El estudio de dianas terapéuticas en tumores sólidos. Rebeca Martínez
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- Esther Vera Rojas
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1 El estudio de dianas terapéuticas en tumores sólidos Rebeca Martínez
2 Índice 2 Introducción Biomarcadores en cáncer de pulmón Conclusiones
3 Índice 3 Introducción Biomarcadores en cáncer de pulmón Conclusiones
4 Cohorts: Clinical Trials Tumour Registries Tumour board Sampling Radiology Endoscopy 4 Surgery Patient Oncologist Targeted therapies Results Predictive biomarkers QA/QC Diagnosis IHC I+D+i In situ hibridization PCR Publication s Consensus Teaching Laboratorio de Dianas Terapéuticas
5 Introducción 5 Evolución del tratamiento del cáncer de pulmón: desarrollo de las terapias dirigidas, identificación de dianas terapéuticas y marcadores predictivos. Primera línea Mantenimiento Segunda línea Tercera línea Paclitaxel Gemcitabine 1998 Docetaxel 2003 Docetaxel 2000 Gefitinib 2004 Pemetrexed 2004 Erlotinib 2005 Bevacizumab 2007 Pemetrexed 2008 Mediana supervienci a global (meses) Cisplatin 1978 ~2 4 Best supportive care Carboplatin 1989 ~6 Single-agent platinum Vinorelbine 1997 ~ Doublets 12+ Gefitinib 2009 Pemetrexed 2009 Erlotinib 2010 Bevacizumab + PC Histology-direct therapy European Medicines Agency.
6 Introducción Como resultado de los avances de la investigación molecular en cáncer, ha sido posible identificar alteraciones en múltiples genes que codifican proteínas implicadas en las vías de transducción de señales que controlan procesos claves para la célula: proliferación y supervivencia celular. 6 SECUENCIACIÓN GENOMA ANÁLISIS EXPRESIÓN GÉNICA CGH ARRAYS CGH Ejemplo representativo de alteraciones genéticas en cáncer: carcinoma no microcítico de pulmón (figura adaptada de Ding et al., Nature 2008; 455: )
7 Introducción Evolución del tratamiento del cáncer de pulmón: identificación de subgrupos moleculares con relevancia terapéutica KRAS Evolución del tratamiento en NSCLC Desconocido 2004 Diagnóstico histológico reproducible No SCC SCC KRAS Desconocido 2010 EGFR Análisis de las alteraciones genéticas con valor predictivo EGFR Mut EGFR WT SCC 2008 Desconocido MET BRAF ERBB2 PDGFR KRAS EGFR ALK PIK3CA EGFR Mut ALK + KRAS Mut MET+ Otros Mut SCC Priorizar el uso de terapias dirigidas Hoy Adaptado de Pao et al., Lancet Oncol 2011; 12: y Sharma et al., Nat Rev Cancer 2010; 10:
8 Índice 8 Introducción Biomarcadores en cáncer de pulmón Conclusiones
9 Small thoracic samples Diagnosis Tumor board input Biomarkers 9 H&E IHC Step A1 Step A2 Step A3 Step A4 Section 1 3 µm S H&E Section 2 3 µm S S P40- Section 3 3 µm TTF1+ Section 4 5 µm Section 5 3 µm Section 6 5 µm Section 7 3 µm Sections µm Section 19 3 µm S S S S S EGFR mutation ALK translocation KRAS mutation ROS1 translocation DNA extraction H&E NSCLC- NOS NSCLC-NOS favours AC HER2 mutación S BRAF mutación H&E HER2 (3,6%) (~15%) [41,42] (10,5%) [42] (21%) [42] (1,7%) [43] BRAF (2%) AC Step B1 Step B2 Step B3 Section 1 3 µm Section 2 5 µm Section 3 3 µm Section 4 5 µm Section 5 3 µm Sections µm Section 17 3 µm Conde et al. Clin Transl Oncol, in press
![mutation ROS1 translocation DNA extraction H&E NSCLC- NOS NSCLC-NOS favours AC HER2 mutación S12-4720 BRAF mutación H&E HER2 (3,6%) (~15%) [41,42] (10,5%) [42] (21%) [42] (1,7%) [43]](/docs-images/40/1382967/images/page_9.jpg "BRAF (2%) AC Step B1 Step B2 Step B3 Section 1 3 µm Section 2 5 µm Section 3 3 µm Section 4 5 µm Section 5 3 µm Sections 6-16 15 µm Section 17 3 µm Conde et al.")
