BEAMing: Introducción

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2 BEAMing: Introducción 2 BEAMing: Introducción Antecedentes y Justificación Las biopsias de los tumores han sido utilizadas por los clínicos para el diagnóstico y tratamiento del cáncer desde hace 1000 años 1. Permiten la definición histológica de la enfermedad y recientemente aportan detalles sobre el perfil genético del tumor permitiendo predecir la progresión de la enfermedad y respuesta a los tratamientos 2. Sin embargo, en la actualidad sabemos que en un mismo tumor hay gran heterogenicidad planteándose así gran dificultad para dictaminar una acción terapéutica sobre la base de una única biopsia 2. Este hecho queda bien reflejado en un estudio de Gerlinger y col. 3, en el que se demostró que las muestras obtenidas de diferentes partes del tumor primario y sus metástasis, mostraban importantes cambios inter e intra-tumorales. En la práctica clínica es con frecuencia difícil obtener una muestra tumoral y más aún obtener biopsias múltiples o seriadas. En el caso de pacientes con cáncer de pulmón no microcítico metastásico, hasta en un 30% de los casos no hay tejido accesible 4,5. Del mismo modo aproximadamente un 50% de los pacientes con cáncer de pulmón no microcítico desarrollan resistencia al tratamiento con inhibidores de la tirosin kinasa debido a la mutación T790M en el receptor del factor de crecimiento epidérmico 4,6,7. Pero sólo en menos del 5% de los pacientes se detecta esta mutación en la biopsia inicial 4,8. Ante estas limitaciones de la biopsia tradicional, se han desarrollado nuevas vías para valorar la genética y la dinámica tumoral 2. En 1948, la publicación de un manuscrito que describía ADN libre circulante (cfdna) y ARN en la sangre de los humanos, fue sin saberlo, el primer paso hacia lo que hoy denominamos la biopsia líquida 2,9. Más aún, los niveles de cfdna son mayores en individuos enfermos que sanos, indicando que es posible analizar la presencia de enfermedad a través de un simple test en sangre 2,10. De esta forma, la valoración de cfdna puede tener diferentes aplicaciones clínicas: el diagnóstico precoz del cáncer 11,12, valoraciones pronósticas en base a la detección de alteraciones genéticas asociadas al tumor 2, detección precoz de la recurrencia 2, predicción de respuesta al tratamiento 2, o valorar el desarrollo de resistencias adquiridas 2. Descubrimiento y detección de cfdna Existen al menos dos mecanismos por los que el ADN puede llegar a la circulación 4. Se pueden categorizar como el activo y el pasivo. El pasivo sugiere que las células necróticas y en apoptosis, liberan ADN nuclear y mitocondrial a la circulación durante su proceso de destrucción 4,13. Por otra parte, la liberación activa de ADN ha sido señalada en estudios con cultivos de líneas celulares de diferente origen y parece que se debe a la liberación espontánea de fragmentos de ADN 4,14,15. Alternativamente, el cfdna también se libera a partir de células tumorales circulantes (CTCs) presentes en la sangre 4,16. No se ha documentado todavía una evidencia definitiva para este mecanismo, y existe discrepancia entre el número de CTCs y la cantidad de cfdna en la sangre 4. Es oportuno tener en cuenta que la utilización de cfdna como abreviatura no es óptimo 17. Realmente no es posible aislar ADN tumoral de otros ADNs

