INTERLEUCINA 18 (IL-18) Y SU RECEPTOR (IL-18Rα) EN LA CARCINOGÉNESIS CERVICAL

Transcripción

1 INTERLEUCINA 18 (IL-18) Y SU RECEPTOR (IL-18Rα) EN LA CARCINOGÉNESIS CERVICAL Jiménez-Wences Hilda 1, Padilla-Islas Fabiola 1, Martínez-Carrillo Dinorah Nashely 1, Romero- Neri Patricia 2, Illades-Aguiar Berenice 1, Fernández-Tilapa Gloria 1. 1 Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero, 2 Clínica de Displasias Alameda, Chilpancingo, Guerrero. wences2009@hotmail.com RESUMEN Determinar la expresión del mrna de la IL-18 y de la cadena α de su receptor (IL-18Rα) en lesiones premalignas y cáncer del cérvix uterino. Entre agosto de 2005 y abril de 2006, se analizaron 225 muestras de cdna de las cuales 192, procedían de casos de lesión premaligna o cáncer cérvico uterino (CaCU), diagnosticados por histopatología, distribuidos en tres estratos: a) lesión escamosa intraepitelial de grado bajo (LEIGB) n= 119, b) lesión escamosa intraepitelial de grado alto (LEIGA) n= 38 y c) CaCU n= 35. Se incluyeron también 33 muestras de raspados cervicales provenientes de mujeres citológicamente normales (CN). La expresión del mensajero de la IL-18 y de IL-18Rαse detectó mediante RT-PCR utilizando oligonucleótidos específicos para cada gen, como control positivo para IL-18 se utilizórna de células HeLa y para IL- 18Rαse utilizórna células mononucleares de sangre periférica de una paciente con Leucemia Granulocítica Crónica. La proporción de muestras que expresaron el mrna de IL-18, fue mayor en los estratos de CN y CaCU con un 45.7% y 48.5% respectivamente, mientras que sólo el 27.7% de muestras de LEIGB y 23.7% de aquellas con LEIGA expresaron ese mensaje. De las 225 muestras, sólo el 0.9% expresaron IL-18Rα; todas con diagnóstico de CN. La presencia del mrna de la IL-18 se detectóen los 4 estratos, sin embargo la expresión del mensajero de la IL-18Rα fue nula en lesiones intraepiteliales y CaCU. Estos hallazgos pueden sugerir una modulación negativa de la respuesta inmune TH1, favoreciendo así la carcinogénesis. En el caso de las dos muestras de CN que expresaron ambos mensajeros, es posible que provengan de mujeres en las que se estaba llevando a cabo un proceso inflamatorio local con activación de la respuesta TH1. Palabras clave: Interleucina 18, cadena α del receptor de la IL-18, Cáncer cérvico uterino. INTRODUCCIÓN México y América Central presentan la tasa de incidencia y mortalidad por Cáncer cérvico uterino (CaCU) más altas. En el año 2003 el INEGI reportó una tasa de mortalidad de 8.3 casos por cada mexicanas. 1,2 Tipos de alto riesgo oncogénico del virus del papiloma humano (VPH) son el factor etiológico del CaCU, sin embargo, son necesarios factores adicionales que en conjunto inducen la progresión de una infección viral persistente a lesiones intraepiteliales y CaCU. La respuesta inmune celular tiene un papel importante en el control de las neoplasias asociadas a VPH, las cuales frecuentemente revierten como resultado de una eficiente respuesta inmune celular, tipo Th1. Se ha considerado que uno de los mecanismos por medio de los cuales las células infectadas por VPH y células malignas escapan a la vigilancia inmune involucran cambios en la producción local de citocinas y/o la pérdida de respuesta a éstas, provocando una alteración en el balance Th1/Th2 de la inmunidad local. 3,4

2 La IL-18 es una citocina con actividad antiviral y antitumoral, juega un papel importante en la respuesta de tipo Th1 a través de la inducción de la síntesis de interferón gamma (IFN- ) y el aumento de la actividad citotóxica de los LTC y de las células NK. Posee también la capacidad de inducir la producción de otros mediadores proinflamatorios, tales como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), IL-1β, IL-6 e IL- 8, que aumentan la proliferación de células T, y la activación de los LTC. La IL-18 cumple sus actividades biológicas a través de un receptor heterodimérico compuesto por una cadena α y