10 Biomarcadores en cáncer de pulmón 10
11 Biomarcadores en cáncer de pulmón 11 FASE PRE-ANALÍTICA DE LA MUESTRA EGFR Fase analítica. Fase post-analítica. ALK Fase analítica. Fase post-analítica
12 Biomarcadores en cáncer de pulmón 12 FASE PRE-ANALÍTICA DE LA MUESTRA EGFR Fase analítica. Fase postanalítica. ALK Fase analítica. Fase postanalítica
13 Introducción: Qué muestras? 13 Tipos de muestras: A. Biopsia (bronquial, transbronquial o pleural) B. Biopsia con aguja gruesa (tru-cut) C. Pieza quirúrgica D. Citología A B C D
14 FASE PRE-ANALÍTICA 14 Fase de procesamiento de la muestra Manejo de la muestra Evaluación, gestión y rentabilidad de la muestra Macrodisección Sección Extracción del ADN Digestión del tejido Medición de la cantidad y calidad del ADN
15 FASE PRE-ANALÍTICA 15 Fase de procesamiento de la muestra Manejo de la muestra Evaluación, gestión y rentabilidad de la muestra Macrodisección Sección Extracción del ADN Digestión del tejido Medición de la cantidad y calidad del ADN
16 Fase de procesamiento 16 Estudio macroscópico
17 Fase de procesamiento 17 Fijación e inclusión Volumen de fijador adecuado (relación mínimo fijador: tejido de 10:1) Tiempo óptimo de fijación: 6-12 h biopsias pequeñas 8-18 h resecciones quirúrgicas. No se recomienda >36 horas.
18 FASE PRE-ANALÍTICA 18 Fase de procesamiento de la muestra Manejo de la muestra Evaluación, gestión y rentabilidad de la muestra Macrodisección Sección Extracción del ADN Digestión del tejido Medición de la cantidad y calidad del ADN
19 Manejo de la muestra Evaluación, gestión y rentabiliad de la muestra 19 S % % celularidad tumoral
20 Manejo de la muestra Evaluación, gestión y rentabilidad de la muestra 20 Comparison of direct sequencing and a commercial real-time pcr kit for detection of mutations in egfr gene Angulo B, Conde E, Martínez R, Suárez-Gauthier A, García-García E, Rubio-Viqueira B, López-Ríos F
21 Manejo de la muestra Macrodisección 21 Indicación: Siempre que el porcentaje de celularidad tumoral esté por debajo del límite de sensibilidad de la técnica a utilizar Eliminar: necrosis, inflamación, moco
22 Manejo de la muestra Macrodisección 22 A B Bloque NO tumoral Bloque TUMORAL C D
23 Manejo de la muestra Sección 23
24 Manejo de la muestra Sección 24 A) Realizar 2-5 cortes a 5-10 μm en un microtomo, utilizándose cuchillas desechables para cada caso con el fin de evitar contaminaciones cruzadas. B) Cada corte es recogido con ayuda de una aguja estéril e introducido en un tubo eppendorf estéril previamente rotulado. A B C
25 FASE PRE-ANALÍTICA 25 Fase de procesamiento de la muestra Manejo de la muestra Evaluación, gestión y rentabilidad de la muestra Macrodisección Sección Extracción del ADN Digestión del tejido Medición de la cantidad y calidad del ADN
26 Extracción del ADN 26 1) DESPARAFINACIÓN Lavados con xilol Lavados con etanol absoluto Eliminación de parafina 2) DIGESTIÓN/LISIS Incubación con proteinasa K Rotura de matriz extracelular y lisis de membrana plasmática y orgánulos subcelulares 4) 3) EXTRACCIÓN Separación del ADN del resto de moléculas biológicas ALMACENAMIENTO 4ºC (1 semana) -20ºC (meses) -80ºC (años) Disolventes orgánicos (fenol-cloroformo): separación en base a la distinta polaridad de las moléculas biológicas Kit comerciales: columnas con membrana de sílice con afinidad para unión específica del ADN. Ej:QIAamp DNA FFPE Tissue, QIAGEN. Posibilidad de automatización. TM TM QIAcube: robot para la automatización del protocolo de extracción con el kit QIAamp DNA FFPE tissue.
