Aislamiento y caracterización de un consorcio bacteriano causante de la pudrición en florete de brócoli.

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1 INFORME FINAL Aislamiento y caracterización de un consorcio bacteriano causante de la pudrición en florete de brócoli. Fecha de inicio: Septiembre 1 del Fecha de terminación: Agosto 31 del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Celaya Consejo Técnico de las Congeladoras (COTECO) Director del proyecto: Dra. María Alejandra Mora Avilés Colaboradores: Dr. Gustavo Hernández Guzmán y Dr. Rafael Bujanos Muníz INTRODUCCION El presente proyecto se propuso a la Fundación Guanajuato Produce, como una propuesta de investigación básica para estudiar la etiología de la pudrición de florete de brócoli del Estado de Guanajuato. El Estado de Guanajuato es el principal productor de brócoli en México (INEGI 2002). Se obtienen ganancias considerables por su comercialización tanto en fresco como procesado, en el mercado nacional y extranjero. Sin embargo existen pérdidas considerables en la producción de brócoli, debidas principalmente a tres factores: 1) problemas agronómicos, 2) mal manejo del producto después de la cosecha y 3) enfermedades que afectan la calidad del producto, como es la pudrición en el florete. Existen soluciones prácticas para resolver los problemas agronómicos y de manejo postcosecha, como puede ser la aplicación de medidas de calidad total, buenas prácticas de agricultura aplicadas al cultivo del brócoli o sistemas de enfriamiento y conservación del producto una vez que ha sido cosechado. Algunas de estas medidas son actualmente aplicadas, sin embargo es necesario el tener mejor control de calidad en todos los procesos desde la siembra de semilla en invernadero, hasta la cosecha. Para el caso específico del control de las enfermedades que afectan la calidad del producto, la solución es más complicada, pues existen diferentes factores que propician en diferente medida la aparición de enfermedades. Sin lugar a dudas, el factor desencadenante de la enfermedad es la alta humedad en el cultivo. Cuando no es temporada de lluvias, la producción es afectada principalmente por los cambios bruscos de temperatura, la elección de variedades y los insectos que siempre están presentes. En la mayor parte del año el problema de pudrición de florete es casi nulo, aún y con la alta densidad de plantas y la alta fertilización que se aplica. Sin embargo, cuando comienza la temporada de lluvias, los floretes de brócoli comienzan a presentar la pudrición

2 de manera constante y sin importar que variedad esté sembrada, si el predio tuvo o no problemas por pudrición en la temporada anterior o incluso si es el primer año de siembra de brócoli. Luego entonces, el o los microorganismos causales de la pudrición están presentes en el ambiente. El manejo agronómico es igualmente importante e influye de manera considerable en la aparición de la enfermedad. En aras de aumentar la producción de brócoli, se aumenta la densidad de plantas por surco, se incrementa la fertilización y se tienen malas prácticas de cultivo, como el no hacer limpieza de las parcelas de tejidos enfermos, aunado a la nula rotación de cultivos. Es muy importante el introducir un control de calidad más rígido en los puntos anteriores, especialmente en el caso de limpieza de plantas enfermas y rotación de cultivos. Como se puede apreciar, el problema es una conjunción de factores que por desgracia se agrava en la temporada de lluvias, provocando pérdidas cuantiosas, llegando al extremo de considerar no cultivar brócoli en los meses de Junio a Septiembre. ANTECEDENTES La etiología de la pudrición del florete de brócoli no se conoce. Se tienen datos preliminares que indican la presencia de bacterias de los géneros Erwinia, Xanthomonas y Pseudomonas y hongos Alternaria y Phoma en floretes que presentan la pudrición. Utilizando estos aislados bacterianos y de hongos, se han hecho estudios serios para evaluar su participación en la enfermedad, sin embargo, no se ha podido identificar cual es el organismo causal de la pudrición. La compañía Sakata Seeds presentó el año pasado un folleto con datos que proponen al hongo Alternaria como el agente causal de la pudrición del florete de brócoli. Sin embargo no se ha publicado ningún reporte científico que avale las conclusiones propuestas. La mayor parte de la investigación se ha enfocado a evaluar la participación de los hongos como agentes causales de la pudrición y no se ha estudiado la participación de la comunidad bacteriana en la enfermedad, el cual es el objetivo principal del presente proyecto de investigación. Se tienen reportes de diferentes géneros bacterianos como agentes causales de diferentes enfermedades en brócoli (Bertelsen, 1994; Duthie, 1999) Pudriciones causadas por Phoma lingam, Erwinia carotovora y Xanthomonas campestris. Infecciones o manchados foliares, causados por Alternaria, Peronospora y Pseudomonas syringae pv. maculicola. No se conoce si los patógenos antes descritos pueden interactuar a manera de consorcio para producir la enfermedad. Se realizaron búsquedas en los bancos de datos para saber si existen asociaciones de bacterias que causen alguna enfermedad, pero no se encontró ninguna que haya sido reportada en plantas. Una vez que se aclare cual es el agente causal de la enfermedad se podrá proporcionar elementos para un control efectivo de los patógenos. Limitando la acción de los patógenos, se aumentará la producción del cultivo.

3 Otro beneficio muy importante es la generación de conocimientos básicos, derivados del estudio de la interacción entre los microorganismos y la planta hospedera. Resulta muy interesante el esclarecer la naturaleza de la asociación microbiana causante de la pudrición del brócoli, pues será uno de los primeros reportes de este tipo y los resultados que se obtendrán de su estudio, nos brindarán un modelo original de patogénesis que no ha sido completamente estudiado. A largo plazo dicho conocimiento generado, no solo permitirá entender el o los mecanismos específicos de patogénesis de los microorganismos en cuestión, sino que también nos brindará herramientas para el estudio de la regulación de la patogenicidad en otras bacterias. Como consecuencia nos permitirá diseñar estrategias de control de dichas enfermedades. OBJETIVOS a) General Estudiar los microorganismos causantes de la pudrición del brócoli y caracterizar su interacción con la planta hospedera. b) Particular 1. Aislar y caracterizar hasta especie o patovar a los microorganismos causantes de la pudrición del brócoli. 2. Determinar las relaciones filogenéticas de los diferentes aislados. 3. Estudiar las diferentes etapas de la interacción de los microorganismos y la planta hospedera. 4. Investigar si en la enfermedad, la presencia de uno de los fitopatógenos es el responsable del establecimiento de los otros. MATERIALES Y METODOS Muestreo de floretes con pudrición. Se colectaron muestras de floretes maduros de brócoli mas de 60 días (en cosecha), que mostraban pudrición observable a simple vista. Se tomaron floretes que presentaban diferentes estadios de la enfermedad, desde una pudrición apenas observable, hasta floretes que presentaban lesiones mayores a 3 cm. de diámetro. Así mismo se colectaron muestras de brócoli sanas como control. El muestreo se hizo en tres localidades diferentes: 1. Rancho Santa Maria Municipio de Huanímaro. Propiedad del Sr. Rubén Chacón Z. La variedad colectada fue Legacy. 2. Rancho Villa Verde, propiedad de Gigante Verde. Se desconoce la variedad. 3. Planta Gigante Verde. Las muestras fueron procedentes de Puebla y se desconoce la variedad. Aislamiento de las bacterias

4 Se tomaron las regiones afectadas de varios floretes, tratando de tener toda la gama de zonas infectadas (desde la más pequeña, hasta la completamente necrosada). El tejido se esterilizó superficialmente con NaOCl 3 0.5% (v/v) por 5 minutos, seguido de 3 lavados con agua destilada estéril. Todo se realizó en condiciones asépticas, utilizando morteros estériles y se colectó el macerado en tubos Eppendorf estériles. Se centrifugaron 5 minutos a 5000 rpm y se colectó el sobrenadante libre de sólidos. Se plaquearon 100 µl de sobrenadante en medio KB con Cicloheximida 100 y sin el antifúngico e incubando a 28 C por 3 días, al término del cual se analizaron las colonias en base a características morfológicas. Protocolo de infección de plántulas de crucíferas (modificado de Silo-Suh et al. 2002) 1. Germinación: Se colocan las semillas de brócoli o de coliflor en un matraz y se agrega agua destilada. Se agita a 37 C por 30 minutos. Este paso es para eliminar el fungicida que cubre a la semilla. Puede obviarse, pues aparentemente no hay interferencia entre la bacteria y el fungicida. No se muestran los nombres de las variedades utilizadas para evitar mal manejo de la información. Una vez que se tengan pruebas contundentes que indiquen cual variedad es mas resistente a la infección, se dirá el nombre de tal variedad. Se desinfectan las semillas en NaOCl 2 0.5% por 5 minutos y posteriormente se hacen tres lavados con agua destilada estéril. Colocar las semillas sobre un papel humedecido con agua destilada estéril en placas de Petri y cubrir con la tapa. Las semillas se dejan germinar a temperatura ambiente sobre la mesa del laboratorio en un lugar que reciba luz solar. Hacer mediciones diarias del progreso de la plántula y de los signos de enfermedad (lesiones acuosas, necrosis y clorosis). 2. Infección. Se utilizaron germinados de brócoli y coliflor de 3 semanas post-siembra (cámara plástica transparente, sobre sustrato de papel absorbente humedecido con agua destilada estéril. Ciclo luz/oscuridad 12:12 a 25 C), a las cuales se hizo una herida con una aguja calibre 21 en las hojas cotiledonarias y posteriormente se aplicó 3µl de una suspensión de bacterias ajustada a A 600 =0.1. Las bacterias seleccionadas para el análisis preliminar fueron la NFB1, NFB9 y PX3. Se dejó el tiempo pertinente para que la suspensión se absorbiera (15 minutos aproximadamente), se taparon nuevamente las cámaras y se incubaron en las mismas condiciones de germinación. Se realizaron observaciones cada 24 h para evaluar la evolución de la infección. Protocolo de infiltración de plantas de brócoli Se utilizó una modificación del protocolo descrito para infección de alfalfa (Silo-Suh et al. 2002). Las plantas de brócoli de más de 6 semanas fueron

5 proporcionadas por la I. A. Martha Ramírez (de la compañia MarBran). Se prepararon suspensiones celulares de cada uno de los aislados y se ajustó la densidad óptica a una A 600 = 0.1 en un regulador de fosfato de sodio 50 mm. Posteriormente se hizo una dilución en el mismo regulador a 1:10 de las suspensiones anteriores, de tal manera que se obtenga ahora una suspensión con una A 600 = 0.01 aproximadamente. Se infiltraron dos hojas por planta, utilizando una jeringa de insulina sin aguja. Las infiltraciones se distribuyeron como se muestra en la siguiente figura. PO Figura 1. Esquema de infiltración de hoja de brócoli. Se infiltraron las hojas a través del envés como se describe en el texto. PO 4 - es el regulador de fosfatos 50 mm. 0.1 y 0.01 corresponden a las suspensiones ajustadas a A 600 = 0.1 y 0.01 respectivamente. Se realizaron observaciones diarias de las plantas, hasta completar 8 días después de la infiltración. Se anotaron la aparición de signos de enfermedad tales como lesiones acuosas, necrosis o clorosis. Caracterización genética de los aislados Se utilizó como estrategia para identificar a los aislados a la secuenciación del producto de PCR de la región intergénica del gen 16S ribosomal. Para ello utilizamos como DNA templado a 1 µl de cultivo reciente del aislado a analizar, y los oligonucleótidos 16S 3 y 16S 5 diseñados por el Dr. Gilberto Mosqueda Cano de CINVESTAV Irapuato. Se utilizaron reacciones de 25 µl de la mezcla Platinum High Fidelity PCR de Invitrogen, siguiendo las recomendaciones del proveedor. La temperatura de alineamiento fue de 65 C y se empleó Hot Start de 1 minuto. La secuenciación se realizará en la unidad de secuenciación del CINVESTAV Irapuato utilizando el protocolo apropiado para la secuenciación directa de productos de PCR. RESULTADOS Las bacterias aisladas Después de haber re-sembrado las bacterias aisladas, se han obtenido los siguientes fenotipos coloniales: 1. Colonias fluorescentes (la fluorescencia no es tan brillante, es obscura) pequeñas. Corresponden a los aislados NFB1, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 17 y 18. La notación NFB corresponde a Necrosis del Florete de Brócoli.

6 2. Colonias fluorescentes pequeñas que después de un tiempo en refrigeración se vuelven amarillo cremoso y mucoides. La fluorescencia es brillante. Corresponden a los aislados NFB2, 3, 4, 5, 6, 11, 14 y Colonias blanco-grisáceo (cremoso), brillantes, mucoides. Corresponden a los aislados X1 y 4. La notación X, corresponde a un aislado que probablemente sea Xanthomonas o Erwinia. El aislado X3 presenta el mismo fenotipo, sin embargo es un bacilo Gram positivo y eso lo descarta de ser Xanthomonas o Erwinia. 4. Colonias Blanco-grisáceo que en sectores coalescen y forman una placa continua. Se denominó X2. Al microscopio se observaron cocos Gram positivos. 5. Dos de los aislados fueron de aspecto cremoso y mucoide. Estos fueron aislados de brócoli aparentemente sano y por ello se denominaron S1 y S2. La notación S, corresponde a tejido Sano. Caracterización genética de los aislados. Se tienen los productos de PCR correspondientes a cada uno de los aislados. La secuenciación está en progreso. Posteriormente se hará el análisis de las secuencias y esto nos permitirá conocer cual es la identidad de los aislados. La caracterización mediante pruebas bioquímicas nos brindará plena seguridad de la identidad de los aislados. Esta última prueba está en espera pues no han llegado los reactivos de la prueba. Infecciones en plantas de brócoli. Protocolo 1. Ensayo en germinados de 3 días de edad: solo un aislado de Pseudomonas fue patogénico para la mayoría de los cultivares. Se observó necrosis y en algunos casos clorosis. Protocolo 2. Ensayo en germinados de 3 semanas de edad. Solo un cultivar fue susceptible a todos los aislados. Se observó necrosis y clorosis. Protocolo 3. Infiltración en plantas de más de 6 semanas de edad. Al parecer este fue el mejor de los protocolos, pues se alcanzaron a distinguir mejor los signos de la enfermedad. Se obtuvieron principalmente cuatro fenotipos: Necrosis y clorosis. Necrosis tipo respuesta de hipersensibilidad. Necrosis localizada en el sitio de infiltración. Tejidos aparentemente sanos. Necrosis y clorosis. Como se puede observar en las figura 2 y 3, se observan los signos clásicos de una infección bacteriana, la necrosis y clorosis. En ningún caso se detectaron lesiones acuosas en los primeros 4 días. Se incluyeron dos controles bacterianos, Pseudomonas syringae pv maculicola M2 (Psm M2), un patógeno de crucíferas y que se esperaba pudiera infectar al brócoli y Pseudomonas syringae pv tabaci, un patógeno de tabaco, el cual de manera inesperada fue

7 capaz de infectar a brócoli de la misma manera que Psm M2 (datos no mostrados). De todos los aislados bacterianos, únicamente el NFB15 (Bacilo Gram negativo, fluorescente) fue el que produjo necrosis y clorosis. La clorosis producida es inclusive más abundante que la producida por las Pseudomonas utilizadas como control. Es probable que este aislado contenga los genes de síntesis de Coronatina, sin embargo hace falta su detección por PCR para tener la evidencia experimental. Este experimento está en curso. Figura 2. Infiltración con Psm M2. Figura 3. Infiltración con NFB15. Figura 4. Infiltración de NFB10 Figura 5. Infiltración con XS3

8 Figura 6. Infiltración con X1 Figura 7. Infiltración con NFB1. De manera muy interesante se obtuvieron pocas reacciones de hipersensibilidad bien marcadas (HR por sus siglas en inglés. Figuras 4 y 5), las cuales aparecieron claramente a las 24 h post-infiltración. Cabe señalar que la HR se caracteriza por muerte celular (necrosis) entre las 12 y 24 h y es una reacción de defensa de la planta para detener la infección de los posibles patógenos. Sin embargo se presentó un fenotipo similar a una HR en un buen número de aislados (NFB3, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 16, 17 y en X1 y X2). Este fenotipo se caracteriza por una HR localizada únicamente en la zona de infiltración (Figura 6). La necrosis apareció entre los 5 y 8 días posteriores a la infiltración y no se observa clorosis. El último fenotipo es el correspondiente a las plantas que al ser infiltradas con los aislados NFB1, 2, 4, 5, 6, PX2 y XS4, se observan aparentemente sanas (figura 7). Únicamente se observa una lesión similar al control negativo (regulador de fosfatos). Se va a repetir el experimento para estar completamente seguros del fenotipo de estas bacterias. En resumen. Se tienen varios aislados provenientes de necrosis de florete de brócoli, los cuales en su mayoría no son patógenos (basados en la respuesta de hipersensibilidad) y salvo el resultado de una nueva repetición del experimento, aparentemente solo uno de los aislados es patógeno para brócoli, siendo capaz de producir necrosis y clorosis. Es muy probable que este aislado sea Pseudomonas, pues concuerdan todas las características coloniales y de producción de pigmentos fluorescentes. Sin embargo la caracterización genética y bioquímica será la que nos indique sin lugar a dudas su identidad. Trabajo a futuro. A pesar de que vamos atrasados en algunos objetivos, hemos avanzado un poco en la caracterización de la patogenicidad de los aislados. Esto es un buen avance pues nos permite reducir el número de patógenos que se utilizarán

9 en las infecciones de plantas completas y su posterior caracterización de la interacción con la planta y otros microorganismos. A continuación se enumeran los objetivos a cumplir y un cronograma de actividades a cumplir. 1. Se terminará la caracterización de los aislados (caracterización genética y bioquímica). 2. Determinación de perfil de toxinas en los aislados. 3. Primeros ensayos de infección en plantas con florete en diferentes estadios, en condiciones controladas y en campo. 4. Ensayos de infección con mutantes no productoras de Coronatina y su análisis respecto a otros aislados. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Descripción de la actividad Pruebas de Gram in vivo Responsable Dr. Hernández Inicio / Término mes / año Búsqueda continua de muestras Pruebas bioquímicas de API Hernández PCR diagnóstico Dr. Hernández 1 al 30 de Junio LOPAT Dr. Hernández 1 al 30 de Junio Pruebas de infección con P. s. Hernández/Dr. pv. tomato DC3000 Bujanos en diferentes cultivares Infeccion con DC3000 y la mutante COR - Mutagénesis específica en cada cepa Caracterización de las mutantes Ensayo de infección con las diferentes cepas y las mutantes Reportes anual y parciales Análisis de datos Hernández Dr. Hernández Observaciones Depende de la existencia de muestras infectadas. Depende de la llegada del kit 1 al 30 de Julio Repetición a los 15 días o cuando se obtenga planta Julio, Agosto y Septiembre del 2004 Agosto a Diciembre 2004 Dr. Hernández Diciembre del 2004 a Agosto 2005 Julio a Septiembre Hernández del 2005 Hernández Hernández/Dr. Bujanos Los indicará la Fundación Continuamente durante el proyecto

10 Escritura de artículo Tutorías o revisiones de tesis Hernández/Dr. Bujanos Hernández/Dr. Bujanos Diciembre del 2003 a Febrero del 2004 Continuamente durante el proyecto REFERENCIAS. Bertelsen, D., R. Dismukes, et al. (1994). Broccoli: An Economic Assessment of the Feasibility of Providing Multiple-Peril Crop Insurance. Prepared by the Economic Research Service, USDA in cooperation with the University of California for the Federal Crop Insurance Corporation. Duthie, J., J. Damicone, et al. (1999). Diseases of Leafy Crucifer Vegetables. Stillwater, OK, Oklahoma State University. INEGI (2002). Volúmen de la producción agrícola según principales cultivos. México, SAGARPA. Anuario Estadístico de la Producción Agrícola de los Estados Unidos Mexicanos, Silo Suh et al. A simple alfalfa seedling infection model for Pseudomonas aeruginosa strains associated with cystic fibrosis shows AlgT (sigma-22) and RhlR contribute to pathogenesis. PNAS (2002) 99(24):