Grado en Química QUIMICA ANALITICA II. Guiones de Prácticas. 2º Curso

Transcripción

1 Grado en Química 2º Curso QUIMICA ANALITICA II Guiones de Prácticas

2 QUIMICA ANALÍTICA II Grado en Química 2º Curso UTILES A TRAER POR EL ALUMNO Bata Gafas de Seguridad Cuaderno de Laboratorio NORMAS DE TRABAJO Antes de empezar Antes de empezar cada práctica, el profesor comprobará que el alumno ha leído el guión correspondiente y contestado las preguntas previas. Durante las sesiones Cada alumno tendrá asignada una mesa. Trabajar siempre en la mesa, salvo que se necesite la campana de gases. Mantener siempre limpia la mesa de trabajo. Al acabar Limpiar la mesa y el material utilizado. Dejar el equipo individual en la mesa de trabajo. Avisar al profesor antes de abandonar el laboratorio. 2

3 QUIMICA ANALÍTICA II Grado en Química 2º Curso INDICE página Práctica nº 1.- Extracción líquido-líquido: equilibrio de reparto. Extracción simple de I 2 en disolución acuosa con hexano. Extracción múltiple... 4 Práctica nº 2.- Separación de Fe y Al en una muestra acuosa mediante extracción selectiva con oxina Práctica nº 3.- Identificación y cuantificación de vitaminas por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) Práctica nº 4.- Determinación de hidrocarburos en agua de mar mediante cromatografía de gases Práctica nº 5.- Determinación de cafeína en diferentes muestras (café, té y bebidas de cola) mediante HPLC con detección UV

4 QUIMICA ANALÍTICA II Grado en Química 2º Curso Práctica nº 1 EXTRACCIÓN LÍQUIDO-LÍQUIDO: EQUILIBRIO DE REPARTO. EXTRACCIÓN SIMPLE DE I 2 EN DISOLUCIÓN ACUOSA CON HEXANO. EXTRACCIÓN MÚLTIPLE OBJETIVOS Los objetivos fundamentales de la práctica se centran en familiarizar al alumno con: 1. El fundamento de la extracción líquido-líquido 2. Las operaciones prácticas de extracción: Extracción simple y múltiple. 3. Los cálculos relacionados con la eficacia de la extracción INTRODUCCIÓN EXTRACCIÓN LÍQUIDO-LÍQUIDO: EQUILIBRIO DE REPARTO La extracción puede definirse como un proceso de separación en el cual un soluto se reparte o distribuye entre dos fases diferentes. Lo más común es realizar la extracción entre dos fases líquidas, aunque también pueden realizarse extracciones sólido-líquido. La extracción líquido-líquido se utiliza con frecuencia para separar especies moleculares simples (I 2, Br 2,...), compuestos de coordinación y compuestos orgánicos, de las disoluciones acuosas en las que se encuentran inicialmente. El procedimiento consiste en agitar las disoluciones acuosas con un disolvente orgánico inmiscible con el agua y dejar separar ambas fases. Se establece entonces un equilibrio o reparto de los solutos entre las dos fases gobernado por la solubilidad relativa de los solutos en las fases acuosa y orgánica. Recuerda, pues, el fundamento de la extracción: un equilibrio de solubilidad entre dos fases inmiscibles. Representación Esquemática de la Extracción 4

5 Disolución Acuosa I 2,hidrocarburos (trazas) R-OH, R-COO-R', R-CHO R-COOH, R-NH 2 Sales Inorgánicas Equilibrio de Reparto R-COOH, R-NH2 R-OH, R-COO-R', R-CHO I 2, hidrocarburos Disolvente Orgánico Disolvente Orgánico (hexano,éter,hexano ) Disolución Acuosa Sales Inorgánicas Desde el punto de vista cuantitativo de la Termodinámica Química, el equilibrio de reparto o extracción es muy sencillo. Formalmente, es análogo al caso del equilibrio químico. Supongamos un único soluto S que establece un equilibrio de reparto simple: S (aq) S (org) En el equilibrio, el potencial químico del soluto es el mismo en ambas fases y la relación de actividades en cada fase nos da la constante de equilibrio de reparto, más conocida como el coeficiente de reparto K. En la práctica, se aproxima el coeficiente de reparto por un cociente de concentraciones en vez de actividades. K T a = a org ( S ) aq ( S ) [ S ] org [ S ] aq Para un sistema dado (pareja de disolventes + soluto), el correspondiente coeficiente de reparto K sólo depende de la temperatura. Si el soluto no participa en ningún otro equilibrio secundario (como un equilibrio ácido-base en disolución acuosa), el rendimiento del proceso de extracción puede obtenerse a partir de K. Analiza el siguiente ejemplo: El coeficiente de reparto del I 2 entre agua y disulfuro de carbono es K= 410 a 25 ºC. Halla la fracción de I 2 que permanece en disolución acuosa después de que volúmenes iguales de agua y CS 2 hayan alcanzado un equilibrio de reparto. I 2 (aq) I 2 (CS) La fracción de I 2 que permanece en disolución acuosa puede escribirse como: eq eq n / Vaq n a I = = [1] 2 o o n / Vaq n 5

