EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO Y LA ADICIÓN DE SALES DE CALCIO Y/O MAGNESIO EN LA PRODUCCIÒN DE NARINGINASA POR MEDIO DE Aspergillus niger

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1 EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO Y LA ADICIÓN DE SALES DE CALCIO Y/O MAGNESIO EN LA PRODUCCIÒN DE NARINGINASA POR MEDIO DE Aspergillus niger RESUMEN El presente trabajo aporta información del efecto de la naringina, melaza o ramnosa, como fuentes de carbono, y las sales de Ca 2+ y/o Mg 2+ en la producción de naringinasa por medio de Aspegillus niger ATCC1015, el cual es un microorganismo productor de ácido cítrico y no produce toxinas. Primero se evaluó por cromatografía en capa fina la capacidad productora de naringinasa por la cepa empleada, lo cual permitió conocer que el microorganismo empleado tuviera presuntivamente la capacidad de producir naringinasa. Para conocer el efecto de las diferentes fuentes de carbono de interés, se empleó un caldo nutritivo base, adicionado con naringina, ramnosa o melaza, y/o sales de calcio y magnesio. Las fermentaciones se llevaron a cabo bajo las mismas condiciones de temperatura y agitación. Cada 24 horas durante los siete días de la fermentación se cuantificó el peso del micelio, la producción de proteína y la actividad enzimática de la naringinasa producida, además se determinó mediante diferentes modelos gráficos las contantes de Vmáx y Km para la naringinasa que mostró mayor actividad enzimática. Las constates de Vmáx y Km de la naringinasa obtenida fueron comparadas contra las de la naringinasa comercial de Penicillium decumbens, la cual también se determinó en este trabajo. A partir de las investigaciones realizadas en la presente investigación se encontró que la melaza y la adición de carbonato de calcio favorecieron significativamente el crecimiento del microorganismo, pero no la producción de proteína y la actividad enzimática. También se encontró que para favorecer la producción proteica se debe emplear como fuente de carbono a la naringina y se debe adicionar la mezcla de las sales de calcio y magnesio. Por otra parte, la fuente de carbono que permitió obtener una mayor actividad enzimática fue la ramnosa sin adición de sales. Finalmente, 1

2 se encontró que la naringinasa producida bajo las condiciones de este trabajo presenta la misma actividad específica que la naringinasa comercial, lo cual la convierte en una enzima que puede competir con la enzima que se encuentra en el mercado. 2

3 INTRODUCCIÓN La implementación de enzimas, con aplicación en la industria de los alimentos, ha aumentado en años recientes. Un ejemplo de esto son las glucanasas, utilizadas en la panificación, la extracción y clarificación de jugos (Villena y Gutiérrez, 2003) o las enzimas quimosina y pepsina, que forman el cuajo para la fabricación de quesos, solo por mencionar algunas (Montes y Magaña, 2002; Manzanares y col, 1997). La aplicación de enzimas en los alimentos presenta una serie de ventajas de índole económica o tecnológica. La gran especificidad de acción que tienen las enzimas hace que no se produzcan reacciones laterales imprevistas. Además, las enzimas pueden inactivarse fácilmente cuando se considere que ya han realizado su misión, quedando entonces asimiladas el resto de las proteínas presentes en el alimento (Montes y Magaña, 2002). La naringinasa es una enzima que está siendo utilizada en la industria de los alimentos con una aplicación importante en el proceso de desamargor en los jugos de uva y otras frutas cítricas. La naringinasa es un complejo enzimático que presenta actividad α-l-ramnosidasa (EC ) y β-d- glucosidasa (EC ) capaz de hidrolizar a la naringina, el cual es el mayor y principal componente del amargor en jugos de uva y varias frutas cítricas (Thomas y col, 1958; Griffith, 1969; Dunlap y col, 1962; Ono y col, 1978). La naringina es abundante en frutas inmaduras y su concentración decrece en frutas maduras. Su presencia ha sido la mayor limitación en la aceptación comercial de los jugos de frutas. La hidrólisis de la naringina produce naringenina la cual es insípida, lo cual ayuda a la mejor aceptación de los jugos por la disminución de su amargor (Yusof y col, 1990). La información sobre la α-l-ramnosidasa de la naringinasa es limitada y su producción ha sido asociada con plantas (Hall, 1938; Thomas y col, 1958, Ting, 3

4 1958; Kaji y Ichimi, 1973), gastrópodos marinos (Kurosawa y col, 1973), y microorganismos (Manzanares y col, 199, Young y col, 1989; Shanmugam y Yadav, 1995). Por razones de viabilidad, solo los procesos basados en naringinasas microbianas son viables (Munish y Uttam, 2000). Tal es el caso de Aspergillus niger quien es considerado como el mejor productor de naringinasa extracelular (Kishi, 1955) y Aspergillus terreus quien es bien conocido como un hongo productor eficiente de enzimas extracelulares de interés para la industria de alimentos (Gallego y col, 1996). Existe poca información disponible en cuanto a la producción de la naringinasa y mucha información está guardada como secreto industrial o está patentada (Ito y Takiguchi, 1970; Fukumoto y Okada, 1973; Wulbrandt y col, 1995). Algunos reportes científicos ofrecen una información muy ambigua acerca de las condiciones de producción de la naringinasa. Se ha reportado que la producción de naringinasa mediante hongos filamentosos esta favorecida por los iones metálicos como Ca 2+ y Mg 2+. Sin embargo, se ha encontrado que dichos iones no son indispensables (Munish y col, 2005; Gallego y col, 2001). También se ha reportado que la enzima es reprimida por la presencia de glucosa (Bram y Salomons, 1965) lactato, citrato, sacarosa, fructosa y almidón (Munish y Uttam, 2000). Por otra parte se ha encontrado que la producción de la enzima disminuye abajo de ph 4 y es estimulada en presencia de los sustratos naringina, ramnosa, melaza (Munish y col, 2005; Gallego y col, 2001) y licor de maíz (Munish y Uttam, 2000). La naringinasa de origen microbiano que existen actualmente en el mercado presenta una eficacia muy deficiente de la hidrólisis de la naringina, por lo que es necesario llevar a cabo estudios para conocer las condiciones de producción y encontrar una enzima naringinasa que presente una mejor capacidad de hidrólisis. Por ello en este estudio se utilizarán diferentes fuentes de carbono y iones metálicos para conocer su efecto en la producción de la enzima naringinasa y en 4