3 BEAMing: Introducción 3 circulantes y sólo la detección de mutaciones específicas tumorales en el ADN libre circulante indica la presencia de ADN tumoral (ctdna) 17. El análisis de ctdna supone un reto y requiere técnicas de alta sensibilidad debido a las pequeñas fracciones de ADN específico tumoral, enmascarado con los niveles de ADN no tumoral 18. Los métodos clásicos para analizar cfdna incluyen métodos cuantitativos en tiempo real de reacción de la cadena de polimerasa (PCR), métodos de fluorescencia y aproximaciones espectrofotométricas 18,19,20. Recientemente se han desarrollado métodos genómicos digitales para mejorar la identificación de alteraciones genéticas en cfdna 18. La PCR digital se ha iniciado como un método con sensibilidad para detectar mutaciones en cfdna con fracciones bajas de alelos 18, 21, que incluye sistemas basados en gotas 22, 23, plataformas microfluídas para PCR paralela 24, 25,26 y la nueva aproximación denominada BEAMing 27, 28, 29. Potenciales aplicaciones clínicas de cfdna Screening: diagnóstico e intervención precoces 18. Cáncer en estadios localizados: identificar alteraciones genómicas específicas para toma de decisión terapéutica, monitorizar carga tumoral y respuestas terapéuticas, detectar enfermedad mínima residual, valorar riesgos de diseminación y recaída 18. Enfermedad Metastásica: identificación precoz de la recaída y resistencia al tratamiento, guía para elección terapéutica, monitorizar respuestas al tratamiento 18. Cáncer refractario: conocer mecanismos de resistencia, determinar nuevos tratamientos 18.. Se estima que en el 29% de los pacientes con neuroblastoma, el status de MYCN se desconoce, a pesar de las recomendaciones de test genético en las guías clínicas para estratificación de los pacientes y toma de decisión terapéutica 2. La biopsia líquida es capaz de detectar la amplificación de MYCN en el suero de pacientes con neuroblastoma estadios III y IV con una sensibilidad y especificidad del 75-85% y del 100% respectivamente 30, 31. Una publicación de Diehl et al 32 demuestra que monitorizando aberraciones tumorales específicas (APC, TP53 y KRAS) en el plasma de pacientes con cáncer colorrectal, tras la cirugía, fue posible identificar recurrencia de la enfermedad con el 100% de sensibilidad y especificidad. Los pacientes con enfermedad residual fueron también identificados en base a la persistencia de aberraciones genéticas asociadas al tumor en cfdna inmediatamente tras la cirugía en cada caso de resección incompleta 2. En este contexto, la biopsia líquida podría tener también utilidad para la identificación de la enfermedad silente aunque todavía se precisa de más estudios en este contexto 2. La presencia o ausencia de alteraciones genéticas simples en el ADN tumoral se utiliza actualmente para tomar decisiones terapéuticas con fármacos diana 2 : mutaciones EGFR para gefitinib en cáncer de pulmón no microcítico, mutaciones BRAF para vemurafenib en melanoma, mutaciones KRAS para cetuximab o panitumumab en cáncer colorrectal, reordenamiento de ALK para crizotinib en cáncer de pulmón no microcítico. Sin embargo, estos

4 BEAMing: Introducción 4 análisis se realizan a veces en muestras tumorales extraidas hace varios años. Esta situación es subóptima y puede no reflejar el perfil genómico de la enfermedad actual 2. Si no se puede obtener una nueva biopsia, ctdna puede ofrecer una información molecular superior. De esta forma, potencialmente, la biopsia líquida puede obviar la necesidad de nuevas biopsias de tejido en el paciente con enfermedad metastásica 2. Muchos pacientes tratados con dianas terapéuticas desarrollan resistencia adquirida, dando lugar a fracasos terapéuticos. La detección rápida de la resistencia representa una de las aplicaciones inmediatas en la clínica de la biopsia líquida y puede permitir a los clínicos evitar tratamientos tóxicos, caros e ineficaces 2. En esas situaciones de resistencia, los pacientes suelen estar en estadios avanzados con mucha carga tumoral y una amplia fracción del DNA circulante proviene del propio tumor 33,34. A diferencia de las biopsias de tejido, la biopsia líquida permite una representación de todo el panorama de aberraciones genéticas asociadas a las lesiones tumorales 2. Dr. Carlos Camps Servicio de Oncología Médica Consorcio Hospital General Universitario de Valencia Bibliografía 1. Diamantis, A., Magiorkinis, E. & Koutselini, H. Fine-needle aspiration (FNA) biopsy: historical aspects. Folia Histochem. Cytobiol 2009;47: Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F. and Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat. Rev. Clin.Oncol. 