6 donde nº son los moles totales de iodo inicialmente en disolución acuosa y n eq son los moles de iodo que permanecen en la fase acuosa una vez alcanzado el equilibrio de reparto. Por otro lado, el coeficiente de reparto puede escribirse como: [ I ] o eq 2 CS ( n n )/ VCS K = 2 = 2 [2] [ I2] aq neq / Vaq Como Vaq=V CS2, podemos despejar neq en [2] y sustituir en [1]: o n eq = n 1 α = = K + 1 I2 K + 1, En términos de rendimiento, se extrajo un = % del I 2. REACTIVOS Y MATERIAL MATERIAL 3 Embudo de decantación de 250 ml 3 vasos de precipitados de 100 ml 1 probeta de 25 ml 1 pipeta de 10 ml 2 Cuentagotas y 1 varilla 2 Tubos de ensayo Gradilla REACTIVOS Disolución acuosa de iodo saturada Disolvente: hexano Indicador de almidón: disolución acuosa de almidón + KI(s) 6

7 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Parte 1.- EXTRACCIÓN SIMPLE DE I 2 EN DISOLUCIÓN ACUOSA CON HEXANO A continuación, vas a realizar un experimento de extracción simple de iodo molecular en una disolución acuosa saturada empleando como fase orgánica el hexano. Este sistema te permite apreciar visualmente cómo se alcanza el equilibrio de distribución. Debes realizar las siguientes operaciones: 1) Asegúrate de que el embudo de decantación está limpio y seco. Colócalo en el soporte sujetándolo con el aro con nuez. Comprueba que la llave del embudo está cerrada. Si es necesario, refuerza el tapón del embudo con cinta de teflón. 2) Con la probeta se miden 25 ml de la disolución saturada de iodo y añádelos al embudo. 3) Toma un volumen de hexano de la botella hacia un vaso de precipitados (aprox ml). Con la probeta de 25 ml, mide 7,5 ml de hexano y añádelos al embudo de decantación. LOS VAPORES DE HEXANO SON NOCIVOS: EVITA SU INHALACIÓN DIRECTA 4) Tapa entonces el embudo y tómalo con ambas manos. El embudo debe manejarse con ambas manos: con una se sujeta el tapón y con la otra se manipula la llave. Inclina el embudo con el tapón hacia arriba. Agita suavemente durante unos segundos. Afloja el tapón para liberar el exceso de presión en el interior del embudo. Vuelve a agitar y vuelve a abrir ligeramente el tapón. Por último agita con fuerza durante 20 segundos. 5) Repite la agitación fuerte y deja entonces al embudo situado en el soporte y con el tapón abierto. Espera hasta que las dos fases se distingan nítidamente. 6) Separa físicamente ambas fases.. Coloca otro embudo en un soporte. Abre la llave y recoge lentamente la fase acuosa hasta observar que la interfase se acerca a la llave. En un vaso recoge una pequeña porción de ambas fases. Recoge por último la fase menos densa en un tercer embudo de decantación. A juzgar por los cambios de color el rendimiento de la extracción simple debe ser alto. Sin embargo, puedes comprobar de un modo sencillo si el rendimiento es realmente del 100 % sin más que añadir un indicador visual de iodo, a saber, la conocida disolución de almidón que en presencia de I 2 molecular y anión I - (aq) forma un complejo de color violeta intenso. 7) Toma un tubo de ensayo e introduce unos 2 ml de la disolución acuosa y añade 10 gotas de la disolución acuosa de almidón. Disuelve también un pequeño cristalito de 7