5 su capacidad de hidrólisis. Asimismo, se llevará a cabo una comparación de la actividad de la naringinasa producida por Aspergillus niger (ATCC 1015), la cual es una cepa principalmente productora de ácido cítrico, y la naringinasa comercial pura (producida por Penicillum decumbens) para conocer si la enzima producida por A. niger presenta mayor capacidad de hidrólisis que la enzima comercial. 5

6 MATERIALES Y MÉTODOS En el siguiente diagrama de flujo (Fig. 1) se observa de manera detallada el desarrollo experimental que se llevó a cabo. Aspergillus niger ATCC 1015 Prueba preliminar de la capacidad productora de naringinasa por la cepa Preparación del inóculo Fermentación Crecimiento del microorganismo en diferentes sustratos CaCO 3 y/o MgCO 3 Naringina Melaza Ramnosa Proteína Método Bradford Actividad enzimática Identificación de la enzima Determinación de la V máx, K m Figura 1. Diagrama de proceso para la producción de naringinasa, proteína y determinación de la actividad enzimática de naringinasa producida por A. niger ATCC1015 utilizando diferentes fuentes de carbono. 6

7 Materias primas. 1. Naringinasa de Penicillium decumbens (Sigma) 2. Naringina (Sigma) 3. Ramnosa (BDDIFCO) 4. Melaza (Ingenio San Miguelito, Córdoba, Ver.) 5. Glucosa (Sigma) 6. Medio de cultivo Agar Saboraud (BDDIFCO) 7. Extracto de malta (BDDIFCO) Microorganismo Aspergillus niger ATCC 1015 obtenido de Colección Nacional de Cepas Microbianas y Cultivos Celulares del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV) y mantenidas a 5ºC en agar papa dextrosa. Este microorganismo esta reportado como productor de ácido cítrico y antígenos (CDBB: 177). Material de laboratorio y reactivos. Ácido ortofosfórico (Baker), acido 3,5-dns (Baker), agujas de jeringa (plastipack), agua destilada-desionizada, agar maltosa de sabouraud (BDDIFCO), albúmina sérica bobina (bsa), azul de comassie-g (Baker), cajas petri, cloroformo. Equipo. Balanza analítica (Ohaus, Explorer Po), baño metabólico (Shaker, G25), baño maría (BM), centrifuga ALC4239R, espectrofotómetro visible-uv (Termo Spectronic, Genesys 20), fotocolorímetro (Klett- Summerson), horno (American), autoclave, parrilla de calentamiento (Termolyne, HP-A1915B), vortex (Daigger, Vortex Genie 2). 7

8 Métodos. Evaluación preliminar de la capacidad productora de naringinasa de la cepa Aspergillus niger ATCC 1015 por medio de cromatografía en capa fina. Para conocer si la cepa empleada tenía la capacidad de producir naringinasa, se utilizaron muestras de jugo de dos lotes de naranjas verdes, un lote sin inocular y otro inoculado por picadura con Aspergillus niger ATCC 1015, con la finalidad de evaluar la presencia de naringina en el jugo y la hidrolisis de esta por medio de la enzima producida por el microorganismo inoculado. Las muestras de jugo de cada lote fueron tomadas cada 24h y en el caso del lote de naranjas inoculadas las muestras fueron tomadas del punto de inoculación debido a que el microorganismo no alcanza a colonizar toda la naranja en 24h. El lote sin inocular sirvió como control para determinar que, la hidrólisis de la naringina no fuera efecto de la maduración de la naranja. Para dar seguimiento a la presencia o ausencia de naringina se utilizó la técnica de cromatografía en capa fina, para lo cual se cortaron placas cromatográficas de 5 x 2 cm de largo y ancho respectivamente, a las que, se les aplicó una gota de la muestra problema (naringina pura o jugo de naranja) a una distancia de 0.5 cm del inicio de la placa cromatográfica (punto de aplicación). Cada placa cromatográfica con la muestra previamente aplicada, se introdujo en una cámara de vidrio que contenía 2 ml de disolvente aproximadamente. La muestra aplicada en la placa ascendió por capilaridad utilizando diferentes disolventes. Después de que la muestra ascendió por capilaridad y el disolvente recorrió una distancia de hasta 0.5 cm antes del final de la placa cromatográfica, se sacó la placa de la cámara de vidrio y se dejó evaporar al ambiente el disolvente que ésta había absorbido. 8

9 Para observar la distancia recorrida por las muestras a lo largo de la placa, se utilizó una lámpara de luz ultravioleta de longitud corta (253 nm) y una de longitud larga (350 nm), las manchas observadas fueron marcadas con lápiz. Posteriormente se le aplicó con ayuda de un algodón y unas pinzas sulfato sérico amoniacal que sirvió como revelador cuando se sometió la placa con el sulfato sérico amoniacal a calentamiento mediante de una parrilla por 1 min aproximadamente. El experimento se realizó por triplicado. Determinación del mejor disolvente que permite la ascendencia por capilaridad de la naringina pura y la naringina presente en el jugo de naranja en cromatografía en capa fina. En primer lugar se empleó una muestra de naringina pura (N) que se empleó como patrón de comparación en una concentración de 50 mg/1000ml, para poder hacer los experimentos que permitieran conocer si la cepa empleada tenía capacidad de producir naringinasa. Por ello se evaluaron las mezclas de disolventes presentes el Cuadro 1. La elección del disolvente que permitió la mejor elución de la naringina en cromatografía en capa fina se realizó en base a los Rf (factor de elución de un compuesto en una placa cromatográfica) calculados para cada placa cromatográfica, es decir para cada muestra de naringina eluída utilizando diferentes disolventes. El Rf expresa la posición de un compuesto sobre la placa cromatográfica como una fracción decimal; el máximo Rf es 1 y a mayor Rf mejor factor de elución. El Rf fue calculado dividiendo la distancia que recorrió la muestra en la placa cromatográfica entre la distancia que recorrió el disolvente. 9

10 Cuadro 1. Disolventes utilizados para determinar el factor de elución de una muestra de naringina pura en cromatografía en capa fina. Disolvente / Concentración % hexano / 100 acetato / 100 hexano: acetato de etilo / 80:20 acetato de etilo: hexano / 80:20 metanol: acetato de etilo / 80:20 metanol / 100. acetona / 100 metanol: acetona / 95:5 metanol: acetona / 90:10 metanol: acetona / 80:20 Además se utilizaron diferentes disolvente o mezcla de disolventes para conocer la elución de la naringina presente en el jugo de naranja (n) en una placa cromatográfica las cuales se muestran en el Cuadro 2. Cuadro 2. Disolventes y proporción utilizados para determinar el factor de elución de la naringina presente en el jugo de naranja. Disolvente / Concentración % metanol / 100 acetona / 100 metanol: acetona / 95:5 metanol: acetona / 90:10 metanol: acetona / 80:20 10