2013;10: Gerlinger, M. et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 2012;366: Brock, G., Castellanos-Rizaldos, E., Hu, L. et al. Liquid biopsy for cáncer screening, patient stratification and monitoring. Trans Cancer Res 2015;4(3): Kim ES, Hirsh V, Mok T, et al. Gefitinib versus docetaxel in previously treated non-small-cell lung cancer (INTEREST): a randomised phase III trial. Lancet 2008;372: Gazdar AF. Activating and resistance mutations of EGFR in non-small-cell lung cancer: role in clinical response to EGFR tyrosine kinase inhibitors. Oncogene 2009;28 (Suppl 1):S Kobayashi S, Boggon TJ, Dayaram T, et al. EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med 2005;352: Inukai M, Toyooka S, Ito S, et al. Presence of epidermal growth factor receptor gene T790M mutation as a minor clone in non-small cell lung cancer. Cancer Res 2006;66: Mandel, P & Metais, P. Les acides nucleiques du plasma sanguine chez l homme. C.R.Seances Soc. Biol. Fil. 1948;142: Koffler, D., Agnello, V., Winchester, R. & Kunkel, H. G. The occurrence of single-stranded DNA in the serum of patients with systemic lupus erythematosus and other diseases. J. Clin. Invest. 1973;52: Jung, K., Fleischhacker, M. & Rabien, A. Cell-free DNA in the blood as a solid tumor biomarker- a critical appraisal of the literature. Clin. Chim. Acta 2010;411: Gormally, E., Caboux, E., Vineis, P. & Hainaut, P. Circulating free DNA in plasma or serum as biomarker of carcinogenesis: practical aspects and biological significance. Mutat. Res. 2007;635: Schwarzenbach, H., Hoon, D. S. & Pantel, K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. Nat. Rev. Cancer 2011;11:

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6 BEAMing: contexto, perspectiva actual y futura BEAMing: contexto, perspectiva actual y futura Pre-Amplificación DNA ISOLATION 6 La tecnología Beads, Emulsion, Amplification and Magnetics (BEAMing; Sysmex-Inostics) es una tecnología de PCR digital que combina una PCR de emulsión con partículas (beads) magnéticas y citometría de flujo (Figura 1). Ello permite una detección y cuantificación de moléculas de DNA mutadas con una alta sensibilidad. Los tumores liberan pequeños fragmentos de DNA tumoral al torrente sanguíneo, que representan menos del 1% del total de DNA circulante libre (cfdna). La alta sensibilidad de BEAMing es capaz de detectar mutaciones presentes en el DNA tumoral circulante (ctdna). Ello permite conocer las mutaciones del tumor en una muestra de sangre del paciente (biopsia líquida), lo cual tiene varias ventajas comparado con la determinación de mutaciones en tejido tumoral. Citometría de Flujo Emulsión PCR Hibridización EMULSION-PCR PRE-AMPLIFICATION HYBRIDIZATION Magnetic beads coated with primer Amplified DNA Water-in-oil emulsion Plasma Tumor DNA Wild -type DNA Figura 1. BEAMing es una PCR digital de emulsión que detecta y cuantifica mutaciones con alta sensibilidad dntps Polymerase Primer Oil-Emulsifier Mixture Ventajas de la determinación de mutaciones en ctdna biopsia líquida Prueba no invasiva, con bajo riesgo y fácil para el paciente. Accesibilidad de la muestra: en casos donde es difícil tener acceso al tumor (por ej.: adenopatías retroperitoneales, lesiones pulmonares). Representación de la heterogeneidad tumoral: elimina el bias de selección inherente a las muestras de tejido, pues todas las mutaciones de las subclonas tumorales se ven representadas en el DNA tumoral circulante. Información en tiempo real: ofrece una foto del estatus mutacional del tumor en aquel preciso momento.

