimentación pueden ser de gradiente continuo o discontinuo, entre los que se encuentran Ficoll, que se dejó de usar, Bovipure, Puresperm, Percoll, entre otras. Mediante este último método los espermatozoides son seleccionados según su motilidad. Esta es una solución silica coloidal con una osmolaridad de mosm, una densidad de 1,123 ± 0,003g/ml y un ph fisiológico. Para la separación de los espermatozoides se emplea en concentraciones de 45% y 90% o 30% 45% y 90%, diluidas en medios de capacitación. El tiempo de centrifugación es de 10 a 20 min en tubos Eppendorft de 1,5 ml en 2 fracciones (45%-90%) a 700 revoluciones/min. Palma. (2008).

11 11 Ventajas - Usualmente se obtiene una fracción de espermatozoides limpia y motil - Puede separar espermatozoides con muy baja concentración Desventajas - Riesgo potencial de endotoxinas - Requiere lavados repetidos - Requiere experiencia y mayor tiempo de preparación - Elimina leucocitos y detritus Palma. (2008). Arias. M, y compañía. (2017), realizaron un estudio donde obtuvieron como resultados que la separación por el método de Percoll logra una mayor proporción de espermatozoides con plasma intacto y membranas acrosomicas (89.8 y 87.5%,) así como por Swim-up (74.9 y 63.3%, respectivamente), la separación de espermatozoides bovinos utilizando gradiente de densidad mejora los parámetros de motilidad y función espermática sin afectar la expresión génica. Método de fibra de vidrio: La filtración con fibra de vidrio es un método poco empleado en producción de embriones animales. Palma. (2008). Contrariamente con los métodos anteriores no consiste en la selección por medio de la densidad y motilidad si no en la capacidad del material para retener los espermatozoides muertos o con defectos, haciendo que solo los móviles puedan atravesar la fibra. El procedimiento de esta técnica se basa en colocar una pequeña cantidad de fibra de vidrio en el interior de una jeringuilla, y se lava con el medio de cultivo. Varela. G.,E. et al. (2015). Por esta columna, se filtra por gravedad el semen fresco o lavado, y se

12 12 lava con un pequeño volumen de medio de cultivo para recuperar los que están en buenas condiciones. Este sistema no está aconsejado cuando se parte de muestras sucias o con intensa oligoastenozoospermia. Sin embargo, el filtrado en fibra de vidrio se realiza más rápidamente que las técnicas anteriores, suscitando una menor pérdida de espermatozoides, siendo muy eficaz en muestras con gran viscosidad. Grunewald et al., (2007). Los productos más probados en la práctica clínica humana es SpermFertil. Varela. G.,E. et al. (2015) Ventajas - Se pueden separar los espermatozoides de eyaculados de muy baja calidad - Buena recuperación de Desventajas - El filtrado no es tan limpio como con los otros métodos - Algunas bridas celulares permanecen. espermatozoides móviles (<85%) - Los leucocitos son casi totalmente eliminados Método en columnas de Spandex: Son unas columnas especiales para la separación de las fracciones móviles de los espermatozoides. Para esta técnica se requiere de un filtro inerte, el cual toma forma rugosa al ser hidratado, el cual ayuda a atrapar los espermatozoides muertos o de baja motilidad. Esta técnica cuentan con diferentes protocolos, algunos realizan una selección previa con la centrigugacion del semen en un gradiente de Percoll

13 13 40% y tras lavar y diluir la fracción de espermatozoides se filtra en la columna, otros directamente aplican la muestra de semen en la columna de filtrado una vez lavado y diluido en el medio de cultivo. Reproducción asistida. (S.F) Al momento de realizar la selección espermática se procede hacer la capacitación, estos mecanismos son poco conocidos, pero se sabe que provocan cambios estructurales y bioquímicos que conducen la eliminación de componentes adheridos a la membrana del espermatozoide, cambio de la composición lipídica de la membrana espermática (Bedford, 1991; Palma 2001), aumento de la permeabilidad a los iones Ca2+, cambio en el ph interno y un incremento en la permeabilidad y metabolismo celular. Reproducción asistida. (S.F) Entre los agentes inductores de la capacitación espermática se conocen los siguientes: - Células del cumulo: estas celulas son potentes estimuladores para los espermatozoides, debido a que son atraídos hacia la cubierta ovocitaria para que estas sean penetradas. Gracias a la liberación de hormonas esteroideas se induce el influjo de calcio y provoca una serie de respuestas esenciales para la fecundación, tales como la activación, reacción acrosómica y quimiotaxis hacia el ovocito.barbera. V. (2014). - Medio Tyrode libre de calico: Este medio se trata de una solución salina con cloruro sódico y potásico, sulfato de magnesio y bicarbonato sódico (ph: 7,6). Debido a la presencia de estos iones, la osmolaridad y el ph permiten las modificaciones de membrana que favorecen la entrada de calcio. Coy. P. (2002).