11 Se buscó el mejor sistema de elución tanto para la naringina pura (N) como para la naringina presente en el jugo de naranja (n). Para ello se evaluaron las mezclas de disolventes presentes en el Cuadro 3. Cuadro 3. Disolventes y proporción utilizados para determinar el factor de elución de la naringina pura y de la naringina presente en el jugo de naranja en una misma placa cromatográfica. Disolvente / Concentración % metanol / 100 metanol: acetona / 80:20 Recuperación de la cepa de A. niger a partir de un cultivo en tubo inclinado. La cepa Aspergillus niger ATCC 1015 (obtenida del cepario del Cinvestav) se adquirió en tubos de ensaye en agar papa dextrosa, por lo que fue resembrada para obtener una cantidad suficiente para que pudiera emplearse en las fermentaciones a realizar (Díaz y col, 1998). Preparación del inóculo de A. niger por medio de turbidimetria. Para la obtención del inóculo a emplear en cada fermentación se preparó para cada ensayo y en el momento del inicio de la fermentación una solución que contenía 900 x 10 6 esporas/ ml por medio de turbidimetria utilizando una escala de MacFarland previamente preparada como se muestra en el Cuadro 4 (Díaz y col, 1998). 11

12 Cuadro 4. Escala Macfarland empleada para calcular el inoculo empleado en cada fermentación. Clave del tubo BaCl 1% ml H 2 SO 4 1% ml No. aproximado de microorganismos x 10 6 /ml El renglón sombreado indica la cantidad de inóculo empleado. Fermentaciones para la producción de naringinasa por medio de A. niger utilizando como base un caldo nutritivo. Se utilizó Aspergillus niger ATCC 1015 en una concentración 900 x 10 6 esporas/ml. Se preparó un caldo nutritivo con la composición que se observa en el Cuadro 5 (Munish y col, 2005; Bram y Solomons, 1965). Cuadro 5. Composición del caldo nutritivo empleado en cada fermentación y al cual se le adicionó la fuente de carbono y/o las sales de calcio y magnesio. 12

13 Caldo nutritivo sustancia NaNO 3 KH2PO 4 KCl MgSO 4 7H 2 O FeCl 3 Extracto de malta proporción 2.0 g/l 1.0 g/l 0.5 g/l 0.5 g/l 0.1 g/l 1% p/v Las muestras que se prepararon con caldo nutritivo para conocer el efecto de la fuente de carbono y de las sales CaCO 3 y MgCO 3 se muestran en el Cuadro 6. Cada fermentación se realizó por duplicado en matraces de 1L los cuales fueron incubados por un periodo de 8 días a 30 C, con agitación de 54 ciclos por min. Cuadro 6. Caldos nutritivos evaluados en el crecimiento del microorganismo y producción de naringinasa por A. niger. Fuente de carbono Proporción fuente de carbono % CaCO 3 proporción 0.01 mm MgCO 3 proporción 0.01mM naringina naringina naringina naringina melaza melaza melaza melaza ramnosa ramnosa ramnosa ramnosa

14 Crecimiento del microorganismo utilizando diferentes fuentes de carbono. Se tomó una alícuota de 20 ml cada día que duró la fermentación, esta fue filtrada en papel filtro de poro de 1mm y se secó a 80ºC por 10 min aproximadamente, así se cuantificó el peso del micelio por diferencia (Bucio Villalobos y col, 2007). MÉTODOS ANALÍTICOS. Determinación de proteína en el medio de cultivo. Para la determinación de la proteína en el medio de cultivo se utilizó el método de Bradford, el cual es un método rápido y sensible para la cuantificación de micro cantidades de proteína utilizando el principio de formación de color por unión a la proteína (Bradford, 1976; Kirk y col, 2004). El método de Bradford involucra la unión no covalente de la proteína al reactivo Azul brillante de Coomasie G-250 ya que este interacciona con los grupos básicos y aromáticos de las proteínas. Este colorante absorbe a una longitud de onda de 365 sin embargo la unión de la proteína al colorante causa un cambio en el máximo de absorción del colorante de 365 a 595nm absorbancia a la que se realiza la determinación (Bradford, 1976). - Preparación del reactivo de Bradford. Se disuelven 100 mg de azul de Comassie en 50 ml de etanol al 96 %, después se añaden 100 ml de ácido fosfórico 85 %.Se diluye con 1000 ml de H 2 O destilada y se deja reposar 24 h en oscuridad, se filtra dos veces con papel filtro y se conserva en una botella oscura. -Patrón de albúmina sérica bobina (ASB). Se realiza una curva de ASB de acuerdo con el Cuadro 7. Agitando perfectamente y después de incubar por 10 minutos a temperatura ambiente. Cada ensayo se lee a 595 nm usando como blanco el tubo 6 de la serie y se determinan por triplicado. Esta curva solo es estable por 30 min y se deberá agitar 14

15 perfectamente antes de leer. Para determinar el contenido de la proteína en cuestión se realiza el mismo procedimiento sustituyendo la ASB por la proteína problema e interpolando los resultados obtenidos para la proteína problema en la curva estándar. Durante la determinación se desarrolla una coloración azulada que se incrementa conforme se incrementa la concentración de proteínas. Cuadro 7. Curva tipo de albumina sérica bovina, para la determinación de proteína en el medio de cultivo por el método de Bradford. Tubo Solución Proteína (ASB, 250 μg/ml) Agua destilada (ml) Reactivo de Bradford (ml) La curva tipo de albumina sérica bovina, para la determinación de proteína en el medio de cultivo por el método de Bradford.se reporta en el Anexo número 1 del presente trabajo y presentó una ecuación de la recta de Y=5.78x ; R 2 = Determinación de la actividad enzimática de la naringinasa comercial de Penicillium decumbens. Para llevar a cabo la determinación de la naringinasa producida por el microorganismo empleado fue importante conocer el comportamiento de esta in vitro por tanto se realizaron las siguientes determinaciones utilizando naringinasa de Penicillium decumbens (Sigma). Estudio del efecto de la concentración de naringinasa de Penicillium decumbens en la hidrólisis de naringina. 15

