CORTISOLO EIA WELL REF KS18EW. Español. M135.es Rev.6 09/2007
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- María Nieves Molina Carrizo
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1 CORTISOLO EIA WELL REF KS18EW 96 Español M135.es Rev.6 09/2007
2 REACTIVOS DEL KIT Reactivos Cantidad Estado físico MTP CAL CONJ DIL CONJ CTR WASH TMB SUBS STOP 1 x 96 Listo para el uso 6 x 1 ml Liofilizado 1 x 2.7 ml Conc. 2 x 12 ml Listo para el uso 1 x 1 ml Liofilizado 1 x 50 ml Conc. 1 x 15 ml Líquido 1 x 15 ml Líquido 1 x 14 ml Listo para el uso M135.es Rev.6 09/2007 Pag. 2/14
3 ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO PARA LA DETECCIÓN CUANTITATIVA DE CORTISOL EN SUERO O PLASMA HUMANOS. PARA USO DIAGNÓSTICO IN VITRO APLICACIONES CLÍNICAS El cortisol es una hormona esteroidea con un peso molecular de D, la cual se produce en la zona fasciculada de la corteza suprarrenal. Se trata de un esteroide glucoactivo que afecta a la mayoría de las células del organismo, facilitando su asimilación de metabolitos energéticos. La producción de cortisol se induce y se regula por la secreción de la hormona adrenocorticotropa (adrenocorticotropic hormone, ACTH) por la hipófisis anterior, la cual a su vez se encuentra bajo el control de una hormona producida por el hipotálamo, el factor liberador de ACTH. Aproximadamente el 80-90% del cortisol circulante se encuentra unido a la globulina transportadora de corticoesteroides (corticosteroid binding globulin, CBG); sólo la fracción libre remanente es la que se considera biológicamente activa. Los niveles de cortisol en la sangre tienen un ritmo circadiano: se encuentran elevados temprano por la mañana (de las 3 a las 9 horas), posteriormente disminuyen durante el día, y alcanzan los valores más bajos de las 22 a las 24 horas. La regulación hipotalámica del cortisol tiene una influencia significativa sobre la presencia de este esteroide en la sangre lo que hace que esta hormona sea dependiente del estrés. Los niveles de cortisol se pueden alterar por las siguientes situaciones: hipoglucemia, trauma, enfermedades febriles agudas y cirugías. Debido a que es un indicador de la función de la corteza suprarrenal, la medición de cortisol en la sangre es útil en el diagnóstico diferencial de la insuficiencia suprarrenal primaria y secundaria (enfermedad de Addison) y del hipercorticosuprarrenalismo primario y secundario (síndrome y enfermedad de Cushing). En el caso de esta última enfermedad, los niveles en sangre de cortisol varían, dependiendo de si la hipercortisolemia se debe a hipertrofia, a adenoma o a carcinoma de la glándula suprarrenal. Las pruebas de supresión de la corteza suprarrenal son esenciales para un diagnóstico correcto. Las concentraciones incrementadas de cortisol se pueden encontrar durante el embarazo y la depresión, y en sujetos con obesidad o hipertiroidismo. Los niveles bajos de cortisol se pueden encontrar en la cirrosis, en el hipotiroidismo y durante el tratamiento con glucocorticoides sintéticos. M135.es Rev.6 09/2007 Pag. 3/14
4 PRINCIPIO DEL ENSAYO El presente método se basa en un inmunoensayo enzimático competitivo (competitive enzyme immunoassay, EIA) que utiliza pocillos sensibilizados con anticuerpos específicos anti-cortisol. Durante la primera incubación, el cortisol de la muestra compite con el cortisol conjugado con peroxidasa de rábano (horseradish peroxidase, HRPO) por los anticuerpos que recubren los pocillos. Después de la incubación todo el material no unido se elimina mediante aspirado y lavado. La actividad enzimática asociada a la fase sólida es inversamente proporcional a la concentración de cortisol en los calibradores y en las muestras, lo que se evidencia mediante incubación de los pocillos con una solución cromógena (tetrametilbencidina, TMB) en un sustrato-tampón. La lectura colorimétrica se realiza utilizando un espectrofotómetro a 450 y