7 BEAMing: contexto, perspectiva actual y futura 7 Las potenciales aplicaciones clínicas de la determinación de DNA tumoral circulante son múltiples, las más relevantes son: 1. Diagnóstico molecular: determinación de mutaciones del tumor para la toma de decisiones terapéuticas. 2. Monitorización de la carga tumoral (tumor burden): la determinación de ctdna se correlaciona con la carga tumoral (tumor burden), ello permite usar el ctdna para predecir de manera precoz la respuesta a tratamiento anti-tumoral en pacientes metastásicos o monitorizar recaídas en pacientes libres de enfermedad tras una cirugía. Exon Mutation Cosmic ID 2 G12S COSM563 2 G12R COSM561 2 G12C COSM562 2 G12D COSM564 2 G12A COSM565 2 G12V COSM566 2 G13R COSM569 2 G13D COSM573 2 G13V COSM574 3 A59T COSM578 3 Q61K COSM580 3 Q61R COSM584 3 Q61L COSM583 3 Q61H COSM585 3 Q61H COSM586 4 K117N TBD 4 K117N TBD 4 A146T COSM27174 Figura 2. Mutaciones en KRAS y NRAS incluidas en el OncoBEAM RAS CRC KIT Monitorización de la respuesta a fármacos dirigidos a diana terapéutica, mediante la detección precoz de la aparición de clones tumorales de resistencia al fármaco. En cáncer colorrectal, la determinación de mutaciones en KRAS y NRAS (RAS) en ctdna se correlaciona muy bien con la determinación en tejido, con una concordancia que varía según la técnica usada y que alcanza el 100% con PCR digital, sobre todo en pacientes metastásicos. El primer test de biopsia líquida para determinación de mutaciones RAS con marcado CE (CE-marked) in vitro diagnostic (CE-IVD) es el OncoBEAM RAS CRC KIT 34, que permite detectar 34 mutaciones en RAS recomendadas por las guías terapéuticas (NCCN, ESMO, EMA) (Figura 2). Hasta el momento, este kit ha demostrado una correlación superior al 90% en la determinación de mutaciones en RAS en tejido versus plasma en series de pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Sysmex-Inostics, en colaboración con Merck, está implementando a nivel mundial el test OncoBEAM RAS CRC KIT 34 para la determinación de las mutaciones de RAS en biopsia líquida en el momento del diagnóstico de cáncer colorrectal metastásico en pacientes candidatos a fármacos anti- EGFR. En el estado español se han abierto ya varios centros de referencia BEAMing y se prevé abrir un total de más de 15 centros de referencia. Sin embargo, el gran impacto clínico de la determinación de mutaciones de RAS en ctdna mediante BEAMing y de la biopsia líquida en general, es su potencial para monitorizar la dinámica clonal de los pacientes con cáncer. Los tumores son heterogéneos en el espacio pero también en el tiempo, sobre todo cuando están expuestos a presiones externas (p.ej. tratamiento con fármacos dirigidos a diana o quimioterapia). El conocimiento a tiempo real y de manera no agresiva del genotipado tumoral permitirá monitorizar la respuesta, la resistencia y tomar decisiones terapéuticas basadas en el perfil molecular del tumor. El uso de BEAMing para la monitorización está siendo evaluado en varios ensayos clínicos.