16 Se preparó una solución de naringina mm en regulador de citratos 0.05 M ph 4.5 de la cual siempre se adicionó 1.9 ml a cada tubo de ensayo, además de diferentes soluciones de naringinasa de concentración final de 10, 30, 50, 75, 100, 125 y 150 μg/ml; las cuales fueron elaboradas a partir de una solución concentrada de 1500 μg/ ml, siendo siempre la alícuota que se adicionó al sustrato de 0.1 ml. Así el volumen total de cada tubo de ensayo fue de 2 ml. Cada ensayo se incubo durante 15 minutos, tiempo en el cual se llevaría a cabo la hidrólisis de naringina por la naringinasa y se obtendría glucosa como producto final y esta es directamente proporcional a la cantidad de naringenina producida por dicha hidrólisis. Terminado el tiempo de reacción, la reacción se detiene con la adición de 4 ml de DNS y se calienta durante 5 minutos a ebullición para revelar cada tubo, los cuales una vez fríos fueron leídos a 540nm con filtro verde. (Ting, 1958; Olson y col, 1979; Olson y Gray, 1981; Chaplin y Kennedy, 1986). Los resultados de este estudio se reporta en el Anexo 2 apartado 2a.1 del presente trabajo. Estudio del efecto del tiempo en la velocidad de hidrólisis de la naringina por la naringinasa de Penicillium decumbens. Del estudio anterior se seleccionó una concentración de naringinasa a la cual se observara claramente la hidrólisis de la naringina la cual fue 50 μg/ ml, dicha concentración se mantuvo constante durante todo el experimento donde se evaluaron diferentes tiempos de hidrolisis los cuales fueron 5,10, 20, 30, 40, 50, 60 minutos adicionando a cada tubo de ensayo 1.9 ml de naringina 0.005M y 0.1 ml de naringinasa. Terminado el tiempo de reacción, la reacción se detuvo con la adición de 4 ml de DNS y se calentó durante 5 minutos para revelar cada tubo, los cuales una vez fríos fueron leídos en el fotocolorímetro con filtro verde. (Ting, 1958; Olson y col, 1979; Olson y Gray, 1981; Chaplin y Kennedy, 1986). Los resultados de este estudio se reporta en el Anexo 2, apartado 2a.2 del presente trabajo. 16

17 -Curva tipo de naringina. Para el montaje de la curva tipo de naringina una vez conocidos tanto la concentración de naringinasa a emplear (50 μg/ ml) y el tiempo de hidrólisis más adecuado para observar tal efecto (10 min), se preparó una solución de naringinasa en concentración de 50 μg/ ml en regulador de citratos mm ph 4.5 de la cual se adición 0.5mL, la concentración de naringina empleada fue de 0.005M y se emplearon los siguientes volúmenes: 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2, 1.4, 1.6 y 1.8 ml para alcanzar un volumen final de cada ensayo de 2.5 ml. El tiempo de incubación fue de 10 minutos, posteriormente la reacción fue detenida agregando 4 ml de DNS y los tubos fueron puestos a ebullición durante 5 minutos, una vez fríos se llevo a cabo la lectura a 450nm con filtro verde. (Ting, 1958; Olson y col, 1979; Olson y Gray, 1981; Chaplin y Kennedy, 1986). Los resultados de este estudio se reporta en el Anexo 3, Figura 4A del presente trabajo. -Determinación de las constantes de V máx y K m para la naringinasa de P. decumbens por los métodos gráficos de Michaelis-Menten, Lineweaber-Burk, Eadie-Hofsteen, Agustinson y Wilkinson. Con base en base los resultados obtenidos de la curva de naringinasa y haciendo una curva patrón de glucosa se calcularon las concentraciones reales en μg/ ml que representa cada volumen empleado en la curva tipo de naringina 0.005M. Dichos resultados fueron empleados para trazar las curvas de Michaelis- Mentes (Anexo 5, Figura 6A), Lineweaber-Burk (Anexo 5, Figura 7A), Eadie-Hofsteen (Anexo 5, Figura 8A) y Agustinson (Anexo 5, Figura 9A), y se determino la Vmáx y Km para cada uno, a demás se determinaron dichas constantes por el método estadístico de Wilkinson (1960). La Vmáx esta expresada en U/mg proteína donde una U = cantidad de enzima para liberar 1μmol de glucosa/ min. 17

18 Estudio de la actividad enzimática de la naringinasa producida por A. niger en muestras de la fermentación de cada formulación. Para llevar a cabo la determinación de la actividad enzimática de la naringinasa producida por el microorganismo empleado. Se tomó 0.5 ml de cada muestra de la fermentación de cada formulación, se le adicionó 1.5 ml de una solución de naringina (Sigma) 5.26 mm en regulador de citratos 0.05M ph 6, como sustrato, y se incubó a 35 C por 24 h, la reacción fue detenida adicionando 4 ml de ácido 3,5-dinitrosalicilico y con ebullición en baño María durante 5 minutos, posteriormente se leyó a 450 nm en un fotocolorímetro con filtro verde. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Como blanco se utilizó 1.5 ml de una solución de naringina 5.26mM. Para el tratamiento de los resultados se utilizó una curva tipo de glucosa con una ecuación de la curva de Y=0.6456x ; R 2 =0.987, reportada en el Anexo 4, Figura 5A del presente trabajo. Estudio de la actividad enzimática de la naringinasa producida por A. niger del caldo nutritivo que presentó mayor actividad enzimática en el estudio anterior. A partir de los resultados obtenidos en el estudio anterior se seleccionó el caldo nutritivo seleccionado que presentó mayor actividad enzimática. El caldo nutritivo elegido, fue tratado para concentrar la proteína y separarla del medio de cultivo por lo que se le adicionó 65 g de sulfato de amonio por cada 100 ml de medio de cultivo para precipitar la proteína en baño de hielo logrando una saturación de 99% de acuerdo con Dawson (1968). La solución fue centrifugada a rpm ( radianes /min) 4 C por 30 min; el pellet fue resuspendido en 15 ml de regulador de citratos 0.05M ph 6 y se le determinó el contenido proteico por medio del método de Bradford. Para la determinación de la actividad enzimática del concentrado proteico obtenido se emplearon 1.5 ml de una solución de naringina de diferente molaridad (0.02, 0.008, , , , 0.001, M) en regulador de citratos 0.05 M ph 6 a la que se le adicionaron 0.5 ml del concentrado proteico y se incubaron a 18