8 KI(s). Agita el contenido y comprueba entonces la coloración de la disolución observándola contra un fondo blanco. DEPOSITA LA FASE ORGÁNICA EN EL FRASCO DE RESIDUOS NO LA TIRES POR EL DESAGÜE Parte 2.- EXTRACCIÓN MÚLTIPLE Si el valor del coeficiente de reparto K es elevado (> 100), con una sola extracción se puede pasar prácticamente todo el soluto a la fase orgánica. No es éste el caso de la extracción simple de iodo con Hexano que resulta ser incompleta, pues aún queda iodo en disolución acuosa. No obstante, puede conseguirse una extracción completa de iodo con 7,5 ml de Hexano, pero en tres porciones, es decir, realizando varias extracciones consecutivas (extracción múltiple). Vas a comprobarlo experimentalmente. 1) Repite los pasos del anterior procedimiento, pero añadiendo los 7,5 ml de Hexano en tres veces, es decir, haciendo tres extracciones con 2,5 ml de Hexano. Ten en cuenta que cada vez que completes una extracción, debes recoger sólo la fase acuosa del embudo de decantación y pasarla a un vaso de precipitados y a otro embudo limpio. 2) La primera extracción se realiza en el primer embudo. La segunda en el segundo embudo (la fase acuosa de la primera extracción se habrá pasado del primer embudo a un segundo embudo). La tercera extracción de nuevo en el primer embudo (la fase acuosa se habrá pasado al primer embudo después de la segunda extracción). 3) Realizada la última extracción, repite la prueba del almidón en la disolución acuosa. Se detecta finalmente iodo en la disolución acuosa? Como acabas de comprobar, para un cierto volumen de disolvente orgánico, es más eficiente dividirlo en porciones y realizar varias extracciones que realizar una única extracción simple utilizando todo el disolvente. En realidad, el rendimiento mayor de la extracción múltiple es una consecuencia termodinámica de los equilibrios consecutivos. Dados el volumen total de fase acuosa Vaq y el volumen de fase orgánica Vorg empleado en cada extracción, puede demostrarse que la fracción a de soluto que permanece en disolución acuosa después de n extracciones viene dada por: n 1 a aq = V org 1 + K Vaq 8

9 Resultados: Contesta a las cuestiones siguientes: Práctica 1 : Extracción líquido- líquido: equilibrio de reparto. Extracción simple de I 2 en disolución acuosa con Hexano. Extracción múltiple. Grupo: Nombres... Cuestiones generales introducción: 1.- Explica si la acetona puede ser un buen disolvente para la extracción de un componente orgánico de una disolución acuosa. 2.- En el ejemplo de reparto del I 2 entre agua y disulfuro de carbono por qué el iodo es mucho más soluble en la fase orgánica? 3.- Si en vez de iodo quisiéramos extraer ácido acético, Cómo influiría el ph de la disolución acuosa sobre el rendimiento del proceso de extracción? Cuestiones parte 1 experimental: 1.- En la etapa 5 Por qué es necesario agitar? 2.- Qué cambios de color has observado? Cómo los interpretas? Identifica inequívocamente las fases en el embudo. Qué fase es menos densa? 3.- Describe aquí tus observaciones sobre el test del almidón. Cuestiones parte 2 experimental: 1.- Supón que K= 2,7 para la extracción de iodo con Hexano. Calcula el rendimiento de la extracción simple y de la extracción múltiple que has realizado 2.- Crees que el coeficiente de reparto es el mismo en una extracción simple que en una múltiple? Observaciones: 9

10 QUIMICA ANALÍTICA II Grado en Química 2º Curso Práctica nº 2 SEPARACIÓN DE Fe Y Al EN UNA MUESTRA ACUOSA MEDIANTE EXTRACCIÓN SELECTIVA CON OXINA. OBJETIVOS Los objetivos fundamentales de la práctica se centran en familiarizar al alumno con: 1. Efecto del ph sobre la selectividad de la extracción 2. Efecto de la formación de complejos en la eficacia y selectividad de la extracción INTRODUCCIÓN La 8-hidroxiquinoleína u oxina de fórmula: N OH (simbolizada por OxH) es un reactivo orgánico soluble en cloroformo y poco soluble en agua en medio neutro. Dado su carácter ácido-base, tiene carácter anfótero, por lo cual la solubilidad de la oxina en agua se incrementa tanto en medio ácido como en medio básico. Puede comportarse como ácido según: H 2 R + pk = 4,91 1 pk = 9,81 2 HR R 10