una cadena β (IL-18Rα y IL-18Rβ). La IL-18Rα se une al ligando, mientras que la IL-18Rβ es la cadena transductora de señal. El papel de la IL-18 en la patogénesis por VPH no se ha determinado. La falta de producción de IL-18 bioactiva inducida por las células tumorales, se ha propuesto como un mecanismo probable a través del cual las células transformadas pueden inhibir la síntesis local de IFN-γ y así la respuesta de tipo Th1. Se ha reportado que la proteína E6 del VPH se une a la IL-18 y la degrada por la vía de la ubiquitinación, o por cualquier otra, y que las oncoproteínas E6 y E7 del VPH 16 se unen de forma competitiva a la cadena α del IL- 18R e inhiben así la producción de IFN-γ inducida por IL-18 en células NK y células mononucleares de sangre periférica humana, al reducir la unión de la IL-18 a su receptor. De esta forma las oncoproteínas del VPH contribuyen a la patogénesis viral y a la carcinogénesis cervical. 5,6,7 En la literatura no encontramos reportes acerca del estudio de esta citocina y de su receptor en pacientes con lesiones cervicales ocasionadas por el VPH, por tal razón el objetivo de la presente investigación fue determinar la expresión del RNAm de la IL-18 y de la cadena α de su receptor (IL-18Rα) en lesiones premalignas y CaCU. MATERIAL Y MÉTODOS Entre agosto de 2005 y abril de 2006, se analizaron 225 muestras de RNA de las cuales 192, procedían de casos de lesión premaligna o CaCU, diagnosticados por histopatología, distribuidos en tres estratos: a) lesión escamosa intraepitelial de bajo grado (LEIBG) n= 119, b) lesión escamosa intraepitelial de alto grado (LEIAG) n= 38 y c) CaCU n= 35. Se incluyeron también 33 muestras de raspados cervicales provenientes de mujeres citológicamente normales (CN). La expresión del mensajero de la IL-18 y de IL-18Rα se detectó mediante RT-PCR semicuantitativa utilizando oligonucleótidos específicos para cada gen. Como control positivo de la expresión de IL-18 se utilizó RNA de células HeLa y para IL-18Rα se utilizó RNA células mononucleares de sangre periférica de una paciente con Leucemia Granulocítica Crónica. En todos los casos se usaron 2.5 µg de RNA total para la síntesis de cdna. Se incluyeron en el estudio sólo los cdna que amplificaron un fragmento del mensajero de β-actina. Las muestras incluidas en esta investigación contaban con diagnóstico previo de infección por VPH por el método de PCR. RESULTADOS Todas las muestras negativas a lesión intraepitelial o malignidad fueron VPH negativas. El 83.2% de las muestras con LEIGB fueron VPH-positivas, en LEIGA la infección se detectó en un 76.3% y en CaCU en un 100%; siendo los VPH de alto riesgo oncogénico los más frecuentes en un 95.4%. El genotipo con mayor prevalencia fue el VPH 16, 68%; seguido por el VPH-18 (8.5%), VPH- 31 (6.5%) y el VPH 58 (5.2%), todos clasificados como de alto riesgo oncogénico. Expresión del RNAm de IL-18 y de IL-18Rα. Para valorar la integridad del RNA, la síntesis correcta del cdna y posteriormente semicuantificar el nivel de expresión del RNAm de IL-18 y de IL-18Rα, las muestras fueron sometidas a PCR para amplificar un

3 fragmento de 540 pb del gen constitutivo β-actina (Figura 1c). La expresión del transcrito de IL-18 se detectó por PCR y los productos de amplificación, de 587 pb, se muestran en la figura 1a. La proporción de muestras que expresaron el RNAm de IL- 18 fue mayor en los estratos de CN y CaCU con un 45.7% (16/35) y 48.5% (16/33) respectivamente, mientras que en lesiones premalignas de bajo y alto grado se encontró que 27.7% (33/119) y 23.7% (9/38) respectivamente, expresaron el mencionado transcrito (Cuadro 1). La expresión del RNAm de la IL-18Rα se detectó también por PCR y los productos de amplificación de 422 pb, se muestran en la figura 1b. De las muestras analizadas, sólo el 5.7% de las muestras de mujeres citológicamente normales (CN) expresaron la cadena α del receptor de la IL-18 (2/35); las muestras con LIEGB, LIEGA y CaCU