14 14 - Albumina sérica bovina (ASB): Se ha observado que la albúmina es un posible inductor de la capacitación espermática en mamíferos, ya que juega un papel clave en la eliminación del colesterol y zinc de los espermatozoides, además de que reducen los contenidos de esteroles en las células y afecta el nivel de los fosfolípidos de la membrana. Barbera. V. (2014) - Heparina y otros glucosaminoglucanos (GAG): La heparina es el GAG más potente a la hora de inducir la capacitación en espermatozoides bovino. Dapino et al., (2006)., ya que se une a la membrana mediante la unión de proteínas procedentes del plasma seminal, reduciendo la actividad del calcio-atpasa y permitiendo la entrada de calcio extracelular. Barbera. (2014). Esta induce la capacitación espermática, siendo su acción notada al inicio del proceso de incubación. Ortiz. D. et al. (2002) - Aminoácidos y catecolaminas: Los aminoácidos y las catecolaminas más comúnmente utilizadas son: hipotaurina, penicilamina y epinefrina (PHE). La hipotaurina se trata de un Beta-aminoácido azufrado el cual permite mantener una buena motilidad espermática, así como incrementar la motilidad y penetración del ovocito. Barbera. (2014). - Ionoforos: El ionóforo calcio suplementan el medio de capacitación ayudando a abrir los canales de calcio, de igual forma activa la reacción acrosómica, facilitando la penetración espermática al oocito. Ortiz. D. et al. (2002)

15 15 - Cafeína: Niwa & Ohgoda (1988) indican, que el uso de la cafeína provoca hipermotilidad espermática, además de tener un efecto sinérgico con la heparina, incrementando las tasas de penetración A continuación, se evidencia una tabla donde se compara el tiempo de incubación de espermatozoide con los diferentes métodos de capacitación: Avances de la medicina veterinaria. (1994) Cabe resaltar que, aunque existan varias técnicas de capacitación espermática, la heparina es uno de los componentes más confiables. Benavides. R. (2008) Después de lograda la capacitación espermática, se procede a la determinación de la concentración espermática, la cual permitirá evaluar la cantidad de espermatozoides aproximados que serán reunidos junto con los oocitos ya madurados. Para el conteo y la dilución de los espermatozoides se utiliza una dosis inseminante 1-6 millones de espermatozoides por ml de medio de fecundación, esto dependerá del protocolo utilizado.

16 16 Peláez. V. (2011). Posteriormente, se depositan los espermatozoides junto con los óvulos en medio de fertilización, de 18 a 24 horas en un ambiente de alta humedad y protegidos de la luz. Palma. (2001). Para llevar a cabo la fertilizacion in vitro puede utilizarse distintos medios, como son el TALP o el M199, los cuales pueden ir suplementados por distintos componentes, como células oviductales, células del cúmulus, cafeína o heparina. Como ocurría en los medios de maduración y capacitación, las suplementaciones en los medios de fecundación también son diversas. Cultivo de embriones: Al día 3 de haber realizado la fertilizacion se procede a observar el estado de los embriones, aquellos de 4 o más células resultantes de la fertilización se pasan a un medio de cultivo embrionario para que continúen con su división celular a 8, 16 y 32 células y llegar a mórulas y blastocistos. Peláez. V. (2011) con la finalidad de producir y seleccionar aquellos embriones con las mejores cualidades para aumentar el porcentaje de gestaciones. Pichardo. J (2016). Estos medios tienen la función de proporcionar condiciones optimas para el desarrollo del embrión. En general, los medios contienen sales inorgánicas (NaCl, KCl), fuentes energéticas (glucosa, piruvato y lactato de sodio), amortiguadores de ph (NaHCO3). Rodríguez. J. (2012) y una fuente de proteína que generalmente es la albúmina sérica bovina (ASB) o suero fetal bovino (SFB). Souza; Paramio. (2012;2016). Como lo cita Peláez. V. & Crespo. J. (2011;2015). Los medios utilizados para el cultivo de los embriones bovinos han sido clasificados en tres categorías: indefinidos, cuando se utiliza suero y cocultivo con células somáticas; semidefinidos, cuando se omite el cocultivo