19 35 C por 24 h en baño María, una vez transcurrido el tiempo de incubación la reacción fue detenida adicionando 4 ml de ácido 3,5-dinitrosalicilico y con ebullición en baño María durante 5 minutos, posteriormente la lectura se realizó en un fotocolorímetro con filtro verde. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Para el tratamiento de los resultados se utilizó una curva tipo de glucosa con una ecuación de la curva de Y=0.6456x ; R 2 =0.987, reportada en el Anexo 4, Figura 5A del presente trabajo. Los resultados obtenidos permitieron calcular los gráficos de Michaelis-Menten, Lineweaer-Burk, Eadie-Hoffsten y Agustinson. A demás se determinó la V máx y K m para cada uno. El valor de V máx y K m para Wilkinson se calculó de acuerdo al modelo estadístico de Wilkinson (1960). Análisis estadístico Los resultados de peso del micelio, proteína y actividad enzimática fueron analizados estadísticamente por medio del programa MINITAB13, a través de un análisis de varianza (ANOVA) con un p 0.05 utilizando un diseño factorial general completo de 3x4x5 (fuente de carbono, sales y días) con tres repeticiones. 19

20 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Evaluación de la capacidad productora de naringinasa de la cepa Aspergillus niger ATCC 1015 por medio de cromatografía en capa fina. Se encontró que la naringina pura (N) y la naringina presente en la naranja (n), ascendieron por capilaridad en metanol 100% alcanzando un Rf= 0.86, pero su ascendencia por capilaridad mejoró con metanol: acetona en 80:20 presentando un Rf= 1 el cual fue calculado con respecto a la muestra de referencia lo que nos sugiere que el mejor sistema para permitir la ascendencia por capilaridad en cromatografía en capa fina de las muestras de naringina pura y naringina de la naranja es el de metanol: acetona en 80:20. Por tanto para la siguiente etapa experimental se trabajo con este sistema de disolventes. Evaluación de la degradación de la naringina por la naringinasa producida por Aspergillus niger ATCC 1015 una vez inoculado en naranjas. Pequeñas muestras de jugo de las naranjas utilizadas en el experimento (n) se compararon en una placa cromatográfica contra una muestra de naringina pura (N) tanto de las naranjas inoculadas por picadura con Aspergillus niger ATCC 1015 como las no inoculadas (controles). Después de revelar las placas se confirmó la presencia de la naringina en el lote de naranjas sin inocular y de igual manera se confirmo la presencia de la naringina en el lote de naranjas acabadas de inocular. A las 48 y 72 horas se observó la presencia de naringina en las naranjas no inoculadas junto con la presencia de otros compuestos, lo que podría sugerir el inicio de la degradación de la naringina presente en la naranja probablemente por efecto de la maduración. A 120 hrs los controles mostraron la presencia de naringina junto con la presencia de otros compuestos que solo absorven en longitud de onda larga en el UV. En las muestras de las naranjas inyectadas con 20

21 el hongo no se observa la presencia de naringina probablemente debido a una hidrólisis inducida por el microorganismo inoculado. preparación del inóculo de A. niger a partir de un cultivo en tubo inclinado. La cepa Aspergillus niger ATCC 1015 (obtenida del cepario del CINVESTAV; fue resembrada en agar Sabouraud el cual fue preparado, esterilizado y vaciado previamente en cajas petri, las cuales fueron resembradas por picadura. Dichas cajas se mantuvieron a temperatura ambiente y cubiertas con papel aluminio por una semana para obtener un óptimo crecimiento del microorganismo. El hongo comenzó a crecer desde el primer día y alcanzo su óptimo a los 7 días de haberse sembrado. Este procedimiento se realizó mensualmente a manera de conservar la cepa. El caldo nutritivo, como fue descrito en materiales y métodos, fue adicionado con diferentes fuentes de carbono (0.5% p/v) y con sales de calcio y magnesio al 1 M y 0.1mM. Sin embargo, en estas muestras no se observó el crecimiento del hongo (peso del micelio). Crecimiento del microorganismo utilizando diferentes fuentes de carbono. Se observó crecimiento del microorganismo cuando se empleó como fuente de carbono naringina, ramnosa o melaza (0.5% p/v) en el caldo nutritivo. Cuando se adición las sales de calcio y/o magnesio en concentración de 0.01mM se observó crecimiento del microorganismo al contrario de cuando se utilizó una concentración de 1 y 0.1mM. Por ello se empleó en todos los caldos nutritivos que se trabajaron en este estudio una concentración de 0.01 mm para las sales. Es importante resaltar que cuando no se adicionó sal alguna al medio de cultivo, no se encontró diferencia significativa para las tres diferentes fuentes de carbono empleadas. Lo cual concuerda con Bramn y Solomons (1965) que sugieren que no es necesaria la adición de factores de crecimiento para Aspergillus niger NRRL 72-4 en la producción de naringinasa. Sin embargo, la presencia de CaCO 3 y MgCO 3 individualmente favoreció significativamente (p 0.05) el crecimiento de 21

22 A. niger solo cuando se utilizó melaza como fuente de carbono, siendo el máximo de crecimiento g/ml y g/ml para CaCO 3 y MgCO 3 respectivamente (Figura 2). Bramn y Solomons (1965) sugieren que el CaCO 3 tiene un efecto positivo en el crecimiento del hongo durante la producción de la naringinasa debido a que cuando se realiza dicha producción en matraces agitados, y no en fermentadores, en donde se pueden controlan todos los factores, se forma una atmosfera limitada en oxigeno que afecta el crecimiento del hongo y esta limitación puede modificarse a través de la adición de CaCO 3. Esto podría aplicarse también para el MgCO 3, ya que lo que aporta el carbonato de calcio es oxigeno para contrarrestar la deficiencia de este en el medio, sin embargo, para magnesio no está comprobado. No obstante la adición de la mezcla de ambas sales no mostró diferencia significativa para alguna fuente de carbono empleada. 22

23 Figura 2. Crecimiento del micelio de A. niger ATCC1015 en melaza con adición de CacO 3 ( ) y melaza con adición de MgCO 3 ( ). Determinación de proteína en el medio de cultivo La determinación de la proteína durante el crecimiento del microorganismo (no toda la proteína producida es enzima naringinasa) se realizó por triplicado para todas las muestras tomadas cada 24 horas durante el transcurso de la fermentación y se utilizó como blanco la fuente de proteína inicial (1% p/v). Para la producción de proteína se encontró que existe diferencia significativa (p 0.05) dependiendo de la fuente de carbono que se utilice, siendo la naringina la fuente de carbono que favorece más la producción proteica, lo cual se observa en la Figura 3, Curva A. También se encontró diferencia significativa en la producción de proteína dependiendo de la presencia o ausencia de sales de Ca 2+ y/o Mg 2+. En la Figura 3, Curva B se observa que la adición de las sales favorece positivamente la producción de proteína, teniendo un mayor efecto positivo el MgCO 3 que el CaCO 3, sin embargo, se observa que el efecto positivo se incrementa cuando se adiciona la mezcla de sales de Ca 2+ y Mg 2+ y cuando se utiliza naringina como fuente de carbono (Figura 34, Curva A). Probablemente el efecto de la mezcla de las sales es mayor porque al adicionarlas juntas suman su efecto actuando de manera sinergica sobre la producción proteica. 23