a 405 nm. REACTIVOS SUMNISTRADOS CON EL KIT: PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD Reactivos suficientes para 96 pocillos. Conserve el kit a 2-8 C. La fecha de caducidad de cada reactivo está indicada en la etiqueta del vial. Una vez abierto, el kit se mantiene estable durante 2 meses a 2-8 C. MTP Microplaca sensibilizada: 1 microplaca de 96 pocillos separables, sensibilizados con anticuerpos específicos anti-cortisol (de conejo). Mantenga los pocillos que no se usen adecuadamente sellados en la bolsa de plástico transparente proporcionada, a 2-8 C. CAL Calibradores: 6 viales de cortisol en PBS, BSA y estabilizadores. Liofilizados a las siguientes concentraciones: 0, 10, 30, 100, 300 y 900 ng/ml. Conservante: neomicina. Reconstituya los viales con 1 ml de agua destilada. Después de reconstituir, conserve a 2-8 C durante días; en caso de periodos más largos, congele a -20 C. NOTA: Verifique siempre las concentraciones exactas en la hoja de Control de calidad. CONJ Conjugado enzimático (concentrado): 1 vial (2.7 ml) de cortisol conjugado con peroxidasa de rábano (HRPO) en tampón BSA, ANS y estabilizadores. Conservante: neomicina. Antes de usase, añada 1.2 ml del conjugado al vial del diluyente del conjugado enzimático, mezclando adecuadamente. El conjugado diluido permanece estable durante 8 semanas a 2-8 C. DIL CONJ Diluyente del conjugado enzimático: 2 viales (12 ml) de tampón citrato y BSA. Conservante: neomicina y timerosal (<0.05%). Listo para usarse. M135.es Rev.6 09/2007 Pag. 4/14
5 CTR Suero control: 1 vial de cortisol en matriz sérica. Liofilizado. Conservante: neomicina. Reconstituya con 1 ml de H 2 O destilada. Después de su reconstitución, conserve a 2-8 C durante 5-7 días; en caso de periodos más largos, congele a -20 C. NOTA: Verifique siempre las concentraciones exactas en la hoja de Control de calidad. WASH Solución de lavado (concentrada): 1 vial (50 ml) de PBS-Tween 20. Conservante: mertiolato (<0.05%). Lleve el contenido del vial a 500 ml con agua destilada. En caso de cristales no disueltos, resuspenda la solución colocando el vial a 37 C durante algunos minutos. La solución diluida permanece estable durante 1 mes a 2-8 C. TMB Cromógeno: 1 vial (15 ml) de tetrametilbencidina (TMB) en tampón citrato-fosfato y DMSO. Líquido. SUBS Tampón sustrato: 1 vial (15 ml) de tampón citrato-fosfato y H 2 O 2. Líquido. «NOTA: Para obtener la solución de sustrato, mezcle volúmenes iguales de cromógeno con tampón-sustrato utilizando un vial opaco perfectamente limpio. Evite la exposición directa a la luz y utilice dentro de una hora desde de su preparación. STOP Reactivo bloqueante: 1 vial (14 ml) de H 2 SO 4 1N. Listo para usarse. CPA Sellador adhesivo para microplaca. - Bolsa de plástico transparente con cierre minigrip. MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO Prueba manual Micropipeta automática ajustable de volumen variable, con puntas desechables. Calentador seco, ajustable a 37±2 C. Probetas graduadas para la dilución de los reactivos. Bomba de aspiración o dispositivo de lavado de microplaca automático. Espectrofotómetro para microplaca, capaz de medir absorbancias dentro de un intervalo de A, a una longitud de onda de 450 y 405 nm. Papel milimétrico para gráficas. Agua destilada. Prueba automática Esta prueba se puede utilizar con instrumentos automáticos para kits de ELISA en microplaca. Garantizamos su aplicación en instrumentos automáticos RADIM y/o SEAC. M135.es Rev.6 09/2007 Pag. 5/14