17 17 y el suero se reemplaza por albúmina sérica; y definidos, cuando el suero se reemplaza por macromoléculas como el polivinil alcohol o la polivinil pirrolidona. Indefinidos: como se mencionó anteriormente esta técnica consiste en utilizar suero y cocultivo de células. El cocultivo de embriones con células somáticas ha sido utilizado extensamente para estimular el desarrollo in vitro de embriones. Camous. S. et al.; Rexroad; Bosh. P. (1982;1989;2006). Los dos tipos celulares más utilizados para el cocultivo de embriones son: células de la granulosa y células epiteliales de oviducto. Edwards.L. et al; Rodriguez. J et al.; (1997;2017). Lopera. R. (2015) cita que además de estas células somáticas se puede utilizar cocultivos con hígado de rata de búfalo y células vero, en medios con suero fetal bovino. La ventaja de este método es la disminución del estrés oxidativo, ya que las células somáticas utilizan parte del oxígeno, disminuyendo el estrés ambiental al que se podría enfrentar los embriones. León. D, et al; López. A, et al; Brookes. (2014; 2007; 2005). Por otro lado Herrandon y compañia (2007) indica que esta metodología, tiene unelevado riesgo de incorporar patógenos durante el cultivo, además de que dificulta el conocimiento de las necesidades de los embriones durante sus etapas de desarrollo temprano. No obstante cita a varios autores donde estos concluyen que si la composición del medio de cultivo es adecuado y la tensión de O2 es reducida, se puede lograr altos procentajes de desarrollo embrionario en ausencia de células somáticas. Semidefinidos: un medio de cultivo semidefinido empleado en la producción de embriones in vitro es la albumina sérica bovina (BSA), la cual mejora la maduracion y desarrollo embrionario debido a que facilita el trasporte de fluidos a través de la membrana celular; del mismo modo actua en la barrera de ph como surfactantes y promueve el reinicio de la

18 18 meiosis. Santa Cruz et al. (2014). Se ha implementado la eliminación de suero y cultivo de celulas somaticas para la sustitución de BSA, obteniendo un buen desarrollo embrionario. Goovaerts. C; Sung. L (2012;2004). Krisher. R & Colaboradores. (1999) citan que otra alternativa de cultivo ha sido incluir BSA o suero durante solo una parte del periodo de cultivo del embrion (sistemas de cultivo en dos pasos ), y el resto de cultivo libre de proteínas. Krisher. R. et al. (1999). Definidos: Mucci. M & compañía (2006) citan que el uso de polímeros sintéticos, como el alcohol polivinílico y la polivinilpirrolidona, se ha venido implementando hace varios años en la producción in vitro de embriones, debido a que tiene buena actividad surfactante, siendo esta similar a la albúmina. No obstante se ha observado una menor tasa de producción de embriones y diferencias metabólicas importantes entre embriones cultivados con o sin estos componentes. Con el fin de reemplazar la albumina o el suero se ha utilizado otro compuesto como el hialuronato, el cual ha obtenido resultados alentadores en cuanto a tasa de producción y sobrevida poscriopreservacion. Stojkovic M; Bloque J. (2002; 2009).

19 19 CONCLUSIONES Las diferentes técnicas de fertilización in vitro permite a los laboratorios de reproducción asistida seleccionar cual de estas desea aplicar, esta selección va de acuerdo a los resultados, facilidad y presupuesto. Actualmente, se tiene la facilidad de obtener los medios en diferentes laboratorios, donde estos ya han sido probados y se tiene un porcentaje viable en los resultados; sin embargo, el manejo de las técnicas y los requerimientos necesarios para cada etapa de la fertilización hace que varie cada uno de estos, haciendo que la obtención de embriones viables sea mas complejo. Como se pudo observar en el presente trabajo, existen diferentes técnicas para cada paso de la fertilización in vitro, la elección de cada una de estas debera ser muy cuidadosa, pues de esta dependerá el éxito o el fracaso del siguiente paso. Además de tener un conocimiento sobre las tecninas, medios y la suplementación de estos; se debera tener en cuenta otros factores como la temperatura, atmosfera de gases, ph, y tiempo que se debe llevar en la incubadora, puesto que estas condiciones son de vital complemento para el desarrollo de los embriones.

20 20 LISTA DE REFERENCIAS 1. Aponte, J. A., Villamediana, P. C., Fonseca, H. J., & Belloso, E. S. (2010). Efecto del tiempo de maduración in vitro de ovocitos bovinos sobre la progresión meiótica. Nota técnica. Redalyc, Arias.E, Andara. K, Briones. E & Felmer. R. (2017). Bovine sperm separation by swim-up and density gradients (percoll and bovipure): effect on sperm quality, function and gene expression. Volume 17, Issue 2, Pages Auquilla. C., (S.F). Evaluación de las técnicas swim up y gradientes de densidades para la capacitación espermática en la clínica BioGEPA. 4. Barbera. V.(2014). Efecto de la albúmina sérica bovina sobre la capacitación del semen de conejo. 5. Benavides, T. R. (2008). Evaluación de tres protocolos de capacitación espermática bovina in vitro a través de la penetración oocitaria. Trabajo de grado 6. Bearden, H. & J. Fuquay. (1982) Reproducción animal aplicada. Manual Moderno. México D. F. pp Block J1, Bonilla L, Hansen PJ. E. (2009). ffect of addition of hyaluronan to embryo culture medium on survival of bovine embryos in vitro following vitrification and establishment of pregnancy after transfer to recipients. Theriogenology Bosch. P, Blanch. M, Ferrero. S, Diaz. H, Piccatto. H & Bosch. R. (2006). Desarrollo de Embriones Caprinos In Vitro: Efecto del Co-Cultivo con Células Epiteliales de Oviducto. Rev. Cient. (Maracaibo) v.16 n.3 Maracaibo

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