27 Extracción del ADN Cuantificación y valoración de la calidad del ADN extraído 27 ADN de tejido en parafina ADN de sangre o tejido congelado ADN degradado ADN íntegro
28 Biomarcadores en cáncer de pulmón 28 FASE PRE-ANALÍTICA DE LA MUESTRA EGFR Fase analítica. Fase post-analítica. ALK Fase analítica. Fase post-analítica
29 FASE ANALÍTICA 29 Introducción Aproximaciones metodológicas al estudio de mutaciones en el gen EGFR: Secuenciación Técnicas de enriquecimiento del alelo mutado Otras / Técnicas de screening PCR cuantitativa en tiempo real IHQ
30 INTRODUCCIÓN Introducción 30 Clin Cancer Res 2007; 13:
31 Aproximaciones metodológicas al estudio de mutaciones en el gen EGFR Secuenciación directa (método de Sanger) 31 EGFR wild-type: exón 19 EGFR mutado: deleción exón 19 E746-A750del VENTAJAS Gold-standard Coste Accesibilidad Posibilidad de identificar todas las posibles mutaciones. DESVENTAJAS Sensibilidad (25-50%) Múltiples etapas Contaminaciones (post-pcr) Experiencia interpretación de los electroferogramas
32 EGFR MUTATION DETECTED EGFR MUTATION NOT-DETECTED Aproximaciones metodológicas al estudio de mutaciones en el gen EGFR Secuenciación directa: % tumor EGFR E746-A750del 32 % mutant DNA relative to wildtype DNA <5% 10% 20% 25% 30% N.D. Direct Sequencing (n=10*) 0/10 1/10 (10%) 5/10 (50%) 5/10 (50%) 7/10 (70%) 3/10 (30%) ORIGINAL SAMPLE (100%) SENSITIVITY STUDY: 10% SENSITIVITY STUDY: 20% SENSITIVITY STUDY: 30%
33 Aproximaciones metodológicas al estudio de mutaciones en el gen EGFR PCR cuantitativa en tiempo real 33 TheraScreen EGFR29 Mutation Test kit (DxS) IDENTIFICACIÓN DE LA MUTACIÓN DETECCIÓN DE LA MUTACIÓN EGFR wt ensayo control primer ARMS Taq FLUORÓFORO MOLÉCULA ADN MOLDE PRIMER SECUENCIA MUTADA EGFR mutado ensayo control primer ARMS Taq MOLÉCULA ADN MOLDE X Scorpions A ensayo mutación B
34 Aproximaciones metodológicas al estudio de mutaciones en el gen EGFR PCR cuantitativa en tiempo real 34 TheraScreen EGFR29 Mutation Test kit (DxS) VENTAJAS Mayor sensibilidad Kit comercial (estandarización) Fácil manejo e interpretación DESVENTAJAS Coste No detecta todas las mutaciones y, salvo las mutaciones puntuales, no discrimina entre las distintas deleciones o inserciones
35 Aproximaciones metodológicas al estudio de mutaciones en el gen EGFR COBAS EGFR TEST 35 Study Objectives
36 Aproximaciones metodológicas al estudio de mutaciones en el gen EGFR COBAS EGFR TEST 36
37 Aproximaciones metodológicas al estudio de mutaciones en el gen EGFR Cobas Mutation Test 37 Direct sequencing Extracted DNA Plate setup 45min PCR run 2h:30min Post-PCR, including: electrophoresis and purification 2h:30 Sanger run, including: Plate setup 1h PCR run 3h:30min Purification 30min Sequencing 2h:30min Data analysis 1h cobas EGFR Mutation Test MUY poco (5 µm) Plate setup 30min PCR run 1h:30min Data analysis 1min Rápido (48h) Automatizado
38 Biomarcadores en cáncer de pulmón 38 FASE PRE-ANALÍTICA DE LA MUESTRA EGFR Fase analítica. Fase post-analítica. ALK Fase analítica. Fase post-analítica
39 FASE POST-ANALÍTICA 39 Introducción Interpretación de resultados PCR y secuenciación directa PCR cuantitativa en tiempo real Emisión del informe
