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1 2do. Congreso Virtual de Ciencias Morfológicas 2da. Jornadaa Científica Virtual de la Cátedra Santiago Ramón y Cajal. Parámetros morfométricos de leucoplasia bucal con displasia epitelial. Dra. Lepzimilet Pérez Torres 1, Dr. Pedro Díaz Rojas 2 1 Universidad de Ciencias Médicas Camagüey. Cuba. 2 Universidad de Ciencias Médicas Holguín. Cuba. Correo electrónico: lepzimilet@iscmc..cmw.sld.cu RESUMEN La leucoplasia bucal es la lesión premaligna más frecuente, puedee presentarse con displasia epitelial, que es el rasgo más importante de sus diversos cambios histopatológicos. Los métodos morfométricos y estereológicos permiten complementar el análisis histopatológico convencional de la displasia epitelial. Objetivo: caracterizar las lesiones de la mucosa con leucoplasia bucal según grado de displasia epitelial a través de indicadores morfométricos y estereológicos. Método: se realizó un estudio observacional descriptivo. El universo estuvo constituido por 68 biopsias de pacientes con diagnóstico clínico e histopatológico de leucoplasia y la muestra fue de 15 biopsias de leucoplasiass displásicas, donde se analizaron parámetros morfométricos y estereológicos. Resultados: se encontró que el promedioo de la altura de las crestas epiteliales fue de 523,72 y la altura del epitelio fue de 748,44 en la displasia severa. El valor promedio y su desviación estándar del factor de forma en la displasia ligera fue de 0,,86 ± 0,08, en la displasia moderada fue de 0,88 ± 0,09 y en la displasia severa fue de 0,85 ± 0,11. El promedio del volumen nuclear fue de 237,000 y la densidad de perfiles nucleares epiteliales fue de 9,54 en la displasia ligera. Conclusiones: a medida que avanza la severidad de la displasia epitelial, se produce un incremento significativo de la altura y el ancho de las crestas epidérmicas y de la altura del epitelio, en cambio disminuye el volumen nuclear y la densidad de perfiles nucleares. El factor de forma no mostró diferencias significativas entre los grados de displasia epitelial. INTRODUCCIÓN La cavidad bucal se divide en vestíbulo y cavidad bucal propiamente dicha, está revestida por una mucosa cuyo epitelio es pavimentoso estratificado, queratinizado o no queratinizado, puede ser masticatoria, de revestimiento o especializada. El epitelio escamoso descansa sobre una membrana basal y se nutre del tejido conectivo 1

2 subyacente que forma las papilas, estas contribuyen a la estabilidad relativa de la mucosa, lo cual la protege de las fuerzas de fricción y de cizallamiento a las que está sometida. Su función principal consiste en la protección de los tejidos más profundos, constituyendo la primera línea de defensa, y cambia su estructura como consecuencia de adaptaciones funcionales en respuesta a factores intrínsecos o extrínsecos, que sirven de estímulo para iniciar procesos como la proliferación celular. 1, 2 Desde el punto de vista etimológico el término leucoplasia significa placa de color blanco. Se considera una lesión predominantemente blanca de la mucosa bucal que no puede ser caracterizada como ninguna otra lesión bien definida ni clínica ni histopatológicamente, y que además se puede transformar en cáncer. Ésta se observa principalmente entre la cuarta y la séptima década de la vida, afecta fundamentalmente a los hombres y puede presentarse en cualquier localización de la cavidad bucal. Entre los factores etiológicos relacionados con su aparición se consideran el tabaquismo, el alcoholismo, el papilomavirus, traumas, infección por 3, 4. Candidas, entre otros. Son diversos los cambios histopatológicos de la leucoplasia bucal, el rasgo más importante es la presencia de displasia epitelial, establecida por un crecimiento desordenado del epitelio, que consiste en una pérdida de uniformidad y orientación arquitectónica de las células, unido a alteraciones celulares como el aumento del tamaño y número de los nucléolos; hipercromatismo nuclear, pleomorfismo nuclear, aumento de la relación núcleo/citoplasma y aumento de la actividad mitótica. 5. Los signos displásicos en relación a una desestructuración del epitelio son: crestas epiteliales en forma irregular, hiperplasia de la capa basal, hipercelularidad y un patrón alterado en la maduración de los queratinocitos. La displasia epitelial actualmente se considera como el indicador más significativo, que apunta a mayor probabilidad de transformación maligna de la leucoplasia, sin embargo su diagnóstico es esencialmente subjetivo. La clasificación vigente dada por la OMS agrupa las leucoplasias displásicas según su gravedad en ligera, moderada y severa, este ordenamiento depende de la frecuencia de los cambios displásicos, entiéndase profundidad y extensión, que determinan el grado de afectación de los estratos del epitelio, ya sean en los profundos de forma aislada, en los estratos profundos e intermedios o en la totalidad del epitelio. 5 Diversos han sido los estudios que abordan el tema de la clasificación de la displasia epitelial en estas lesiones y los mecanismos de su transformación maligna. Sin 2