6 Si se utiliza con un instrumento automático para microplaca no RADIM o SEAC, es responsabilidad del usuario final asegurarse que se ha probado apropiadamente. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Para conseguir resultados correctos y reproducibles deberán seguirse las siguientes normas: No mezcle reactivos de lotes distintos. No utilice reactivos después de la fecha de caducidad. No almacene o deje reactivos y muestras a temperaturas elevadas o en zonas de posible contaminación. Utilice material de vidrio totalmente limpio, libre de contaminación iónica metálica y de sustancias oxidantes. Utilice agua destilada o desionizada almacenada en recipientes perfectamente limpios. Evite especialmente que se produzca cualquier contaminación entre muestras; para ello deberán utilizarse puntas desechables para cada muestra y para cada reactivo. No modifique de forma alguna el "procedimiento del ensayo". Si usted no respeta: tiempos de incubación y cantidades al añadir los reactivos exactos tiempos de incubación y temperatura puede provocar resultados clínicos incorrectos. Reconstituya los reactivos liofilizados, si es que están presentes, como se describe en la etiqueta correspondiente. Cualquier variación en el uso del reactivo o en los volúmenes puede afectar la confiabilidad de los resultados obtenidos. En caso de procedimientos manuales es importante usar pipetas calibradas y poseer una técnica manual apropiada. Una buena precisión al preparar y dispensar los reactivos es de suma importancia. Asegúrese de que todo el equipo utilizado se encuentre en perfectas condiciones de trabajo, correctamente calibrado y sometido a mantenimiento regular. Asegúrese de que todo el equipo utilizado (material de vidrio, termóstato, agitador de microplaca, lavadores de microplaca, espectrofotómetro y refrigeradores y congeladores usados para almacenar muestras y reactivos) esté en perfecto estado, se haya calibrado correctamente y reciba mantenimiento regular. Cualquier desviación del uso correcto del equipo listado puede producir errores en la metodología, lo que puede afectar la reproducibilidad y la confiabilidad de los resultados obtenidos. Utilice un método adecuado para la correcta identificación de las muestras de los pacientes. Una identificación incorrecta puede provocar pérdida de la especificidad del sistema y resultados clínicos. Para evitar contaminación personal y ambiental, deberán observarse las siguientes precauciones: M135.es Rev.6 09/2007 Pag. 6/14
7 Utilice guantes desechables para manipular material potencialmente infeccioso y realizar el análisis. No pipetee los reactivos con la boca. Durante el análisis no fume, coma, beba, ni se aplique cosméticos. El cromógeno y el reactivo bloqueante deben manejarse con cuidado. Evite el contacto con la piel, los ojos y las mucosas. En caso de accidente enjuague con agua corriente abundante. Todos los materiales de origen humano utilizados para la preparación de este kit fueron sometidos a análisis de HBsAg, anti-vih y anti-hcv, con resultados negativos. En la actualidad ninguna prueba disponible garantiza la ausencia de los agentes virales responsables del síndrome de inmunodeficiencia adquirida, de la hepatitis B y hepatitis C, por tanto, todos los reactivos que contienen material biológico y todas las muestras de suero humano deben ser considerados potencialmente infecciosos. Evite salpicaduras y formación de aerosoles; en caso de que se presenten lave cuidadosamente con una solución de hipoclorito de sodio al 3%. Todo este material de limpieza debe manejarse como potencialmente infeccioso y desecharse correspondientemente. Según el Decreto Italiano D.L. no. 22 fechado el , de acuerdo con las directivas de la CEE (91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC), todos los productos de desecho derivados de procesos manuales y/o automáticos se clasifican como material de desecho especial peligroso (clasificación europea código ). Como tal deben eliminarse por compañías especializadas calificadas para recolectar y eliminar desechos. RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS El análisis se puede realizar en muestras de suero o plasma recogido con EDTA. Las muestras moderadamente lipémicas no influyen en el resultado de la prueba; las muestras altamente lipémicas o hemolizadas pueden afectar los resultados. La presencia de filamentos de fibrina puede interferir en el ensayo, por lo tanto, asegúrese de que las muestras estén claras antes de analizarlas. Conserve las muestras durante no más de una semana a 2-8 C; para períodos más largos se recomienda congelar las muestras a -20 C. Evite congerlar y descongelar repetidamente las muestras. PROCEDIMIENTO DEL ANÁLISIS * Permita que los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente. Antes de su uso, mezcle las muestras por inversión. 