11 El ph de la disolución acuosa tiene, por tanto, una importancia decisiva en el comportamiento de la oxina como ligando de extracción, ya que afecta tanto a la propia extracción del ligando como a la formación del quelato. A ph entre 5,5 y 9,9 la oxina se halla fundamentalmente en forma molecular, neutra ( OxH ) por lo que es extraída casi en su totalidad al cloroformo. Forma quelatos metálicos (oxinatos) con un gran número de cationes, y dichos oxinatos metálicos son neutros y por tanto son poco solubles en agua, pero muy solubles en cloroformo, de forma que, al agitar una fase acuosa que contiene al metal con una disolución de la oxina en cloroformo, se produce la siguiente reacción: donde se observa que la formación de oxinatos, MOx n, depende del ph de la fase Fase orgánica OxH (cloroformo) MOx n(cloroformo) Fase acuosa noxh + M n+ MOx n + n H + acuosa y solo para K f elevadas se formará el complejo a ph bajos (alta [H + ]). En esta práctica se abordará el estudio de la separación de los oxinatos de hierro y aluminio. El oxinato de Fe (III) se extrae totalmente a partir de ph 2,8, mientras que el oxinato de aluminio no empieza a extraerse hasta ph 3,5, siendo su extracción total a partir de ph 4,5 (ver Figura). En consecuencia, controlando de modo adecuado el ph de la fase acuosa es posible extraer selectivamente el oxinato férrico sin extracción del Al (III). Por todo lo expuesto, el ph debe fijarse con precisión, pues a un valor superior a 3 comienza a extraerse algo de Al (III) junto con el Fe (III). Por ello se recomienda un ajuste estricto del ph entre los límites 2,8-3,0. El oxinato de Fe (III) extraído en cloroformo puede determinarse espectrofotométricamente a las longitudes de onda 470 y 580 nm. La oxina libre presenta un máximo de absorción a 320 nm, sin embargo, es recomendable medir las absorbancias frente a blancos análogos (sin el metal a determinar) de los reactivos. 11

12 REACTIVOS Y MATERIAL Instrumentación: Espectrofotómetro equipado con cubetas de vidrio para la muestra. Las medidas de absorbancia se realizan a 470 nm (hierro). Material : 7 embudos de separación de 100 ml 1 probeta 2 pipetas de 10 ml 1 pipeta de 1 ml 7 tubos ensayo (cubetas) 1 varilla Papel indicador de ph Gradilla Papel de filtro Un vidrio de reloj Una pipeta pasteur 12

13 Reactivos: 1.- Disolución indicadora de oxina al 0,6 % en ácido acético del 0,2 % ( 0,6 g disueltos en 2 ml de AcH concentrado, diluidos a 100 ml). 2.- Amoníaco 5 M (100 ml). 3.- Disolución reguladora ácido acético/acetato amónico 0,1 M de ph 2,85: Se ponen en un vaso de precipitados aproximadamente 200 ml de la disolución de NH 4 Ac 0,1 M y se ajusta el ph a 2,85 utilizando un phmetro con la disolución de AcH, se trasvasa a un matraz de 250 ml y se lleva a volumen con agua destilada. 4.- Disolución de oxina al 0,4 % en Cl 3 CH. Esta disolución debe protegerse del contacto con la luz. 5.- Disolución patrón de Fe (III) de 100 µg.ml -1. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Parte 1.- Curva de calibrado para el Fe 1.-Se ponen en cuatro embudos de separación 20, 40, 60 y 80 μg totales de Fe (III) procedentes de diluciones de la disolución patrón de Fe (III) y contenidos en un volumen no superior a 4 ml, y la cantidad de agua necesaria para completar un volumen de 4 ml; y en un embudo adicional, que se utilizará como blanco de reactivo, 4 ml de agua destilada. 2.- Se añade en cada embudo 1 ml de la disolución indicadora de oxina (disolución 1) y mientras se agita se neutraliza lentamente con amoníaco 5 M (de una a dos gotas cada vez), evitando el exceso local de reactivo hasta que se inicia la formación del oxinato de hierro (color azul sucio). 3.-A continuación, añadir 5 ml de la disolución reguladora y mezclar bien las disoluciones. 4.-Extraer con 10 ml de disolución de oxina en cloroformo se tapa el embudo y se agita vigorosamente 2 o 3 minutos. Tras dejar separar las fases (quitando el tapón del embudo), filtrar la fase orgánica (papel de filtro en el vástago del embudo) sobre la cubeta de medida. 5.- La absorbancia de dicha fase se mide a 470 nm frente a un blanco preparado de forma análoga exento de Fe (III). 13

14 Parte 2.- Determinación de Fe (III) Proceder con la muestra problema tal y como se especifica en la curva de calibrado del Fe (III) (tomar 1 ml de muestra y añadir 3 ml de agua, y realizar dos réplicas de la determinación) con lo cual a ph 2,85 se extrae selectivamente este metal y queda en la disolución la totalidad del Al (III). Se mide la absorbancia a 470 nm de dicho extracto que permite determinar la concentración de Fe (III) en la disolución problema Resultados: a) Representar gráficamente la absorbancia a 470 nm frente a los µg.ml -1 de Fe (III) y ajustar la recta por mínimos cuadrados. b) Determinar la concentración de Fe (III) en la muestra problema por interpolación sobre la curva de calibrado obtenida anteriormente. (Para expresar los resultados, utiliza el modelo de informe de la página siguiente) 14