3 embargo aún persisten problemas en la evaluación de su significado, que se deben fundamentalmente a la falta de criterios objetivos que conlleva a la división más o 3, 6-8. menos arbitraria de sus grados de severidad. La determinación subjetiva de los rasgos displásicos es de suma importancia, porque constituye un procedimiento de valor en el diagnóstico histopatológico, no obstante se persigue establecer criterios que permitan la clasificación del fenómeno displásico 9, 10 según el grado de severidad lo más precisos posible. Para ello se han utilizado marcadores clínicos, histológicos, y moleculares que pudieran en un futuro contribuir a predecir el riesgo de un paciente para padecer un cáncer; sin embargo, actualmente no se dispone de un solo factor predictivo, clínicamente útil y basado en la evidencia de transformación maligna para las leucoplasias. 6 Por tal motivo los autores de esta investigación consideran que este procedimiento subjetivo debe apoyarse en la utilización de métodos cuantitativos y reproducibles que permitan complementar el análisis histopatológico convencional de la displasia epitelial que aparece en las lesiones leucoplásicas de la mucosa bucal, realizando las mediciones de algunos de sus componentes. Los parámetros morfométricos y estereológicos constituyen una herramienta que permite la mejor comprensión de procesos tanto fisiológicos como patológicos, y contribuyen a evaluar la relación estructura-función con mayor objetividad. En los anales del uso de la morfometría se describen varias técnicas, hoy consideradas básicas, como lo es el uso del método planimétrico hace más de 20 años. Con los avances de la tecnología en la microscopía y la computación, la morfometría y la estereología han tenido un desarrollo vertiginoso, constituyendo herramientas para innumerables investigaciones que actualmente se efectúan por medio de métodos de análisis semiautomático de imágenes que aumentan la velocidad, fidelidad, exactitud y 11, 12. reproducibilidad de los resultados. Existen abundantes ejemplos de su utilización para ampliar los conocimientos de la patogenia de todo tipo de lesiones premalignas y malignas. Uno de ellos es en el diagnóstico histopatológico del melanoma maligno cutáneo donde se debe determinar el índice de Breslow, que representa el espesor en milímetros de la lesión y caracteriza la medida cuantitativa del grosor del tumor lo que permite valorar la cantidad de neoplasia invasora, por lo que predice más exactamente el comportamiento subsiguiente de este tumor. 13 3