8 Resumen BEAMing en el Congreso Anual de la AACR Resumen BEAMing en el Congreso Anual de la AACR 2016 (New Orleans) Las presentaciones de BEAMing presentadas en el congreso de la AACR (American Association for Cancer Research) de este año han hecho gran hincapié en la importancia del manejo, transporte y almacenamiento adecuado de las muestras de sangre previo a su análisis. Esto es de especial relevancia y actualidad en nuestro entorno, con la apertura de los primeros centros de referencia para determinar RAS en biopsia líquida en pacientes con cáncer colorrectal. Abstract 1. The Use of Cell-Free DNA in the Clinical Setting: Pre-analytical considerations and PCR based approaches. Frank Diehl. Son varios los retos que hay que abordar para que la biopsia líquida se instaure en la práctica clínica diaria (Figura 3). Uno de gran relevancia es la necesidad de aumentar la estabilidad y estandarización de la fase pre-analítica. Esta fase incluye el almacenaje y el transporte de sangre, la separación de plasma y la extracción de DNA, puntos que Frank Diehl discutió durante la primera parte de su sesión. Bottlenecks towards the use of Liquid Biopsy testing in the clinical setting Clinical utility Guidelines & reimbursement Reduction of cost & turn around time & Increase of usability CLINICAL LIQUID BIOPSY Increase biomarker coverage Increase preanalytical stability & standarization Regulatory approval Figura 3. Retos en la implementación y estandarización de la biopsia líquida en la práctica clínica Recolección y transporte de sangre para biopsia líquida Con el uso cada vez más extendido y la necesidad de transporte de la sangre para el análisis de ctdna a los centros de referencia, ha aumentado la necesidad de tubos que aseguren la integridad del DNA tumoral circulante y de las células de la sangre, evitando la dilución de ctdna en DNA genómico de las células sanguíneas. Los tubos usados habitualmente son los K2EDTA que no pueden mantener esta integridad por un periodo prolongado de tiempo, por lo que la sangre debe centrifugarse en las primeras 3-5 horas, transferir el plasma a un tubo nuevo con el potencial riesgo de contaminación y mantener y transportar el plasma en frío hasta el análisis de cfdna. Por ello se han desarrollado tubos alternativos, de los cuales sólo los tubos cfdna Streck y los tubos de cfdna de Roche son CE-IVD.

9 Resumen BEAMing en el Congreso Anual de la AACR El trabajo presentado por Medina Díaz en el CNAPS Meeting 2015 en Berlín, evaluó la idoneidad de los tubos cfdna Streck para ser usados como tubos de transporte y almacenaje de sangre para biopsia líquida. Para ello caracterizó parámetros de integridad del ctdna a diferentes horas y temperaturas en muestras de sangre de personas sanas. En primer lugar, estudió la liberación de DNA genómico de las células sanguíneas durante el almacenamiento de sangre en los tubos cfdna Streck comparado con los EDTA a 2 horas, y demostró que no existían cambios en fragmentos de DNA cortos (ctdna) o largos (DNa genómico) usando tubos Streck a 2 horas, 3 días y 5 días a temperatura ambiente, incluso con agitación del tubo. En el mismo estudio, demostraron también que no existía inducción de mutaciones o daño en el DNA usando el tubo cfdna Streck a 2 horas, 3 días y 5 días a temperatura ambiente, incluso con agitación del tubo. Finalmente demostraron que temperaturas extremas (-4ºC o 40ºC) tenían un efecto sobre el volumen de plasma y los resultados del análisis de cfdna. Con ello concluyeron que los tubos cfdna Streck son adecuados para estabilizar y transportar la sangre para biopsia líquida a temperatura ambiente, pero deben evitarse temperaturas extremas. Este estudio de Medina Díaz, se realizó en personas sanas. El mismo autor presentó datos con muestras de pacientes con cáncer en el congreso de la AACR 2016, que se discutirán posteriormente (Abstract 2). Fue interesante la discusión de Diehl sobre el hecho de que cada marcador y cada tipo de muestra requiere tubos diferentes, lo cual limita la implementación de ensayos multi-biomarcadores y de biobancos de muestras. Por otro lado enfatizó la necesidad de una regulación global para la recolección y almacenaje de sangre para biopsia líquida y remarcó los esfuerzos de proyectos como Spidia para la estandarización de procesos pre-analíticos. Extracción de cfdna Este es otro punto clave en la fase pre-analítica de la biopsia líquida. La extracción de cfdna debe cumplir ciertos requisitos entre los que destacan por su gran influencia en la sensibilidad del análisis: el volumen de plasma (1-4mL), los fragmentos cortos de DNA (<150 pb), la no inhibición de la PCR y la cantidad máxima de cfdna (>95%). Existen varios kits de extracción de cfdna en el mercado; para el uso de la tecnología BEAMING es necesario emplear el kit de Qiagen. El kit de Roche, que no es automatizado, es el único con marcado CE-IVD. En la segunda parte de la charla, más corta, Diehl discutió los distintos métodos que existen para el análisis de ctdna mediante PCR digital. A modo de introducción, resaltó que los principales retos en el análisis de ctdna son el bajo número de moléculas de ctdna en el volumen de plasma y la cantidad variable de background de moléculas de DNA no mutadas (0.01%- 60% dependiendo del tipo de tumor, estadio y condiciones fisiológicas). A mayor cantidad de plasma o de genomic equivalents (GE), podremos detectar menor número de alelos mutados (Figura 4). Si aceptamos el 1% como límite de porcentaje de alelos mutados que es aceptable detectar, la figura 4 nos indica los GE necesarios según la frecuencia del alelo mutado en la muestra.