40 Introducción 40 Consideraciones generales: Buenas prácticas de laboratorio Parámetros de control analítico de la técnica Interpretación de los resultados Emisión del informe
41 FASE POST-ANALÍTICA 41 Introducción Interpretación de resultados PCR y secuenciación directa PCR cuantitativa en tiempo real Emisión del informe
42 Interpretación de resultados PCR y SECUENCIACIÓN DIRECTA Parámetros de control analítico 42 Validar la especificidad (verificar que se amplifica la región de interés) 1.- Especificidad de los primers secuencia %G+C pb EGFR18F TGACCCTTGTCTCTGTGTTC EGFR18R AGAGGCCTGTGCCAGGGAC EGFR19F CAGTTAACGTCTTCCTTCTC EGFR19R CACACAGCAAAGCAGAAACTC EGFR20F ACTGACGTGCCTCTCCCTC EGFR20R CCCGTATCTCCCTTCCCTG EGFR21F TCACAGCAGGGTCTTCTCTG EGFR21R CTGACCTAAAGCCACCTCC Conde et al. Clin Cancer Res 2006; 12:
43 Interpretación de resultados PCR y SECUENCIACIÓN DIRECTA Parámetros de control analítico 43 Validar la sensibilidad (diluciones de ADN mutado en ADN wild-type, procedentes ambos de muestras de uso habitual en el laboratorio). COMPARISON OF DIRECT SEQUENCING AND A COMMERCIAL REAL-TIME PCR KIT FOR DETECTION OF MUTATIONS IN EGFR GENE Angulo B, Conde E, Martínez R, Suárez-Gauthier A, García-García E, Rubio-Viqueira B, López-Ríos F
44 Interpretación de resultados 44 PCR y SECUENCIACIÓN DIRECTA Parámetros de control analítico Secuenciar productos de PCR en dirección forward y reverse Revisión de electroferogramas mediante softwares específicos de alineamiento de secuencias y visual para evitar enmascaramientos por presencia de alelos wildtypes
45 Interpretación de resultados PCR y SECUENCIACIÓN DIRECTA 45 Revisión VISUAL de las secuencias
46 Interpretación de resultados PCR y SECUENCIACIÓN DIRECTA Interpretación 46 EGFR wild-type: exón 19 EGFR mutante: deleción en exón 19 (E746-A750) E746-A750del
47 Interpretación de resultados EGFR wild-type: exón 20 EGFR mutante: T790M 47 C>T ACG ATG EGFR wild-type: exón 21 EGFR mutante: L858R CTG CGG T>G
48 Interpretación de resultados 48 EGFR mutante: inserción exón 20 (V769_D770insASV)
49 FASE POST-ANALÍTICA 49 Introducción Interpretación de resultados PCR y secuenciación directa PCR cuantitativa en tiempo real Emisión del informe
50 Interpretación de resultados 50 PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL TheraScreen EGFR29 Mutation Test Kit (DxS) 8 ensayos: CONTROL, DELECIONES, T790M*, L858R, L861Q, G719X, S768I, INSERCIONES. CONTROL T790M DELECIONES EXÓN 19 L858R L861Q G719X S768I INSERCIONES EXÓN 20
51 Interpretación de resultados PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL TheraScreen EGFR29 Mutation Test Kit (DxS) 51 Valor Ct (umbral de ciclo, cycle thereshold): ciclo de PCR a partir del cual la señal de amplificación es estadísticamente significativa por encima del ruido de fondo Ct = Ct Ensayo mutación Ct Ensayo control EGFR E746-A750del Ct ENSAYO CONTROL DELECIÓN Ct = Ct Ensayo mutación Ct Ensayo control
52 Interpretación de resultados PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL Cobas EGFR Mutation Test 52
53 Interpretación de resultados PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL Cobas EGFR Mutation Test 53