24 Figura 3. Curvas de comportamiento de la proteína en relación a la fuente de carbono (A) y sales de Ca 2+ y/o Mg 2+ (B), por Aspergillus niger ATCC1015. Tiempo de la fermentación en días(c). N= naringina; R= ramnosa; M=melaza; 0= sin sales; Ca= CaCO 3 ; Mg=MgCO 3 ; m= mezcla de sales. La línea punteada representa la media de los datos. 24

25 Figura 4. Curvas de producción de proteína mostrando las relaciones: fuente de carbono-sales (A) y fuente de carbono-días (B), para naringina, melaza y ramnosa y (C) la relación sales-días para naringina. N= naringina; R= ramnosa; M=melaza; 0= sin sales; Ca= CaCO 3 ; Mg= MgCO 3 ; m= mezcla de sales. Al analizar individualmente las diferentes formulaciones en función de la fuente de carbono utilizada se encontró para el caso de naringina que existe diferencia significativa (p 0.05) en ausencia y presencia de las sales de Ca 2+ y/o Mg 2+. Siendo el máximo de producción de proteína (Cuadro 9) para naringina sin adición 25

26 de sales de 6192 µg / ml; para naringina + Ca 2+ de µg / ml; para naringina + Mg 2+ de µg / ml y para naringina + Ca 2+ y Mg 2+ de µg / ml. A partir de dichos máximos de producción de proteína se observa que la adición de la mezcla de las sales incrementa significativamente la producción de proteína en comparación cuando no se adicionan sales o cuando se adicionan Ca 2+ o Mg 2+ individualmente. Cuadro 9.Máximos de producción de proteína en la producción de naringinasa por medio de A. niger. Ensayo naringina sin sales naringina +Ca 2+ y Mg 2+ naringina + Ca 2+ naringina + Mg 2+ Producción de proteína (µg / ml) melaza sin sales melaza +Ca 2+ y Mg 2+ melaza + Ca 2+ melaza + Mg ramnosa sin sales ramnosa+ca 2+ y Mg 2+ ramnosa + Ca 2+ ramnosa + Mg Sin embargo, no existe diferencia significativa en la producción de proteína al adicionar Ca 2+ y Mg 2+ de manera independiente. Es posible que la adición de la 26

27 mezcla de las sales tenga un efecto sinergista positivo en la producción de proteína cuando se utiliza naringina como fuente de carbono. Cuando se utilizó melaza como fuente de carbono se encontró diferencia significativa en la producción de proteína en ausencia y presencia de las sales de Ca 2+ y/o Mg 2+. Siendo el máximo de producción de proteína (Cuadro 9) para melaza sin adición de sales de 2339 µg /ml; para melaza + Ca 2+ de 4987 µg / ml; para melaza + Mg 2+ de 7368 µg / ml y para melaza + Ca 2+ y Mg 2+ de 5033 µg / ml. Es importante mencionar que, a pesar de que la producción de proteína al adicionar Mg 2+ al caldo nutritivo es mayor, esta no es significativamente diferente en relación a la proteína producida cuando no se hizo adición de sales o cuando se adicionó solo Ca 2+, sin embargo, sí es significativamente mayor en relación a la producida cuando se adicionó la mezcla de sales. Finalmente cuando se utilizó ramnosa como fuente de carbono también se encontró diferencia significativa en ausencia y presencia de las sales de Ca 2+ y/o Mg 2+ en la producción de proteína (Cuadro 9). Siendo el máximo de producción de proteína para ramnosa sin adición de sales de 2006 µg /ml; para ramnosa + Ca 2+ de 3139 µg / ml; para ramnosa + Mg 2+ de 2845 µg / ml y para ramnosa + Ca 2+ y Mg 2+ de µg / ml. A partir de los máximos obtenidos se observa que la adición de la mezcla de sales de Ca 2+ y Mg 2+ al caldo nutritivo permite una mayor producción de proteína con respecto a cuando no se adicionaron dichas sales, es decir, la adición de la mezcla de sales tiene un efecto positivo en la producción de proteína. Por otra parte la adición de Ca 2+ al caldo nutritivo favoreció de igual manera la producción de proteína en relación a cuando no se adicionó, pero esta producción no fue significativamente diferente a la obtenida cuando se adicionó Mg 2+ o cuando se adicionó la mezcla de Ca 2+ y Mg 2+. Cabe señalar que la adición de Mg 2+ no tuvo un efecto significativo en la producción de proteína en relación a los otros caldos nutritivos. Al hacer una comparación entre las tres fuentes de carbono (naringina, melaza y ramnosa) bajo las mismas condiciones, se encontró que al no adicionar sales 27

28 existe diferencia significativa en la producción de proteína entre la proteína (Cuadro 10) producida al adicionar naringina y al adicionar ramnosa (2006 µg/ml) como fuente de carbono, siendo mayor la producción de proteína cuando se utiliza naringina (6192 µg/ml), sin embargo, no existe diferencia significativa entre las dos fuentes de carbono mencionadas anteriormente con respecto a melaza cuando se utiliza como fuente de carbono. Los caldos adicionados con Ca 2+ que mostraron ser significativamente diferentes en la producción de proteína, fueron en los que se utilizó naringina y melaza como fuente de carbono (Cuadro 10), siendo mayor la producción de proteína para el caso de naringina (11849 µg/ml) en relación con la melaza (4987 µg/ml). El caldo nutritivo en el que se empleo ramnosa como fuente de carbono no mostró ser significativamente diferente a los anteriormente mencionados. Ensayo naringina sin sales ramnosa sin sales Producción de proteína (µg / ml) naringina + Ca melaza + Ca naringina + Mg 2+ ramnosa + Mg naringina + Mg melaza + Mg naringina + Ca 2+ y Mg melaza + Ca 2+ y Mg Cuadro 10. naringina + Ca 2+ y Mg Comparativo de los ramnosa + Ca 2+ y Mg máximos de producción de proteína significativos (p 0.05) en la producción de naringinasa mediante diferentes fuentes de carbono por medio de A. niger. 28