10 Resumen BEAMing en el Congreso Anual de la AACR #of mutant alleles <1 >1 Figura 4. Porcentaje de detección de alelos mutados según la frecuencia del alelo mutado y la cantidad de DNA. GE, Genomic equivalents. Input Minor allele frequency ng GE total 1% 0,10% 0,05% 0,02% 0,01% Las principales ventajas de la PCR digital comparado con la PCR convencional es el aumento de sensibilidad de detección de mutaciones y la cuantificación de alelos mutados. Existen varias técnicas de PCR digital registradas para uso clínico (Figura 5), entre ellas BEAMing. Por otra parte, la sensibilidad de la PCR convencional ha mejorado, por lo que puede ser una alternativa a la PCR digital en algunas aplicaciones clínicas. Diehl discutió maneras que se están usando para aumentar la sensibilidad/ selectividad de la PCR cuantitativa como el aumento de especificidad de las sondas (p. ej., sondas de hibridación dual), la inhibición/bloqueo del producto wild-type de la PCR, aumento de la especificidad de las enzimas y disminución del error alfa, aumento de la especificidad del primer para PCR alelo-específica. Finalizó hablando de las técnicas de NGS que permiten secuenciar el genome o exome entero, sin embargo, Diehl se cuestionó si acabarán reemplazando la PCR en el futuro. Detection Flow based Imaging Based Partitioning Emulsion based Well- Based Bio-Rad Sysmex Inostics RainDance NA Stilla Fluidigim Formulatrix Thermo Fisher JN Medsys Figura 5. Técnicas de PCR digital registradas para uso clínico

11 Resumen BEAMing en el Congreso Anual de la AACR Abstract 2. Clinical evaluation of Streck Cell-Free DNA blood collection tubes for liquid profiling in oncology. Medina Díaz I., Nocon A., Kobilay M., Skowasch D., Held S., Weiland J., Stamm C., Diehl F., Holdenrieder S., Holtrup F. AACR Annual conference. Poster #3145 En este poster Medina Díaz et al presentaron los resultados del estudio de la idoneidad de los tubos Streck cfdna comparado con los tubos estándar K2EDTA, para el almacenamiento y transporte de sangre para biopsia líquida en muestras de pacientes con cáncer de colon, páncreas y pulmón (Figura 6). Para ello estudiaron algunos de los parámetros analizados en su estudio previo en muestras de pacientes sanos (ver Abstract 1) y además analizaron la concordancia en el análisis de mutaciones en KRAS, NRAS y EGFR usando BEAMing. Demostró que los tubos Streck preservan el cfdna y evitan la rotura del DNA genómico en muestras de sangre almacenadas a temperatura ambiente hasta 3 días. Demostró una concordancia del 100% en la detección de mutaciones en ctdna de sangre recolectada en tubos EDTA versus tubos Streck, así como una buena correlación en la detección de fracción de alelos mutados (R 2 =0.98 para K2EDTA versus cfdna durante 2 h; R 2 = 0.93 para K2EDTA versus cfdna durante 3 días). La conclusión fue que la estabilidad de cfdna, la estabilidad de las células sanguíneas y el resultado del análisis de mutaciones en muestras clínicas, no se ve afectado con un almacenaje prolongado de hasta 3 días a temperatura ambiente en tubos