4 Varias son las investigaciones en que se han empleado métodos morfométricos y estereológicos para el estudio de la displasia epitelial en las lesiones leucoplásicas. Al profundizar en su análisis los autores pueden concluir que la mayoría de ellos centran su atención en la medición de parámetros como la densidad del volumen nuclear, la relación núcleo-citoplasma y el índice mitótico de las células de la capa basal del epitelio de la mucosa bucal afectada Sin embargo el grado de variación que sufren las crestas epidérmicas, la altura epitelial, así como las células del estrato espinoso, todos elementos importantes a considerar al diagnosticar y clasificar la displasia epitelial, han sido menos estudiados a través de técnicas cuantificables. En Cuba, en el año 2008, la tasa cruda de cáncer de labio, cavidad bucal y faringe en personas del sexo masculino fue de 9,2 por habitantes, y de 2,5 por habitantes en las mujeres, ocupando el 5to lugar dentro de las diez primeras localizaciones. Por tal motivo existe el Programa de Detección Precoz del Cáncer Bucal (PDCB) en cuyo marco resulta de importancia el diagnóstico preciso de lesiones premalignas y malignas, así como su clasificación, teniendo en cuenta la relación que existe entre el momento de diagnóstico de estas enfermedades y su pronóstico. 17 Por todo lo anterior consideramos importante determinar las características morfológicas objetivas, de ser posible cuantificables que permitan establecer diagnósticos histopatológicos precisos de las lesiones de la cavidad bucal. Objetivo: Caracterizar las lesiones de la mucosa con leucoplasia bucal según grado de displasia epitelial a través de parámetros morfométricos y estereológicos. MATERIALES Y MÉTODOS Este es un estudio observacional descriptivo y transversal que se realizó en el periodo entre enero y junio del año 2011, con el propósito de caracterizar la leucoplasia con displasia epitelial de distintos grados de severidad a través de métodos cuantitativos, teniendo en cuenta los siguientes indicadores morfométricos y estereológicos: altura y el ancho de las crestas epiteliales, altura del epitelio, factor de forma, densidad de perfiles nucleares y volumen nuclear de las células del estrato espinoso del epitelio. El universo se constituyó por 68 biopsias correspondientes a igual número de pacientes, que recibieron atención en la Consulta de Cirugía Máxilo Facial del Hospital VI Lenin provenientes del Programa de Detección de Cáncer Bucal, con diagnóstico clínico de leucoplasia bucal y que fue confirmado desde el punto de vista histopatológico que se realizó en el Departamento de Anatomía Patológica. Los datos se agruparon en una boleta de recolección de datos. Se seleccionó una muestra de 15 4

5 biopsias de leucoplasias displásicas, para ello se tuvieron en cuenta los criterios de inclusión y exclusión. Las biopsias se clasificaron según grado de severidad de la displasia epitelial: displasia ligera (n=4), displasia moderada (n=8) y displasia severa (n=3). Criterio de inclusión: Biopsias de leucoplasias displásicas ubicadas en la mucosa del carrillo. Criterio de exclusión: Biopsias de leucoplasias no displásicas. Después de obtener las muestras, se procesaron por la técnica clásica de inclusión en parafina. Se realizaron cortes seriados de ocho a diez micrómetros en sentido perpendicular a la superficie de la lesión, se ubicaron siete cortes histológicos en cada portaobjetos; y se asignaron ocho láminas por cada caso. Es decir 56 cortes histológicos por casos y la muestra total se constituyó de 120 preparaciones con 840 cortes histológicos, a cada uno se le aplicó la técnica de coloración con Hematoxilina y Eosina. Se capturaron entre 20 y 25 imágenes por cada corte correspondientes a la región de la mucosa afectada, con una cámara digital marca Kodak de 3 Mpx con un lente óptico de 1,5X que se acopló a un microscopio JENAMED 2 con un lente objetivo de 12,5X y lente ocular de 10X para un aumento total de 187,5X. Las imágenes se tomaron de forma consecutiva a lo largo de cada corte, se siguió un orden de derecha a izquierda, hasta completar cada corte, donde el inicio de la imagen subsiguiente fuese un punto establecido en campo como el final de la anterior. Éstas fueron empleadas para realizar las mediciones de los siguientes parámetros: altura y ancho de crestas epiteliales, y altura del epitelio. Para examinar el resto de los parámetros se capturaron 8 imágenes por cada corte, de la zona correspondiente al estrato espinoso del epitelio. En este caso se utilizó un lente objetivo de 40X y un lente ocular de 7,5X para un aumento total de 450X. Todas las imágenes se descargaron en una computadora ASUS y se codificaron para su identificación. Los indicadores morfométricos se midieron con la aplicación en computación ImageJ del National Institutes of Health, USA, Para las mediciones se procedió a la calibración con un objetivo micrométrico de la Karl Zeits. Para efectuar las mediciones de la altura de las crestas epiteliales, se utilizó la opción distancia lineal de la aplicación ImagenJ y se midió en línea recta desde la base de 5