1 - Prepare los pocillos para: blanco, calibradores, suero de control y muestras. 2 - Dispense 10 µl de cada calibrador, suero de control y muestra en los pocillos correspondientes. M135.es Rev.6 09/2007 Pag. 7/14
8 3 - Dispense 200 µl de conjugado enzimático en todos los pocillos, excepto el blanco. 4 - Incube durante 60±5 minutos a 37±2 C, después de tapar la microplaca con la hoja adhesiva. 5 - Retire la hoja adhesiva y aspire cuidadosamente la mezcla de incubación de todos los pocillos. 6 - Lave los pocillos 4 veces con 300 µl de solución de lavado diluida. Aspire todo el líquido de los pocillos. 7 - Dispense 200 µl de solución de sustrato preparada previamente (ver párrafo de reactivos) en todos los pocillos. 8 - Incube durante15 minutos a 37±2 C. Evite la exposición a la luz directa. 9 - Dispense 100 µl de reactivo bloqueante en todos los pocillos Lea la densidad óptica de las soluciones, de preferencia con un espectrofotómetro bicromático a 450 nm y a 405 nm, con longitud de onda de referencia de 620 nm (ajustando el instrumento a cero con el pocillo blanco). La lectura se debe completar antes de que pasen 20 minutos de haber terminado el ensayo. *Si para el procedimiento se utiliza un instrumento automático para microplacas RADIM y/o SEAC, consulte el manual correspondiente. ESQUEMA DEL ENSAYO: ver pág. 14 CÁLCULO DE RESULTADOS Si para el procedimiento se utiliza un instrumento automático para microplacas RADIM y/o SEAC, la lectura espectrofotométrica se realiza automáticamente a 3 longitudes de onda distintas: 450, 405 y 620 nm, permitiendo así la ampliación del rango de lectura. Para obtener una mejor sensibilidad, este método utiliza una lectura espectrofotométrica a dos longitudes de onda (450 y 405 nm). Para las muestras con concentraciones de cortisol entre 30 y 900 ng/ml, se debe leer a 450 nm; para muestras con niveles de cortisol menores a 30 ng/ml, lea a 405 nm. Trace la curva de calibración sobre papel milimétrico para gráficas, registrando sobre el eje de las abscisas las concentraciones de los calibradores, y en el eje de las ordenadas, la absorbancia obtenida para cada uno de los calibradores. Al interpolar sobre la curva de calibración las absorbancias relativas a cada muestra, se obtienen las concentraciones correspondientes de cortisol (expresadas en ng/ml). EJEMPLO DE CÁLCULO M135.es Rev.6 09/2007 Pag. 8/14
9 Los valores que se indican a continuación son simplemente ilustrativos y no deben emplearse en lugar de los datos obtenidos realmente. Descripción Absorbancia 450 nm Cortisol Absorbanci a 405 nm Cortisol Calibrador 0 ng/ml > Calibrador 10 ng/ml > Calibrador 30 ng/ml Calibrador 100 ng/ml Calibrador 300 ng/ml Calibrador 900 ng/ml Muestra 1 > ng/ml Muestra ng/ml Valores normales Los valores mostrados en la siguiente tabla son sólo indicativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca su propio rango de referencia. Mañana: Tarde: ng/ml ng/ml En caso de pruebas dinámicas, se reportan los siguientes valores previstos: - Estimulación con ACTH: de 3 a 5 veces superior al valor basal de control - Supresión con metirapona: inferior al valor basal de control - Supresión con dexametasona: inferior al valor basal de control Criterios de aceptación Antes de proceder al cálculo de resultados, verifique que la concentración del suero de control esté dentro del rango de aceptación descrito en la hoja de Control de calidad. CARACTERÍSTICAS METODÓLOGICAS ESPECIFICIDAD El antisuero anti-cortisol utilizado ha mostrado las siguientes reacciones cruzadas: 100% con cortisol, 1.2% con cortisona, 1.1% con corticosterona, 4.6% con 11-deoxicortisol, 0.4% con prednisona, 35.8% con prednisolona, 0.3% con 11-deoxicorticosterona, 0.6% con 17-hidroxiprogesterona, menos de 0.1% con progesterona. No se han observado reacciones cruzadas con testosterona, estrona, estradiol, estriol y androstendiona. M135.es Rev.6 09/2007 Pag. 9/14