fueron negativas a la expresión del RNAm del la IL-18Rα (Cuadro 1). Expresión del RNAm de IL-18 e infección por VPH en lesiones precancerosas y CaCU. De las muestras analizadas, el 59.5% resultó VPH positiva /RNAm de IL-18 negativa y el 25.3 % fueron VPH positiva /RNAm de IL-18 positivas. De las muestras con infección por VPH 16 el 71 % fueron negativas al RNAm de IL-18, y de aquellas que contenían el DNA del VPH 18, el 85% expresaron el mensaje de esa citocina (Cuadro 2). a) 615 pb 492 pb MPM pb 540 pb IL-18 b) 492 pb 369 pb 422 pb IL-18Rα c) 615 pb 492 pb 587 pb β- actina Figura 1. Expresión del RNAm de IL-18, IL-18Rα y β-actina. a) MPM: Marcador de peso molecular DNA ladder de 123 pb. Control negativo, se sustituyó el cdna por agua (1). Control positivo (cdna sintetizado a partir de RNA de células HeLa) (2). Muestras de CaCU que expresan el mensaje de IL-18 (3-6). Muestra de CaCU negativa al RNAm de la IL-18 (7). b) MPM: Marcador de peso molecular DNA ladder de 123 pb. Control negativo, se sustituyó el cdna por agua (1). Control positivo (cdna sintetizado a partir de RNA de CMSP de una paciente con leucemia granulocítica crónica) (2). Muestra de CN positiva al RNAm del gen IL- 18Rα (4). Muestras negativas al RNAm del gen IL-18Rα (3, 5 y 7). c) MPM: Marcador de peso molecular DNA ladder de 123 pb. Control negativo, se sustituyó el cdna por agua (1). Muestras positivas al RNAm del gen constitutivo β-actina (2-7). TIPO DE EXPRESION DE IL-18 EXPRESION DE IL-18Rα LESION NEGATIVO (%) POSITIVO (%) NEGATIVO (%) POSITIVO (%) CN* 19/35 (54.3) 16/35 (45.7) 33/35 (94.3) 2/35 (5.7) LEIBG 86/119 (72.3) 33/119 (27.7) 119/119 (0) 0/119 (0) LEIAG 29/38 (76.3) 9/38 (23.7) 38/38 (0) 0/38 (0) CaCU 17/33 (51.5) 16/33 (48.5) 33/33 (0) 0/33 (0) * Negativo a lesión intraepitelial o malignidad Cuadro 1. Frecuencia de la expresión del RNAm de IL-18 e IL-18Rα con respecto al grado de lesión. Mujeres del estado de Guerrero.

4 Semicuantificación del transcrito de IL-18 en CN, LEIGB, LEIGA y CaCU. La semicuantificación de los transcritos del RNAm de la IL-18, se llevó cabo en un fotodocumentador Bio Rad, el cual nos permite medir la intensidad de las bandas de los productos de PCR presentes en el gel. El valor obtenido se normalizó con la expresión del gen constitutivo β-actina de cada muestra (unidades de densidad del RNAm de IL-18/unidades de densidad del RNAm de la β-actina). Se calcularon cuartiles para determinar niveles de expresión de IL-18 en los diferentes estratos. En el 67% de las 225 muestras estudiadas, no se detectó el mensajero de esa citocina y se les clasificó como expresión nula. De las muestras que expresaron el RNAm de IL- 18 el 24% presentaron una expresión mínima, el 8% una expresión moderada y solo el 1% presentaron expresión alta y correspondieron a mujeres citológicamente normales (Cuadro 3). GENOTIPO DE VPH Expresión del RNAm IL-18 POSITIVO NEGATIVO 16 30/104 (29%) 74/104 (71%) 18 2/13 (15%) 11/13 (85%) 31 4/10 (40%) 6/10 (60%) 33 1/3 (33%) 2/3 (67%) 45 3/6 (50%) 3/6(50) 58 7/8 (87%) 1/8 (13%) 59-2/2 (100%) 61-1/1 (100%) 66-2/2 (100%) CP8304-2/2 (100%) 81-1/1(100%) IM - 2/2 (100%) NT 1/7 (14%) 6/7 (86%) IM: Infección múltiple, NT: No tipificado Cuadro 2. Frecuencia de los genotipos virales del VPH y expresión del RNAm de IL-18. Nula (0 <0.49) Nivel de expresión de la IL-18 Moderada ( ) Mínima ( ) Alta ( ) TOTAL CN 19/35 (54%) 12/35 (34%) 2/35 (6%) 2/35 (6%) 35 (100%) LIEGB 86/119 (72%) 23/119 (19%) 10/119 (9%) (100%) LIEGA 29/38 (76%) 5/38 (13%) 4/38 (11%) - 38 (100%) CaCU 18/33 (55%) 13/33 (39%) 2/33 (6%) - 33 (100%) Cuadro 3. Nivel de expresión del RNAm de la IL-18 en CN, lesiones precancerosas y CaCU. Mujeres del estado de Guerrero. DISCUSIÓN La expresión de IL-18 en una alta proporción de muestras negativas a lesión intraepitelial o malignidad podría explicarse por la presencia de estímulos distintos a la infección por VPH, ya que todas fueron negativas al DNA de ese virus. Se ha reportado que la producción de IL-18 en líquido peritoneal de pacientes con endometriosis es dependiente de la fase del ciclo menstrual e incrementa significativamente con el estadio de la endometriosis (I y II). La falta de expresión de IL-18 en lesiones precancerosas pudiera estar evitando que se desencadene una respuesta inmune antiviral eficaz, de tal forma que es posible que en estas lesiones se esté produciendo una modulación negativa de la respuesta inmune de tipo Th1 que