6 cada una de ellas hasta la perpendicular imaginaria entre las bases de las dos papilas dérmicas adyacentes. En el caso de la medición del ancho de las crestas epiteliales se midió en línea recta mediante la aplicación distancia lineal en el límite de la base de cada papila. En el caso que uno de los bordes de la papila no fuera equidistante al otro se midió perpendicularmente del límite del borde menor al borde mayor. Se tuvo presente que el corte mostrara un sentido perpendicular a la superficie, de manera tal que se apreciaran las papilas en toda su extensión, evitando medir donde el corte mostrara un carácter diagonal y se apreciaran lagunas de tejido conectivo dentro del epitelio. Esta regla también se tuvo en consideración al medir la altura del epitelio. Para realizar la medición de la altura del epitelio, se superpuso una rejilla sobre la imagen y mediante la opción distancia lineal de la aplicación ImageJ se procedió a medir en sentido perpendicular desde la superficie del epitelio hasta la capa más interna, en todos los puntos de la rejilla que cortaban el epitelio en su estrato basal. La densidad de los perfiles nucleares epiteliales se evaluó por razón de la superposición sobre la imagen de una rejilla cuya área total era de µm². De esta manera, mediante la opción de conteo de la aplicación ImagenJ, se contaron todos los núcleos que coincidían con la intercepción de dos líneas de la rejilla. El indicador pleomorfismo nuclear se midió utilizando la opción de factor de forma de la aplicación ImagenJ. En este caso se contorneó el límite de cada núcleo. En los mismos núcleos que se midió el factor de forma de determinó el diámetro mayor y el diámetro menor usando la opción distancia lineal. Estos resultados fueron válidos para calcular el indicador volumen nuclear mediante la fórmula de Palkovits para núcleos ligeramente ovoides: V= π/6.a. B² Donde: A: diámetro mayor. B: diámetro menor. Se obtuvo un promedio de las mediciones en cada corte, a partir de estos datos se halló un promedio de cada una de las láminas y posteriormente en cada uno de los casos, de tal forma que el valor definitivo de cada variable en cada una de las variantes de la displasia es un promedio de promedios. Todos los resultados se reunieron en una boleta de recolección de datos. 6

7 Los resultados se procesaron con el editor estadístico profesional MyStat versión 12,0 del 2009, de la compañía SyStat. Se calculó la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación como parte de la estadística descriptiva; se desarrolló el test de normalidad para las series de datos (test de normalidad de Shapiro-Wilk), y se calculó el análisis de varianza para comparar las diferencias entre los grados de displasia en todas las variables. RESULTADOS El valor promedio y su desviación estándar de la altura de las crestas epiteliales en la displasia ligera fue de 239,87 µm ± 136,91 µm, en la displasia moderada fue de 428,53 µm ± 240,66 µm y en la displasia severa fue de 523,72 µm ± 273,95. El valor promedio y su desviación estándar del ancho de las crestas epiteliales en la displasia ligera fue de 151,00 µm ± 83,99 µm, en la displasia moderada fue de 181,79 µm ± 82,20 µm y en la displasia severa fue de 203,35 µm ± 93,79. (Cuadro 1). Al aplicar el análisis de varianza simple se demuestra la diferencia significativa en las alturas de las crestas epiteliales a medida que el grado de displasia se agrava. (F de Snedecor 166,72 para p 0,001). En el caso del ancho ocurre lo mismo. (F de Snedecor 28,65 para p 0,001). Se observa además como el ancho no aumenta en la misma medida que la altura, la que revela un ascenso ostensible, con una diferencia aproximada de 280 µm entre la displasia ligera y la displasia severa. Esto indica que el crecimiento de la lesión leucoplásica se realiza preponderantemente en el sentido vertical a la superficie, a medida que aumenta la gravedad de la displasia epitelial. Lo que se corrobora con los resultados del ANOVA. En la displasia ligera, el valor promedio y su desviación estándar de la altura del epitelio fue de 245,38 µm ± 117,79 µm, en la displasia moderada fue de 419,69 µm ± 187,58 µm, y en la displasia severa fue de 748,44 µm ± 448,88 µm. (Gráfico 1). Se observa como la dimensión del parámetro altura del epitelio asciende de manera palpable. (F de Snedecor 378,93 para p 0,001). De esta manera se cuantifica la altura del epitelio, la cual aumenta a medida que avanza el grado de la displasia epitelial. Esto se asocia a la hiperplasia que ocurre fundamentalmente a expensas del estrato espinoso (acantosis). 7