15 Práctica 2: Separación de Fe y Al en una muestra acuosa mediante extracción selectiva con oxina. Grupo: Nombres.. Resultados para la Determinación de Fe: Muestra Problema:. ml de Fe 100 mg/l µg Fe absorbancia Ajuste por mínimos cuadrados: Ecuación de la recta: R 2 = Muestra Problema: (Para expresar los resultados, utiliza el modelo de informe siguiente) Medida muestra absorbancia µg Fe µg Fe /ml Con formato: Sangría: Primera línea: 1,27 cm Muestra Problema :. ±. µg/ml Fe 15

16 Observaciones:... QUIMICA ANALÍTICA II Grado en Química 2º Curso Práctica nº 3 IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE VITAMINAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) OBJETIVOS 1. Familiarizar al alumno con la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): manejo de instrumentación, control de las separaciones, identificación de picos. 2. Iniciar al alumno en la determinación cuantitativa: El objeto de esta práctica es realizar la determinación de vitaminas liposolubles, A (Retinol), D 2 (Ergocalciferol) y E (a-tocoferol), en un preparado farmacéutico INTRODUCCIÓN El estudio de vitaminas liposolubles (A, D 2, E y K) es de gran importancia tanto en Química Clínica como en Nutrición. Dichas vitaminas presentan una estructura química isoprenoide (Figura 1). Son sensibles a la luz, sufriendo procesos de isomerización u oxidación, y degradándose si se someten a altas temperaturas. Estas propiedades hacen que su determinación por Cromatografía de Capa Fina (TLC) y por Cromatografía de Gases (GC) esté limitada. Sin embargo, la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) resulta adecuada ya que evita el contacto de los analitos con el aire y la luz, llevándose a cabo la determinación a temperatura ambiente. 16

17 VITAMINA A VITAMINA D 2 17

18 Figura 1 REACTIVOS Y MATERIAL VITAMINA E Reactivos 1.- Se suministrarán ya preparados las siguientes disoluciones stock en metanol Vitamina A 1500 µg ml -1 Vitamina D µg ml -1 Vitamina E 9500 µg ml Metanol grado HPLC Material 5 Matraces aforados de 10 ml 3 pipetas de 5 ml Condiciones instrumentales Columna Fase Inversa C18 18

19 Detector de absorbancia Longitud de onda 254 y 280 nm Fase móvil 100 % Metanol Elución Isocrática Flujo 1,5 ml min -1 Inyector Rheodyne Válvula de 6 puertas y bucle de muestra de 20 μl PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: Parte 1.- Preparación de patrones. 1. Para la determinación de tiempos de retención se preparan 10 ml en metanol de disoluciones individuales de vitamina A y vitamina D 2 de las siguientes concentraciones: Vitamina A 75 µg ml -1 Vitamina D 2 50 µg ml -1 Nota: Será necesario calcular los volúmenes correspondientes de los patrones stock que llevados a 10 ml den la concentración requerida. 2. Para la curva de calibrado: Preparad 10 ml en metanol de mezclas de los tres patrones de las siguientes concentraciones Concentraciones (µg ml -1 ) Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Vitamina A Vitamina D Vitamina E Nota: Será necesario calcular los volúmenes correspondientes de los patrones stock que llevados a 10 ml den la concentración requerida. Parte 2.- Identificación: Inyección individual de 2 de los 3 patrones de vitaminas para determinar el tiempo de retención de cada compuesto en las condiciones cromatográficas utilizadas. El tiempo de retención del tercer compuesto se deducirá en las inyecciones de la mezcla de patrones. 19

20 Parte 3.-Medidas para la cuantificación (construcción de la curva de calibrado): Inyección por duplicado de tres niveles de concentración de una mezcla conteniendo las tres vitaminas. Se representará las áreas del pico cromatográfico con la correspondiente concentración para cada caso. Parte 4.-Análisis de un preparado farmacéutico. Determinación cualitativa de las vitaminas consideradas en el extracto metanólico de una muestra real. Se inyectará por triplicado la muestra y se determinará la concentración de cada vitamina según la curva de calibrado Nota: Como muestra, se suministrará el extracto metanólico de un preparado farmacéutico. Resultados: 1. Realiza los cálculos necesarios para preparar las disoluciones de patrones y pásalos al informe. Qué volumen de cada una de las vitaminas tienes que tomar de cada disolución concentrada para preparar cada uno de los niveles de calibrado?. 2. Identifica cada una de las vitaminas mediante su tiempo de retención. 3. A partir del área de los picos cromatográficos de la mezcla de patrones establecer las rectas de calibrado correspondientes a cada patrón mediante análisis de regresión lineal (mínimos cuadrados). Se ajustan los datos al modelo lineal?. 4. A partir de las rectas de calibrado calcular la concentración de cada uno de los componentes del preparado farmacéutico. (Para expresar los resultados, utiliza el modelo de informe de la página siguiente) 20