5 favorece así a la patogénesis viral y la carcinogénesis cervical. Es posible que la IL-18 esté jugando un papel importante en la patogénesis temprana del CaCU, ya que la proporción de muestras que expresaron el mensaje de esta citocina fue mayor en CaCU. Este comportamiento se ha reportado por otros autores en otros tipos de cáncer, en los cuales conforme avanza el estadio de la neoplasia los niveles de expresión de la IL-18 son mayores. Adicionalmente habrá que considerar que para que la IL-18 pueda cumplir con sus funciones, debe ser biológicamente activa y se ha visto que células inmunes y no inmunes pueden secretar de forma constitutiva IL-18 pero no es funcional. Cho y colaboradores y Lee y colaboradores han reportado que la expresión y la función de IL-18 pueden ser moduladas por las oncoproteínas E6 y E7 del VPH, lo cual está en acuerdo con nuestros resultados que muestran que en presencia del VPH-16 la proporción de muestras que expresan el RNAm de la IL-18 disminuye en un 71%. La falta de expresión del RNAm de la IL-18Rα en lesiones precancerosas y CaCU, sugiere otra vía probable de modulación negativa de la respuesta inmune Th1 en el proceso de carcinogénesis cervical. En el caso de las dos muestras de CN que expresaron ambos mensajeros, es posible que provengan de mujeres en las que se estaba llevando a cabo un proceso inflamatorio local con activación apropiada de la respuesta Th1. CONCLUSIONES El comportamiento de la IL-18 en diversos tipos de cáncer al parecer tiene un comportamiento similar, debido a que se ha visto que conforme avanza el estadio del carcinoma, la expresión de esta citocina es mayor. La presencia del RNAm de la IL-18 se detectó en los 4 estratos, sin embargo la expresión del mensajero de la IL-18Rα fue nula en lesiones intraepiteliales y CaCU. Estos hallazgos pueden sugerir una modulación negativa de la respuesta inmune TH1 inducida por IL-18 e IL-18Rα, favoreciendo así la carcinogénesis. Aunque el papel de la IL-18 en la patogénesis por VPH no se ha determinado se ha propuesto que el virus puede modular la respuesta desencadenada por esta citocina, por lo que es importante indagar sobre los posibles mecanismos por los cuales el VPH puede modular la respuesta a IL-18. La mayoría de las muestras que expresaron el RNAm de IL-18 tuvieron una expresión moderada de ese mensaje y solamente en muestras de CN se encontró una pequeña proporción en que se detectó alta expresión. BIBLIOGRAFÍA 1. Tjiong MY, Out TA, Schegget JT, Burger MP. Epidemiologic and mucosal immunologic aspects of HPV infection and HPV-related cervical neoplasia in the lower female genital tract: A review. Int J Gynecol Cancer 2001; 11: Estadísticas de mortalidad en México: muertes registradas en el año Salud Pública Mex 2005; 47(2): Burd EM. Human Papillomavirus and Cervical Cancer. Clin Microbiol Rev 2003; 16: Pages F, Vives C, Fridman SC, Fossiez F, Berger A, Cugnenc PH, et al. Control of tumor development by intratumoral cytokines. Immunol Lett 1999; 68: Akira S. The role of IL-18 in innate immunity. Curr Opin immunol 2000; 12: Lee SJ, Cho YS, Cho MC, Shim JH, Lee KA, Ko KK, et al. Both E6 and E7 Oncoproteins of Human Papillomavirus 16 Inhibit IL-18-Induced IFN-γ Production in Human Peripheral Blood Mononuclear and NK Cells. J Immunol 2001; 167: Cho YS, Kang JW, Cho M, Cho CW, Lee S, Cho Y-K, et al. Down modulation of IL-18 expression by human papillomavirus type 16 E6 oncogene via binding to IL-18. FEBS Lett 2001; 501: