RESUMEN DE INVESTIGACIÓN: SHAPING THE P53 RESPONSE WITH NUCLEOPORINS

Transcripción

1 RESUMEN DE INVESTIGACIÓN: SHAPING THE P53 RESPONSE WITH NUCLEOPORINS Resumen En este artículo se revela la nueva función que posee la nucleoporina Nup98 como mecanismo adaptativo al estrés genotóxico gracias a la protección de mrnas de p21 inducido por p53, lo que sugiere que el fenotipo salvaje Nup98 puede poseer la función supresora de tumores. Álvaro Caballero Lombraña Genética molecular, grado en Biología, 2013/2014

2 INTRODUCCIÓN Nup98 El complejo de poro nuclear (NPC) es la puerta que permite el tráfico de moléculas entre el núcleo y el citoplasma. Sin embargo en esta última década se han descubierto nuevos papeles de las nucleoporinas (Nups), que son las proteínas que forman los NCP, el ejemplo es la Nup98 que fue encontrada en el interior del núcleo [1]. Durante la mitosis Nup98 es necesaria para preservar los checkpoint de la mitosis y para la correcta formación del huso mitótico. [2,3]. La última de las funciones descritas para Nup98 es que posee una actividad reguladora post-transcripcional que estabiliza una serie de mrnas que son transcritos gracias a p53, esto nos indica que puede estar implicada en la ayuda a la actividad supresora de tumores de p53 [4]. Se puede observar esta última función en la figura Figura 1. Nup98 regula la estabilidad de los mrna de los genes diana de p53 impidiendo su degradación por el Exosoma. Figura tomado de Melanie L. Shaping the p53 Response with Nucleoporins El gen supresor de tumores p53 posee una serie de funciones como regulador transcripcional de una gran variedad de genes diana. Muchos de eso genes median una 1

3 serie de respuestas celulares relacionadas con el arresto del ciclo celular, senescencia y apoptosis [5]. Una de las primeras evidencias de que Nup98 era necesario para la activación de los genes relacionados con la respuesta al estrés, progresión del ciclo celular y desarrollo, fue descubierta en Drosophila [6]. Por lo tanto se puede afirmar que la función del fenotipo salvaje de Nup98 en el desarrollo de tumores es desconocida. RESULTADOS [4] La eliminación selectiva de de Nup58 reduce los niveles del mrna de p21 tras la activación de p53 Se transfectaron células de cáncer de hígado (HepG2) (wild-type p53) con un sirna de Nup98 y se trataron con camptotecina que induce la activación de p53. Para comprobar la activación de los mrna de los genes diana de p53, se analiza mediante una qrt- PCR y Proteína mediante un Western blot. Los siguientes genes que incluyen p21, PUMA, GADD45, NOXA Y ATF3 fueron analizados. Se puede observar en la figura 2A en las columnas tercera y cuarta las células transfectadas con el sirna. Si comparamos con el control positivo, segunda columna, podemos observar que hay una disminución del mrna de p21 correlacionada con la disminución de Nup98. También se observa en la figura 2B, mediante el análisis con un inmunoblot, que hay una disminución de la proteína p21 en las células transfectadas con el sirna Nup98. Figura 2. Eliminación de Nup98 reduce los niveles de mrna y proteína p21. (A) Análisis de la expresió de mrna de células de cáncer de hígado tratadas con camptotecina tanto control como transfectadas con sirna de Nup98 (98#1 y 98#2) mediante qrt-pcr. (B) Células de cáncer de hígado tratadas como en (A) se analiza la expresión de proteínas mediante inmunoblot. Figura modificada de Singer, E, Nuclear Pore Component Nup98 Is a Potential Tumor Suppressor and Regulates Posttranscriptional Expression of Select p53 Target Genes 2

4 Nup98 regula p21 mediante un mecanismo post-transcripcional Para determinar que fase de la expresión de p21 es regulada por Nup98, se compara la inducción del mrna de p21 naciente que no ha sufrido splicing y el maduro que sufrió splicing en células HepG2. Para ello se utiliza primers que se unen a las regiones intrónicas del mrna de p21 que no ha sufrido splicing (tanto al primero como el segundo intrón) o primers que se unan a la región exónica que nos permitan detectar el mrna que sufrió splicing, es decir, el mrna maduro de p21 (las células son tratadas con camptotecina) (figura 3A). Se observó que tanto en los primers que se unían al primer intrón como al segundo intrón los niveles del mrna de p21 se mantenían constante en las células 98#1 y 98#2 en comparación con las células control (figura 3A, panel superior derecho y panel inferior izquierdo), en cambio en el caso del análisis de mrna de p21 maduro se observa como hay una disminución de los niveles de mrna maduro de p21 respecto al control (figura 3A, panel inferior derecho). Para confirmar que la reducción de los niveles del mrna de p21 eran independientes de la iniciación de la transcripción y poder descartar cualquier defecto en el splicing, se utilizó una línea celular (H1299) que era defectiva en p53 (no expresa p21 endógeno) pero si poseía un constructo de cdna de p21 bajo el control de un promotor artificial. Este constructo no poseía las regiones intrónicas pero poseía la región 3 -UTR de p21. En esas células se observaba como había una disminución tanto del mrna maduro de p21 como de los niveles de proteína p21 (figura 3B). Basándose en estos resultados se puede tomar la hipótesis de que Nup98 estabiliza el mrna maduro de p21 [4]. Para demostrarlo se realizó un experimento que mide la vida media de los mrna bloqueando previamente la transcripción con actinomicina D, en presencia o no del sirna de Nup98. Como se observa en la figura 3C hay una reducción significativa de la vida mida en el caso en que tengan ausente Nup98. Con estos datos se puede concluir que la regulación del mrna de p21 media por Nup98 ocurre mediante un mecanismo independiente de splicing post-transcripcional que estabiliza el mrna maduro de p21 [4]. 3

5 Figura 3. Regulación post-transcripcional de p21 por Nup98. (A) Análisis mediante qrt-pcr de los niveles del mrna de p21 en células HepG2. (B) Análisis mediante qrt-pcr e inmuno blot de los niveles de mrna de p21 y proteína p21 respectivamente. (C) Análisis mediante ensayo de análisis de la vida media de los mrna de p21. Figura modificada de Singer, E, Nuclear Pore Component Nup98 Is a Potential Tumor Suppressor and Regulates Posttranscriptional Expression of Select p53 Target Genes CONCLUSIÓN Gracias a un RNAi que interfiere con el complejo nuclear de poro podemos observar que esto genera un efecto pleiotrópico en los genes diana de p53. Mientras que si sólo eliminamos una nucleoporina, Nup98, se reducen selectivamente los niveles de acumulación del mrna de p21. Esto nos permite dilucidar que Nup98 actúa mediante un mecanismo post-transcripcional que estabiliza el mrna maduro de p21. Nup98 previene la degradación del mrna de p21 por el exosoma. 4

6 Otra hipótesis que se puede obtener de estos resultados es que la asociación de Nup98 con la región 3 -UTR del mrna de p21, podría reclutar factores adicionales que estabilizasen el mrna de p21 en el citoplasma para impedir la degaradación por el exosoma. Como resultado de este estudio se espera que en futuros estudios se pueda descifrar las circunstancias bajo las cuales Nup98 podría actuar como barrera contra la formación del cáncer. BIBLIOGRAFÍA 1.- Enninga, J., Levy, D.E., Blobel, G., and Fontoura,B.M. Role of nucleoporin induction in releasing an mrna nuclear export block. (2002). Science 295, Jeganathan, K.B., Malureanu, L., and van Deursen, J.M. The Rae1-Nup98 complex prevents aneuploidy by inhibiting securin degradation. (2005). Nature 438, Cross, M.K., and Powers, M.A. Nup98 regulates bipolar spindle assembly through association with microtubules and opposition of MCAK. (2011). Mol. Biol. Cell 22, Singer, E., Zhao R., Barsotti A.M., Ouwehand A., Fazollahi M, Coutavas E., Breuhahn K., Olaf Neumann, Thomas Longerich, Tobias Pusterla, Maureen A. Powers, Keith M. Giles, Peter J. Leedman, Jochen Hess, David Grunwald, Harmen J. Bussemaker, Robert H. Singer, Peter Schirmacher and Carol Prives. Nuclear Pore Component Nup98 Is a Potential Tumor Suppressor and Regulates Posttranscriptional Expression of Select p53 Target Genes. (2012). Mol. Cell 48, this issue, Vousden, K.H., and Prives, C. Blinded by the light: the growing complexity of p53. (2009). Cell 137, Capelson, M., Liang, Y., Schulte, R., Mair, W., Wagner, U., and Hetzer, M.W. Chromatin-bound nuclear pore components regulate gene expression in higher eukaryotes. (2010) Cell 140,