21 Práctica 3: Identificación y cuantificación de vitaminas por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). Grupo: Nombres Cálculos para preparar las disoluciones de patrones: ml vit A ml vit D 2 ml vit E Nivel 1 Nivel 2 Nivel Identificación de las vitaminas: tr (min) Vit A Vit D 2 Vit E 2. - Rectas de calibrado (ajuste por mínimos cuadrados): Vit A Área (iny 1) Área (iny 2) Área (iny 3) Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Ecuación de la recta vit A: R 2 = Vit D 2 Área (iny 1) Área (iny 2) Área (iny 3) Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Ecuación de la recta Vit D2: R 2 = 21

22 Vit E Área (iny 1) Área (iny 2) Área (iny 3) Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Ecuación de la recta Vit E R 2 = 3. - Cálculo de las concentraciones de vitaminas en el extracto problema: Medida de la muestra Área (iny 1) Área (iny 2) Área (iny 3) Vit A Vit D 2 Vit E Muestra Problema :. ±. µg/ml vit A. ±. µg/ml vit D 2. ±. µg/ml vit E Observaciones:... 22

23 QUIMICA ANALÍTICA II Grado en Química 2º Curso Práctica nº 4 DETERMINACIÓN DE HIDROCARBUROS ALIFÁTICOS EN AGUA DE MAR MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES OBJETIVOS 1. Familiarizarse con la cromatografía de gases como técnica de separación, identificación y cuantificación de especies volatilizables en muestras complejas: manejo de la instrumentación, medida y control de los flujos de fase móvil, características de las fases estacionarias, modos de inyección, control de la temperatura, detección. 2. Aplicación de la técnica a la determinación de hidrocarburos alifáticos en un extracto de agua de mar contaminada. INTRODUCCIÓN La cromatografía de gases es la técnica de elección para la separación de especies fundamentalmente de naturaleza orgánica, volátiles o volatilizables, como los hidrocarburos alifáticos de cadena media. La reproducibilidad en los tiempos de retención de las especies cromatografiadas en las mismas condiciones experimentales que los patrones puros de las mismas, constituye una herramienta identificativa. Por otra parte, la medida del área de los picos correspondientes a cada uno de los componentes separados puede relacionarse con su concentración. 23

24 MATERIAL Y REACTIVOS Instrumentación: Cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama (FID) Columna con fase estacionaria de 5% difenil dimetilpolisiloxano: A) Equity-5 15 m x 0.25 mm D.I. x 0.25 µm fase (cromatógrafo 1) B) HP-5 15 m x 0.53 mm D.I. x 1.5 µm fase (cromatógrafo 2) Microjeringa de inyección Medidor de flujos de burbuja Reactivos: Hexano Hidrocarburos (patrones puros 0,3 %): tetradecano, pentadecano y hexadecano Mezclas de patrones: 0,010 %, 0,020 %, 0,030 % Extracto de muestra de agua problema Material: Viales de 10 ml PARTE EXPERIMENTAL 1. Encender el cromatógrafo de gases y comprobar las presiones de salida en las bombonas de los gases. 2. Medida de los flujos de gas portador (nitrógeno): purga, split y columna (en el detector apagado y con la electrónica en OFF). Como referencia tomar los siguientes valores (aunque pueden cambiar de acuerdo con las indicaciones del profesor): Flujos (ml/min) Columna Split Purga Cromatógrafo Cromatógrafo Encender el detector. Establecer la temperatura del inyector a 200ºC y del detector a 250 ºC. La temperatura del horno se programa de la siguiente forma: Cromatógrafo 1: T inicial : 100ºC, T final : 210ºC con una rampa de 20ºC/min. Cromatógrafo 2: T inicial : 100ºC, tiempo inicial : 1 min, T final : 200ºC con una rampa de 15ºC/min. 4. Inyectar 1 μl de hexano. 24

25 5. Inyectar sucesivamente 1 μl de cada patrón individual de hidrocarburo. Una vez inyectado, tener la precaución de lavar varias veces la jeringa con hexano. Registrar los tiempos de retención de cada hidrocarburo. 6. Preparación de la curva de calibrado: Inyectar por duplicado 1 μl de la mezcla de patrones de cada uno de los 3 niveles de concentración. 7. Inyectar por triplicado 1 μl del extracto del agua problema. Tratamiento de los resultados y cuestiones: 1. Identificar cada uno de los hidrocarburos estudiados en el cromatograma del extracto de la muestra. En qué parámetro te basas para realizar este estudio cualitativo?. 2. Calcular el número de platos teóricos y la altura equivalente a un plato teórico de la columna utilizada a partir de los datos del pico del hexadecano. Qué se pretende evaluar mediante estas medidas? 3. Calcular la resolución de los 2 componentes que eluyen en primer lugar. 4. Representa las curvas de calibrado y realiza el ajuste por mínimos cuadrados. 5. A partir de las curvas de calibrado, calcular la concentración de los hidrocarburos en la muestra de agua, suponiendo que 1 litro de la misma ha sido extraído con 25 ml de n-hexano (extracto a partir del cual se realizan las inyecciones). 6. Es adecuada la fase estacionaria de esta columna para la separación de los hidrocarburos? Qué columna utilizarías para la separación de una mezcla de pesticidas? Y de aldehídos y cetonas?. Consulta algún catálogo para responder. 7. Por qué el inyector de un cromatógrafo de gases se calienta a temperaturas relativamente altas? 8. Qué es un programa de temperaturas y cuál es su finalidad?. (Para expresar los resultados, utiliza el modelo de informe de la página siguiente) 25

26 Práctica 4: Determinación de hidrocarburos en agua de mar mediante cromatografía de gases Grupo: Nombres Identificación de los hidrocarburos en el cromatograma: parámetro utilizado: 2. - Cálculo de N y H (tener en cuenta la longitud de la columna utilizada en cada caso) tr (min) Wb (min) N H 3.- Cálculo de la resolución Rs= 4. - Rectas de calibrado (ajuste por mínimos cuadrados): Tetradecano Área (iny 1) Área (iny 2) Área (iny 3) Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Ecuación de la recta Tetradecano R 2 = Pentadecano Área (iny 1) Área (iny 2) Área (iny 3) Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 26

27 Ecuación de la recta Pentadecano R 2 = Hexadecano Área (iny 1) Área (iny 2) Área (iny 3) Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Ecuación de la recta Hexadecano R 2 = 5. - Cálculo de las concentraciones de hidrocarburos en el extracto problema: Medida de la muestra Área (iny 1) Área (iny 2) Área (iny 3) Tetradecano Pentadecano Hexadecano Muestra Problema :. ±. µg/ml Tetradecano. ±. µg/ml Pentadecano. ±. µg/ml Hexadecano 6. - a) Es adecuada la fase estacionaria de esta columna para la separación de los hidrocarburos? b) Qué columna utilizarías para la separación de una mezcla de pesticidas? Y de aldehídos y cetonas? 27

28 7. - Por qué el inyector de un cromatógrafo de gases se calienta a temperaturas relativamente altas? 8. - Qué es un programa de temperaturas y cuál es su finalidad? Observaciones:... 28

29 QUIMICA ANALÍTICA II Grado en Química 2º Curso Práctica nº 5 DETERMINACIÓN DE CAFEÍNA EN DIFERENTES MUESTRAS (CAFÉ, TÉ Y BEBIDAS DE COLA) MEDIANTE HPLC CON DETECCIÓN UV OBJETIVO 1. Familiarizar al alumno con la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC): manejo de la instrumentación, preparación de la fase móvil, control del flujo de fase móvil, detección. 2. Aplicación de la técnica a la determinación de la concentración de cafeína en diferentes muestras (café, té y bebidas de cola) por HPLC en fase inversa. INTRODUCCIÓN El método tradicional para la determinación de cafeína es medir su absorbancia con un espectrofotómetro. La Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) es un método de separación que se utiliza fundamentalmente para la determinación de sustancias no volátiles, generalmente polares y/o térmicamente lábiles. Con HPLC se consigue separar más fácil y rápidamente la cafeína de otras sustancias, tales como: ácido tánico, ácido cafeico y azúcares, que también se encuentran en este tipo de bebidas. Una vez conectado el cromatógrafo y estabilizado el flujo, se procede a la inyección de disolución patrón de cafeína de distintas concentraciones (2 inyecciones por lo menos de cada nivel). De los cromatogramas resultantes se obtienen los datos de tiempo de retención (t R ) y área de pico. Si el flujo y la presión de la bomba se han mantenido constantes a lo largo de todo el experimento, t R podrá utilizarse como medida cualitativa y el área de pico como medida cuantitativa. Se construye la curva de calibrado (área de pico vs. concentración de los patrones de cafeína) y posteriormente se inyecta la muestra, pudiéndose calcular la concentración del analito presente en la misma. 29