Streck. Liquid biopsy (10ml blood samples) CRC (n=21) Pancreatic cancer (n=21) NSCLC (n=21) BD Vacutainer K2EDTA stored 2 h at RT Streck cfdna BCT stored 2 h at RT Streck cfdna BCT stored 3d at RT cfdna/gdna qpcr analysis Mutation analysis (BEAMing) LINE-1 size determination qpcr BEAMing analysis Q1 Q2 Fluorescence intensity 402 bp LINE-1 fragment 96 bp LINE-1 fragment Wild type Q3 Q4 cycles mutant Figura 6. Diseño del estudio de idoneidad de los tubos cfdna Streck para almacenaje prolongado de sangre de pacientes con cáncer para biopsia líquida

12 Resumen BEAMing en el Congreso Anual de la AACR Abstract 3. Performance assessment of Plasma SafeSeqS NGS assay for TP53. Johannes Fredebohm, Daniel Mehnert, Hiroyuki Shimizu, Frank Holtrup, Frank Diehl. El tercer abstract de biopsia líquida presentado en la AACR por Sysmex no trató de BEAMing. Fredebohm et al presentaron datos muy preliminares de un test que permite determinar mutaciones en p53 con muy alta sensibilidad (Plasma SafeSeqS NGS assay). El panel usado detecta 95% de todas las mutaciones conocidas de p53 y se basa en la tecnología Safe- Seq (Kinde, PNAS 2011). Dada la gran sensibilidad de la tecnología y la alta prevalencia de mutaciones de p53 en una gran variedad de tumores, este ensayo tiene gran interés clínico sobre todo para la monitorización de enfermedad mínima residual en pacientes operados de cáncer o de recaídas en pacientes avanzados tratados con quimioterapia. En el presente abstract, Fredebohm et al expusieron la metodología que usarán para evaluar la reproducibilidad del test. Fredebohm et al produjeron muestras simuladas de ctdna usando DNA nativo fragmentado con DNA mutado sintético y cuantificaron ambos tipos de DNA mediante diferentes métodos de PCR cuantitativa y PCR digital complementarios. Estas muestras simuladas son las que se usarán para evaluar el cumplimiento del test Plasma SafeSeqS NGS p53. Bibliografía 1. Bettegowda, Sausen M, Leary RJ, Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci Tranl Med 2014;624: Tabernero J, Lenz FJ, Siena S, et al. Analysis of circulating DNA and protein biomarkers to predict the clinical activity of regorafenib and assess prognosis in patients with metastatic colorectal cancer: a retrospective, exploratory analysis of the CORRECT trial. Lancet Oncol 2015;16: Siravegna G, Mussolin B, Buscarino M, et al. Clonal evolution and resistance to EGFR blockade in the blood of colorectal cancer patients. Nat Med 2015;21: Thierry AR, Mouliere F, El Messaoudi S, et al. Clinical validation of the detection of KRAS and BRAF mutations from circulating tumor DNA. Nat Med 2014;4: F. Jones, D. Edelstein, K. Wichner. Concordance of RAS mutation status in metastatic CRC patients by comparison of results from circulating tumor DNA and tissue-based RAS testing. European Cancer Congress 2015 (abstract 2012). 6. Hahn S, et al. ECC 2015 (Abstract No. 402). 7. Jones FS, et al. ECC 2015 (Abstract No. 2012). 8. Scott R, et al. WCGC 2015 (Abstract No. P-273).

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