29 En el caso de los caldos a los que se les adiciono Mg 2+ se encontró diferencia significativa en la producción de proteína (Cuadro 10), entre el que se utilizo como fuente de carbono la naringina (15154 µg/ml) y en el que se utilizo ramnosa (2845 µg/ml), también se encontró diferencia significativa en la producción de proteína entre naringina y melaza (7368 µg/ml). Sin embargo, la producción de proteína entre melaza y ramnosa no fue significativamente diferente. En el caso de los caldos adicionados con la mezcla de las sales de Ca 2+ y Mg 2+, también se encontró diferencia significativa en la producción de proteína (Cuadro 10), entre naringina (32553 µg/ml) y melaza (5033 µg/ml) utilizada como fuente de carbono, de igual manera entre naringina y ramnosa (19445 µg/ml). Por otra parte el tiempo (días) mostró tener efecto en la producción de proteína dependiendo de la fuente de carbono que se empleo, lo cual se observa en la Figura 4B donde claramente se aprecia que los ensayos realizados con naringina como fuente de carbono presentan mayor producción de proteína ya que a pesar de que presenta variaciones a lo largo de la fermentación, siempre se mantiene por arriba de la producción de proteína producida con melaza y con ramnosa. Por otra parte la Figura 4C, muestra la producción de proteína a lo largo del tiempo de fermentación utilizando naringina como fuente de carbono en relación a la ausencia y/o presencia de las sales de Ca 2+ y Mg 2+ donde se observa que es con la mezcla donde se ve favorecida significativamente la producción de proteína a pesar de la variación de esta a lo largo de los días debido al metabolismo del hongo. Estudio de la actividad enzimática de la naringinasa de A. niger en muestras de cada fermentación. La determinación de la actividad enzimática se realizó durante el crecimiento del hongo en el caldo nutritivo en diferentes condiciones por triplicado a lo largo de 7 29

30 días de fermentación. Se utilizó como blanco una solución de naringina 5.26M ph 6 en buffer de citratos. En la Figura 2A se observa el efecto de las tres diferentes fuentes de carbono en la actividad enzimática. A través del análisis estadístico se encontró que existe diferencia significativa entre ellas (p 0.05) siendo la ramnosa la fuente de carbono que favorece más la producción de naringinasa. Por otra parte en la figura 5B se observa que la adición de sales no influye significativamente en la actividad enzimática de esta enzima. Figura 5. Curvas de Actividad enzimática expresada en microgramos de glucosa producida después de 24hrs de hidrolisis, en relación a las diferentes fuentes de carbono 0.5%, sales de Ca 2+ y/o Mg mM y días. La línea punteada representa la media de los datos. N= naringina; R= ramnosa M=melaza; 0= sin sales; m= mezcla de sales. La producción enzimática obtenida en el presente trabajo puede explicarse a través de la teoría económica de los microorganismos (Koch, 1985) que establece 30

31 que la producción de una enzima inducida, solo es favorecida cuando la producción de esta permite al microorganismo obtener más nutrientes para su crecimiento y multiplicación. Además este efecto puede incrementar si no existen sustratos fácilmente asimilables, los microorganismos no regularan fuertemente la producción enzimática de las enzimas constitutivas, o los costos enzimáticos son suficientemente bajos para permitir una continua producción, y de acuerdo con Stevens y col, (2005), las enzimas extracelulares como en este caso la naringinasa son el principal medio por el cual los microorganismos degradan compuestos orgánicos complejos en moléculas pequeñas que pueden ser asimilables. Por otra parte en la Figura 5C se observa que la producción de naringinasa varía de acuerdo con el metabolismo del hongo durante los días que duró la fermentación, siendo esta mayor el primer día después del inicio de la fermentación y claramente se observa una disminución de esta los últimos días de la fermentación, quizá debido a una represión por catabolito (glucosa) (Munish y col 2005, Bram y Solomons, 1965).También el comportamiento ascendente y descendente de la actividad enzimática a lo largo del tiempo de fermentación puede explicarse a través de lo citado por Chróst (1991) que establece que una vez que la concentración de productos incrementa lo suficiente, la síntesis enzimática se ve reprimida y la producción regresa a un nivel basal. Comparando la actividad enzimática que se observa a través de los días (Fig. 5C) con la variación de la proteína presente en el medio de cultivo con respecto al tiempo (Fig. 3C) se observa que la cantidad la actividad enzimática no es proporcional a la producción de proteína ya que la actividad enzimática mayor se observa en el primer día después del inicio de la fermentación (Figura 6B) después de lo cual desciende y es hasta el sexto día cuando vuelve a subir pero no alcanza el máximo alcanzado el primer día, lo que es contrario para la producción de proteína donde se observa (Figura 3B) que esta aumenta y disminuye repetitivamente, es decir no muestra la misma tendencia que en el caso 31

32 de la actividad enzimática. De acuerdo con Koch, 1985; Pelletier y Sygush, 1990; Chróst, 1991; Sinsabaugh y Moorhead, 1994, debido a la producción de nitrógeno y energía, los microorganismos solo deben producir enzimas a expensas del crecimiento y metabolismo, es decir; cuando la disponibilidad de nutrientes es escasa, la producción de enzimas aumenta, ya que de esta manera los microorganismos pueden movilizar los nutrimentos de las fuentes complejas (Harder y Dijkhuizen, 1983). En este trabajo no se cuantificó la cantidad de enzima producida sino la actividad enzimática de la enzima producida, en este sentido, la actividad enzimática de la naringinasa producida no, fue proporcional a la producción de proteína. Por otra parte también se encontró que las relaciones de Fuente de carbono-sales (Figura 6A), Fuente de Carbono- Días (Figura 39B), Sales-Días (Figura 6C), tienen un efecto significativo en la actividad enzimática determinada. 32

33 Figura 6. Curvas de actividad enzimática mostrando las relaciones fuente de carbono-sales, fuente de carbono-días y sales-días. N= naringina; R= ramnosa M=melaza; 0= sin sales; m= mezcla de sales. La línea punteada representa la media de los datos. Al analizar los diferentes caldos nutritivos en los que se empleó naringina como fuente de carbono se encontró que no existe diferencia significativa entre ellos en cuanto a la actividad enzimática determinada (Cuadro 11), sin embargo, el máximo de actividad enzimática encontrado para naringina sin sales fue de 2605 μg de glucosa/ml; para naringina + Ca 2+ fue de 5536 μg de glucosa / ml; para naringina + Mg 2+ fue de 3122 μg de glucosa/ml y para naringina + Ca 2+ y Mg 2+ fue de