8 El valor promedio y su desviación estándar del factor de forma en la displasia ligera fue de 0,86 ± 0,08; de 0,88 ± 0,09 en la displasia moderada y en la displasia severa fue de 0,85 ± 0,11. (Cuadro 2). El valor promedio y su desviación estándar del volumen nuclear en la displasia ligera fue de 237,00 µm³ ± 164,65 µm³, en la displasia moderada fue de 158,00 µm³ ± 126,00 µm³ y en la displasia severa fue de 117,00 µm³ ± 113,65 µm³. (Gráfico 3).En tanto, el valor promedio y su desviación estándar de los perfiles nucleares epiteliales en la displasia ligera fue de 9,54 ± 2,69, en la displasia moderada fue de 5,61 ± 2,44 y en la displasia severa fue de 4,16 ± 3,24. (Gráfico 4). El indicador volumen nuclear muestra una curva descendente desde la displasia ligera hasta la severa. (F de Snedecor 228,69 para p 0,001). También es patente como el parámetro perfiles nucleares de las células del estrato espinoso disminuye a medida que avanza el grado de la displasia epitelial (F de Snedecor 59,04 para p 0,01). DISCUSIÓN Entre los signos displásicos que pueden observarse en la mitad más baja del epitelio en relación con su desestructuración están la pérdida de la polaridad basal e hiperplasia, que lleva a la formación de crestas bulbosas o en forma de gota. Las formas anormales de las crestas epiteliales son usuales y Speight 10 considera que su presencia es particularmente significativa en el diagnóstico de la displasia severa. Aguas 19 plantea que la hiperplasia de la capa de células espinosas (acantosis) y la hiperplasia de células basales está caracterizada por el aumento del ancho, la elongación y fusión de las crestas epiteliales; además de que en los casos en que existe hiperqueratosis, los brotes epiteliales pueden estar algo profundizados. Las crestas anormales también pueden verse con extensiones laterales o pequeñas ramas, rasgo que denota que la alteración es considerable. 10 En un estudio realizado en Cuba, Batista 20 reportó la hiperplasia como la irregularidad más frecuente en relación con la altura del epitelio analizado de forma cualitativa. De igual manera en la literatura revisada no se encontraron estudios cuantitativos que relacionen los grados de displasia epitelial con el grosor epitelial, por ello es sumamente importante poder establecer dicha relación cuantificable, lo que pudiera servir como patrón del comportamiento de la lesión. El epitelio de la mucosa bucal normal constituye un tejido con intensa actividad mitótica, respondiendo a una adaptación celular frente a la acción de agentes 8

9 agresores crónicos de baja intensidad. Puede sufrir un aumento del tamaño tisular producido por el número aumentado de células (hiperplasia) o por su incremento del tamaño (hipertrofia), comprometiendo su homeostasis funcional y consecuentemente llevar a una hiperplasia epitelial. 5 La hiperplasia epitelial muestra un epitelio engrosado en su totalidad con aumento del índice mitótico de la capa basal, y se asocia casi invariablemente con un aumento de la queratinización. 18 Gordón-Nuñez 5 apunta que, a pesar que desde el punto de vista histopatológico ciertas lesiones hiperplásicas de la mucosa bucal puedan exhibir características comúnmente observadas en lesiones con potencial maligno, como las displasias, no se debe olvidar que muchas de estas alteraciones podrían estar asociadas al propio proceso inflamatorio donde actúan mediadores químicos con capacidad de promover alteraciones en la morfología celular y en la organización estructural tisular. Es sugerida la posibilidad de que las hiperplasias epiteliales representen lesiones potencialmente malignas; sin embargo, este aspecto continúa teniendo un carácter cuestionable. La lectura de los valores del factor de forma manifiesta que no existe variación cuantitativa en la forma de los núcleos de las células del estrato espinoso en las lesiones leucoplásicas clasificadas según la severidad de la displasia epitelial. El pleomorfismo nuclear es considerado como uno de los cambios citológicos indicativos de la presencia de displasia epitelial. En muchos estudios histopatológicos de la leucoplasia bucal se valora se forma cualitativa e incluso Speight 10 plantea que en la displasia severa su representación es marcada. Smitha 9 utilizó dos variables para estudiar la forma nuclear en células basales: el factor de forma y el índice de contorno. Sus valores mostraron una diferencia significativa entre la mucosa bucal normal y la leucoplasia, y entre la mucosa bucal normal y el carcinoma escamoso celular. Sin embargo, estos parámetros fueron inútiles para diferenciar la leucoplasia y el carcinoma escamoso celular. Este resultado habla a favor de que el análisis de este parámetro no resulta provechoso cuando se trata de determinar el comportamiento de la displasia de acuerdo al grado de severidad. Otro estudio morfométrico realizado por Gao 19, en el que se midió el factor de forma en lesiones leucoplásicas, concuerda en que este parámetro no muestra ninguna utilidad para su identificación y clasificación. 9