54 Emisión del informe 54 Nº especimen Filiación del paciente Filiación del médico solicitante Tipo de especimen Bloque parafina / citología Biopsia / pieza quirúrgica Localización: 1º vs 2º Macrodisección: sí/no % celularidad tumoral Técnica empleada Exones analizados Presencia o ausencia de mutación Tipo específico de mutación Sensibilidad analítica de la técnica % mutaciones EGFR Fecha de entrada / Fecha de salida
55 Biomarcadores en cáncer de pulmón 55 FASE PRE-ANALÍTICA DE LA MUESTRA EGFR Fase analítica. Fase post-analítica. ALK Fase analítica. Fase post-analítica
56 Hibridación in situ fluorescente (FISH): Concepto Fase Analítica 56 Técnica que permite la localización de una secuencia de ADN de un gen/cromosoma en una preparación celular Precisa el anillamiento de una cadena simple de ADN marcada con fluorescencia a las secuencias diana complementarias El resultado de la hibridación se visualiza directamente en el núcleo
57 Protocolo en muestras parafinadas Fase Analítica 57 Selección del área neoplásica Carcinoma infiltrante Evitar áreas de necrosis Evitar áreas con inflamación Marcar el área seleccionada Cortes 3-4 µm del tejido en cristales silanizados Mantener en estufa a 55ºC 24h Desparafinado Pretratamiento Digestión: permite que la sonda acceda al ADN diana
58 Inventariable y fungible Fase Analítica 58 Microscopio de fluorescencia: Lámpara 100 W Objetivos:10x y 100x (inmersión) Aceite de inmersión Filtros individuales para cada fluorocromo: Dapi FITC Texas Red vs Orange Doble: FITC/Texas Red vs Orange Triple: Dapi/FITC/Texas Red vs Orange
59 FISH de la translocación ALK Vysis LSI ALK dual color, break-apart probe Fase Analítica 59 ALK Break Apart Probes identifica todas las translocaciones, independientemente del gen de fusión (EML4, TGF and KIF5B) 3 5 SpectrumOrange Probe Telomeric of break site (contiene el dominio tirosina kinasa) SpectrumGreen Probe Centromeric of break site
60 FISH de la translocación ALK Nueva Vysis LSI ALK dual color, break-apart probe Fase Analítica 60 Optimizada para pulmón Misma sonda Nueva fórmula Protocolo mejorado
61 Ventajas del FISH Fase Analítica 61 Evaluación directa del gen a estudiar Estudio de un amplio número de genes Aplicación sobre tejido en parafina, extensiones citológicas y fluidos Implementación en laboratorios de anatomía patológica Procedimiento estandarizado y validado: importante el empleo de kits Guías de interpretación validadas Rapidez en la emisión de los resultados Elevada especificidad y sensibilidad
62 Inconvenientes del FISH Fase Analítica 62 Coste del inventariable y fungible Tiempo de evaluación Pérdida de la fluorescencia Buena ejecución de la técnica Número adecuado de casos Entrenamiento del patólogo
63 FISH sobre citología 63 Protocolo más corto No desparafinado Pretratamiento No baño No digestión Resto del protocolo igual que parafina
64 Biomarcadores en cáncer de pulmón 64 FASE PRE-ANALÍTICA DE LA MUESTRA EGFR Fase analítica. Fase post-analítica. ALK Fase analítica. Fase post-analítica
65 ÍNDICE ÍNDICE 65 Interpretación de resultados Patrones de interpretación: Clásico Atípico Heterogeneidad intratumoral Retos del FISH ALK Otros patrones de significado incierto Emisión de informes
66 FISH: Interpretación de resultados Vysis LSI ALK dual color, break-apart probe Fase post-analítica 66 Sondas de rotura (Break Apart o Split Signal) Punto de ruptura Cromosoma A Cromosoma A Cromosoma?