34 μg de glucosa/ml. Las unidades de actividad enzimática son expresadas en este trabajo en microgramos de glucosa debido a que a partir del método utilizado se cuantifica la cantidad de glucosa producida por la hidrólisis de la naringinasa presente en el medio de cultivo sobre una muestra de naringina pura de concentración conocida. Cuadro 11.Máximos encontrados de actividad enzimática en la producción de naringinasa por medio de A. niger (No diferencia significativa). Ensayo Naringina sin sales Naringina +Ca 2+ y Mg 2+ Naringina + Ca 2+ Naringina + Mg 2+ Actividad enzimática (U/µg) Melaza sin sales Melaza +Ca 2+ y Mg 2+ Melaza + Ca 2+ Melaza + Mg Ramnosa sin sales Ramnosa+Ca 2+ y Mg 2+ Ramnosa + Ca 2+ Ramnosa + Mg En el caso de los diferentes caldos nutritivos en los que se empleo melaza como fuente de carbono se encontró que no existe diferencia significativa entre ellos en cuanto a la actividad enzimática determinada (Cuadro 11), sin embargo, el máximo de actividad enzimática encontrado para melaza sin sales fue de 2605 μg de 34

35 glucosa / ml; para melaza + Ca 2+ fue de 2743 μg de glucosa / ml; para melaza + Mg 2+ fue de 3225 μg de glucosa / ml y para melaza + Ca 2+ y Mg 2+ fue de 2432 μg de glucosa/ml. Finalmente, para el caso de los diferentes caldos nutritivos en los que se empleo ramnosa como fuente de carbono tampoco se encontró diferencia significativa entre ellos en cuanto a la actividad enzimática determinada (Cuadro 11), sin embargo, el máximo de actividad enzimática encontrado para ramnosa sin sales fue de 6139 μg de glucosa / ml; para ramnosa + Ca 2+ fue de 1638 μg de glucosa / ml; para ramnosa + Mg 2+ fue de 2777 μg de glucosa / ml y para ramnosa + Ca 2+ y Mg 2+ fue de 4932 μg de glucosa / ml. Por otra parte, al hacer una comparación entre las tres fuentes de carbono (naringina, melaza y ramnosa) bajo las mismas condiciones, se encontró que al no adicionar sales sí existe diferencia significativa entre en la actividad enzimática determinada en el caldo nutritivo adicionado con naringina y el adicionado con ramnosa, encontrándose un máximo de actividad enzimática para naringina de 2605 µg de glucosa /ml y de 6139 µg de glucosa /ml para ramnosa (Cuadro 12). Cuadro 12. Comparativo de los máximos de actividad enzimática significativos (p 0.05) de la naringinasa producida utilizando diferentes fuentes de carbono por medio de A. niger. Ensayo Actividad enzimática (U/µg) Naringina sin sales 2605 Ramnosa sin sales 6139 Melaza sin sales 2605 Ramnosa sin sales 6139 Naringina + Ca Melaza + Ca

36 También se encontró diferencia significativa entre la actividad enzimática determinada en el caldo nutritivo adicionado con melaza y el adicionado con ramnosa, encontrándose un máximo de actividad enzimática para melaza de 2605 µg de glucosa /ml, lo que claramente significa que el caldo de cultivo en el que se emplea ramnosa como fuente de carbono permite obtener una mayor actividad enzimática comparada con la de las otras dos fuentes de carbono (Cuadro 12). Cabe señalar que no se encontró diferencia significativa entre la actividad enzimática de la naringinasa determinada en el caldo nutritivo adicionado con Naringina y el adicionado con melaza. Los caldos adicionados con Ca 2+ que mostraron ser significativamente diferentes en la actividad enzimática fueron en los que se utilizó naringina y melaza como fuente de carbono (Cuadro 12), siendo mayor la producción de proteína para el caso de Naringina (5536 µg de glucosa /ml) en relación con la melaza para la que se encontró una actividad enzimática de 2743 µg de glucosa /ml. El caldo de nutritivo en el que se empleo Ramnosa como fuente de carbono no mostró ser significativamente diferente a los anteriormente mencionados. En el caso de los caldos a los que se les adiciono Mg 2+ no se encontró diferencia significativa en la actividad enzimática, entre el alguna de las fuentes de carbono empleadas en este trabajo. En los caldos adicionados con la mezcla de las sales de Ca 2+ y Mg 2+, tampoco se encontró diferencia significativa en la actividad enzimática determinada entre los caldos de cultivo adicionados con las diferentes fuentes de carbono. De acuerdo a los resultados anteriores se seleccionó el caldo nutritivo que presentó mayor actividad enzimática. De tal manera que la elección se realizó ente la actividad enzimática para los caldos nutritivos en los que no se adicionó sales y cuando se adicionó Ca 2+, para las fermentaciones llevadas a cabo sin adición de sales, el caldo nutritivo adicionado con ramnosa fue quién mostro mayor actividad enzimática (6139 µg de glucosa /ml) y para las llevadas a cabo con adición de 36

37 Ca 2+ la actividad enzimática mayor encontrada fue cuando se utilizó Naringina (5536 µg de glucosa /ml) como fuente de carbono. Por lo que la fracción de ramnosa sin sales fue la elegida para realizar la siguiente parte del experimento. Estudio de la actividad enzimática del caldo nutritivo seleccionado. La fracción seleccionada para la concentración de la proteína y la determinación de las constantes fue la de la ramnosa sin adición de sales del primer día después del inicio de la fermentación. El uso de la ramnosa como fuente de carbono permite obtener una naringinasa con mayor actividad comparada con la producida utilizando como fuente de carbono naringina o melaza. Quizá este comportamiento pude explicarse por lo sugerido por Munish y colaboradores en el 2005, quienes señalan que los medios utilizados para producir naringinasa por A. niger, adicionados con ramnosa, producen elevadas cantidades de enzima quizá ya que estos medios tienen un bajo contenido de carbohidratos. Sin embargo, Elinbaum y col sugieren que en el caso de una fermentación sólida la naringina es mejor inductor que la ramnosa para la producción de la naringinasa utilizando A. terreus, además también sugieren que una fermentación solida provee mejores resultados para la producción de naringinasa que una fermentación liquida. Haciendo una comparación de la producción proteica a lo largo del tiempo de fermentación en relación a la actividad enzimática se observa que no son proporcionales y por tanto una mayor producción proteica no conlleva a una mayor actividad enzimática aunque la naturaleza de la enzima sea proteica, ya que una actividad enzimática elevada puede estar dada tanto por haber alto contenido de proteína en el medio de cultivo o por que la enzima es altamente activa. También es importante resaltar que la actividad enzimática puede ser reprimida debido a una inhibición por glucosa (producto de la hidrólisis de la naringina por la naringinasa) ya que de acuerdo con lo reportado por Munish y colaboradores en el 37