10 La interpretación de los resultados de nuestro estudio coincide con estas investigaciones, por lo que consideramos que este indicador morfométrico no resulta útil para la determinación del comportamiento de la displasia epitelial. Los resultados del volumen nuclear y de los perfiles nucleares reflejan como en la medida que la displasia transcurre desde un estado ligero hasta un estado severo, las células del estrato espinoso se tornan hipertróficas, disminuyendo el volumen de su núcleo y aumentando el volumen citoplasmático. Esto explicaría porque los perfiles nucleares están disminuidos en estadios avanzados de displasia epitelial. Varios estudios 6, 9, 11, sugieren que el tamaño nuclear reducido y el tamaño del citoplasma aumentado son indicadores tempranos útiles para predecir la transformación maligna. CONCLUSIONES 1. A medida que avanza la severidad de la displasia epitelial, se produce un incremento significativo de la altura y el ancho de las crestas epidérmicas, manifestándose el crecimiento de la altura más marcado que el ancho. 2. El comportamiento de la altura del epitelio de la mucosa con leucoplasia bucal manifiesta un aumento en relación con el grado de displasia epitelial. 3. El factor de forma no mostró diferencias significativas entre los grados de displasia epitelial. 4. La densidad de perfiles nucleares epiteliales tiende a disminuir con la gravedad de la displasia epitelial, comportándose de igual manera el volumen nuclear. Estos elementos se revelan como posibles indicadores de transformación maligna. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Loynaz Fernández CS, Álvarez León O, Gámez Fonseca M, Dovale Borjas A, Moreno Álvarez L, Puldón Seguí G. Morfofisiología II. La Habana: Editorial Ciencias Médicas; Ross MH, Kaye GI, Pawlina W. Aparato Digestivo I: cavidad oral y estructuras asociadas. En: Ross MH, Kaye GI, Pawlina W, editores. Histología. Texto y Atlas Color con Biología Celular y Molecular. 4ta ed. Buenos Aires: Médica Panamericana; 2005.p Warnakulasuriya S, Newell WJ, Van der Waal I. Nomenclature and classification of potentially malignant disorders of the oral mucosa. J Oral Pathol Med. 2007; 36(10):

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13 and neoplastic lesions of the human cheek. Histol Histopathol. 1997; 12(1): PubMed PMID:

14 Cuadro 1. Altura y ancho de las crestas epiteliales de la mucosa bucal según clasificación de la displasia. Crestas epiteliales Intensidad de la lesión Altura (µm) Ancho (µm) Promedio Desv est Promedio Desv est Ligera 239,87 136,91 151,00 83,99 Moderada 428,53 240,66 181,79 82,20 Severa 523,72 273,95 203,35 93,79 Fuente: Procesamiento estadístico. Gráfico 1. Altura del epitelio de la mucosa bucal según clasificación de la displasia Longitud (µm) Ligera Moderada Severa Grado de la displasia epitelial Fuente: Procesamiento estadístico.

15 Cuadro 2. Factor de forma de las células del estrato espinoso del epitelio de la mucosa bucal según clasificación de la displasia. Intensidad de la lesión Promedio Desviación estándar Ligera 0,86 0,08 Moderada 0,88 0,09 Severa 0,85 0,11 Fuente: Procesamiento estadístico. Gráfico 3. Volumen nuclear de las células de estrato espinoso del epitelio de la mucosa bucal según clasificación de la displasia Volumen nuclear (µm 3 ) Ligera Moderada Severa Grado de la displasia epitelial Fuente: Procesamiento estadístico.

16 Gráfico 4. Perfiles nucleares de las células epiteliales de la mucosa bucal según clasificación de la displasia Perfiles nucleares Ligera Moderada Severa Grado de la displasia epitelial Fuente: Procesamiento estadístico.