30 REACTIVOS Y MATERIAL Instrumentación: Cromatógrafo de líquidos de alta resolución. Columna cromatográfica de fase Inversa: C 18. Detector de absorbancia UV (λ= 254 nm) Flujo de la fase móvil: 1.5 ml/min Reactivos: Cafeína (patrón puro) Metanol Agua Milli-Q Ácido acético Material: 1 Probeta de 100 ml 6 matraces aforados de 25 ml 1 pipeta de 10 ml, otra de 25 ml y 5 ml Viales de 10 ml Filtros de muestra compatibles con metanol PARTE EXPERIMENTAL 1.-Preparar 1 L de una disolución: 30 % metanol/ 0.1 % ácido acético/ 69.9 % agua ( ph 3.5). Esta disolución se utilizará para preparar los patrones para el calibrado; la misma disolución se utiliza como fase móvil en el sistema cromatográfico, pero se da preparada porque hay que desgasificarla convenientemente, ya sea con una corriente continua de Helio o en un baño de ultrasonidos durante 5 minutos, y este proceso no puede realizarse en el laboratorio de prácticas. 2.-Preparación de la curva de calibrado: A partir de la disolución patrón concentrada de cafeína de 1,000 g/l preparar en 5 matraces de 25 ml, disoluciones de 0,020 g/l, 0,040 g/l, 0,080 g/l, 0,100 g/l y 0,120 g/l, utilizando como disolvente la disolución preparada en el punto 1, y agitando convenientemente para asegurar su homogeneidad. 30

31 3.- Preparar y conectar el sistema cromatográfico: a) Encender la bomba: Fase móvil: Metanol / agua Milli-Q (30:70) acidulada a ph 3.5 Flujo: 1.5 ml/min. b) Encender el detector de absorbancia: Longitud de onda: 254 nm c) Enceder ordenador e impresora [Antes de inyectar los patrones en la columna, dejar pasar fase móvil durante 5-10 min, registrando simultáneamente la respuesta en el detector, para asegurarse de que no quedaron sustancias retenidas en la columna procedentes de experimentos previos y de que la línea de base es estable]. 4.- Realizar 2 inyecciones de cada nivel de concentración de cafeína, de menor a mayor concentración: cargar la muestra con la válvula en posición LOAD (20 µl) e inyectar girando a la posición INJECT. 5.- Preparación de las muestras de bebida: Café: 0.5 g de café en 150 ml de agua caliente. Tomar 10 ml de café, enrasar a 25 ml con metanol/agua/acético (30:69,9:0,1) y filtrar 5 ml de la disolución resultante. Té: 1 bolsa en 150 ml de agua caliente. Tomar 7-10 ml de té, enrasar a 25 ml con metanol/agua/acético (30:69,9:0,1) y filtrar 5 ml de la disolución resultante. Bebidas de cola: 15 ml de bebida de cola (Eliminar carbónico por agitación con varilla). Inyección directa, filtrando. 6.- Inyectar las muestras de bebida por duplicado. TRATAMIENTO DE LOS DATOS Y CUESTIONES Tratamiento de los datos: 1. Determinar a partir del tiempo de retención medio del pico de cafeína patrón qué pico en el cromatograma de la muestra es originado por la cafeína. 2. Construcción de la curva de calibrado: área del pico frente a concentración. 3. Calcular la concentración de la muestra según la curva de calibrado: tomar el área de pico de la muestra e interpolar el valor en la curva de calibrado para determinar la concentración de cafeína en mg/ml. Calcular la media y desviación estándar. Incluir correcciones por dilución en los cálculos. (Para expresar los resultados, utiliza el modelo de informe de la página siguiente) 31

32 Práctica 5: Determinación de cafeína en diferentes muestras (café, té y bebidas de cola) mediante HPLC con detección UV Grupo: Nombres Identificación de la cafeína en el cromatograma: 2. - Rectas de calibrado (ajuste por mínimos cuadrados): Cafeína Área (iny 1) Área (iny 2) Área (iny 3) Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 4 Nivel 5 Ecuación de la recta Cafeína R 2 = 3. - Cálculo de las concentraciones de cafeína en las muestras problema: Medida de la muestra Área (iny 1) Área (iny 2) Área (iny 3) Café Te Cola Muestra Problema :. ±. mg/ml Cafeína en muestra café. ±. mg/ml Cafeína en bebida de Cola. ±. mg/ml Cafeína en infusión de Té Nota: Incluir todas las representaciones gráficas 32

33 Cuestiones: 1.- A qué término inglés corresponden las siglas HPLC y cuál es su significado? 2. - En qué se diferencian HPLC en fase normal y en fase inversa? 3. - En qué se diferencian elución isocrática y elución en gradiente? Y en qué se parecen la elución en gradiente en HPLC y la programación de temperaturas en GC? Los picos (más o menos definidos) que aparecen antes de la cafeína en las inyecciones de las muestras: A qué pueden deberse? Son más o menos polares que la cafeína?. Observaciones:... 33