10 Aunque algunos esteroides muestran ligera reactividad cruzada, sus concentraciones fisiológicas son menores que la del cortisol y por lo tanto, no interfieren de manera significativa en la medición del cortisol. Sin embargo, se ha de tener cuidado en caso de pacientes con terapia de prednisolona, ya que su reactividad cruzada puede alcanzar aproximadamente el 36%. Por otro lado, dado que la prednisona es metabolizada como prednisolona, se recomienda tener cuidado al realizar el análisis del cortisol en pacientes sometidos a alguna de estas dos terapias farmacológicas. SENSIBILIDAD La sensibilidad ha sido calculada a partir de la curva de calibración y se expresa como dosis mínima con una diferencia significativa con respecto al calibrador cero (valor promedio + 2 D. E.). Esta dosis es de 5.0 ng/ml. PRECISIÓN La precisión ha sido evaluada midiendo la variabilidad intraensayo e interensayo en 3 sueros con diferentes concentraciones de cortisol. Intraensayo (repetibilidad) Suero Media ± D.E. C.V. Replicados (ng/ml) % no. a 32.3 ± b ± c ± Interensayo (reproducibilidad) Suero Media ± D.E. C.V. Ensayo (ng/ml) % no. a 29.2 ± b ± c ± EXACTITUD La exactitud del método ha sido evaluada mediante las pruebas de recuperación y paralelismo: Prueba de recuperación Se añadieron cantidades conocidas de cortisol a una muestra de suero, que se analizó posteriormente. Adición Previsto Medición Recuperación M135.es Rev.6 09/2007 Pag. 10/14
11 (ng/ml) (ng/ml) (ng/ml) % S S S S S Prueba de paralelismo Se analizó un suero con elevada concentración de cortisol, con diferentes diluciones con el calibrador cero. Dilución Previsto Medición (ng/ml) (ng/ml) S2 sin diluir : : : : LÍMITES DEL ANÁLISIS Los resultados del ensayo deben ser interpretados cuidadosamente y confirmados por evaluaciones clínicas y pruebas diagnósticas posteriores. LEYENDA SÍMBOLOS: Ver pág. 12 M135.es Rev.6 09/2007 Pag. 11/14
12 SÍMBOLOS EN EDMA REF Código de referencia o número de pedido LOT Lote Fecha de caducidad IVD Para uso diagnóstico in vitro Marcado CE según directiva de IVD 98/79 CE Conservar a 2-8 C Producido por Riesgo biológico Consultar las instrucciones de uso 96 Suficiente para 96 determinaciones RDATE Fecha de referencia RCNS Reconstituir con H 2 O Agua destilada o desionizada M135.es Rev.6 09/2007 Pag. 12/14
13 BIBLIOGRAFÍA 1 - KIRSCHBAUM et al. : Pharmacology Biochemistry & Behaviour 1989, 34, FOSTER e DUNN : Clinical Chemistry 1974, 20, BIGLIERI: Hospital Practice 1989, Jan. 15, HOLSBOER: J. Steroid Biochem. 1983, 19, SPARKS : Annals Int.Med. 1971, 75, KOWALSKI e PAUL : Clinical Chemistry 1976, 25, KAHN: Psychiatr. & Psychobiol. 1990, 5, NISHIDA et al.: J. Clin. Endocr. & Metab. 1977, 45, JAMES et al.: J. Steroid Biochem. 1978,9, SCHÖNESHÖFER et al.: Clin. Chem. Acta 1980, 101, M135.es Rev.6 09/2007 Pag. 13/14
14 ESQUEMA DE ENSAYO Pocillos Blanco CAL (0-5) CTR Muestras Reac. CAL (0-5) µl CTR µl ---- Muestras µl CONJ µl 200 µl 200 µl Incubar: 37±2 C, 60±5 min. Aspirar y lavar: 4 x 300 µl. TMB SUBS 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl Incubar: 37±2 C, 15 min. STOP 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Leer: nm. RADIM S.p.A. - Via del Mare, Pomezia (Roma) Italia Tel.: Fax: National Order Entry: Export Department: Customer Care: info@radim.it -
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