67 FISH: Interpretación de resultados Vysis LSI ALK dual color, break-apart probe Fase post-analítica 67 NEGATIVO POSITIVO NO CONCLUYENTE Si de 5 a 25 núcleos (10-50%) son positivos Si <5 núcleos de 50 (<5/50 ó <10%) son negativos Si >25 núcleos de 50 (>25/50 ó >50%) son positivos Segundo observador: análisis de 50 núcleos más. Suma de las 2 lecturas de FISH (100 núcleos): - Si el promedio de núcleos positivos es <15% (<15/100), se considera negativo - Si el promedio de núcleos positivos es >15% (>15/100), se considera positivo
68 FISH: Interpretación de resultados FISH ALK NEGATIVOS: No translocación Fase post-analítica 68
69 FISH: Interpretación de resultados Fase post-analítica FISH ALK POSITIVO: Patrón clásico (señales split ) 69 3 ALK 5 2p23-21 EML4 ~ 12 Mb 3 ALK EML4 Translocación (inversión) (70%) 5 Gen de Fusion Negativ o Positivo (señales split)
70 FISH: Interpretación de resultados Fase post-analítica FISH ALK POSITIVO: Patrón clásico (señales split ) 70 Distancia entre las señales split Negativo Separación entre las señales de menos de dos el diámetro de las mismas Positivo Separación entre las señales de más de dos el diámetro de las mismas
71 FISH: Interpretación de resultados Fase post-analítica FISH ALK POSITIVO: Patrón clásico (señales split ) 71
72 FISH: Interpretación de resultados FISH ALK POSITIVO: Patrón atípico Fase post-analítica 72 Señales rojas (3') únicas [pérdida/deleción señal verde (5')] 3 ALK 5 ~ 12 Mb EML4 3 ALK EML4 Deleción (30%) Gen de Fusion
73 FISH: Interpretación de resultados FISH ALK POSITIVO: Patrón atípico Fase post-analítica 73 Señales rojas (3') únicas [pérdida/deleción señal verde (5')] Positivo Señales rojas (3 ) únicas / pérdida de señal verde (5 ) Negativo Señales verdes (5 ) únicas / pérdida de señal roja (3 )
74 FISH: Interpretación de resultados FISH ALK POSITIVO: Patrón atípico Fase post-analítica 74 Señales rojas (3') únicas [pérdida/deleción señal verde (5')]
75 FISH: Interpretación de resultados Heterogeneidad intratumoral Fase post-analítica 75 Heterogeneidad FISH ALK difusa, no focal IHQ ALK difusa, no focal Camidge et al., Clin Cancer Res 2010;16: Yoshida A et al, Am J Surg Pathol 2011;35:1226
76 FISH: Interpretación de resultados Retos del FISH ALK Fase post-analítica 76 Falsos positivos: Truncamiento nuclear Hibridación inespecífica Falsos negativos: Señales débiles Filtros de fluorescencia (p.e. filtro verde quemado ) Errores de interpretación: Valoración de células benignas Interpretación incorrecta de señales de rotura/fusión
77 FISH: Interpretación de resultados Otros patrones de interpretación Fase post-analítica 77
78 Emisión de informes Fase post-analítica 78 Nº espécimen Filiación del paciente Filiación del médico solicitante Tipo de muestra: o biopsia o pieza quirúrgica o citología Procedencia anatómica Fijador Sonda Nº de núcleos evaluados Idoneidad de la muestra: adecuada / inadecuada Observaciones: o % de células tumorales con señales verde (5 ) y roja (3 ) separadas (patrón split ) o % de células tumorales con señales rojas (3') únicas o Otros hallazgos Interpretación: translocado / no translocado Fecha de entrada / Fecha de salida
79 Secuenciación no-óptica 79
80 Secuenciación no-óptica 80 El Panel genético seleccionado contiene los 46 genes y 739 mutaciones más relevantes por su relación con la mayor parte de los cánceres y terapias conocidas
81 Índice 81 Introducción Biomarcadores en cáncer de pulmón Conclusiones
82 CONCLUSIONES ÍNDICE 82 Material disponible límitado Los técnicos nos tenemos que involucrar en todo el proceso. Métodos no estandarizados Necesidad de entrenamiento Control de cálidad interno y externo.
83 83 Hospital Universitario Madrid Sanchinarro C/ Oña 10, Madrid, España Muchas gracias
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