DHEA-S EIA WELL REF KS19EW. Español. M146.es Rev.5 10/2003
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- Victoria Cárdenas Morales
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1 DHEA-S EIA WELL REF KS19EW 96 Español M146.es Rev.5 10/2003
2 REACTIVOS DEL KIT Reac Cantidad MTP 1 x 96 Listos para usarse CAL 6 x 1 ml Liof. CONJ 1 x 2.7 ml Conc. DIL CONJ 2 x 12 ml Listos para usarse CTR 1 x 1 ml Liof. WASH 1 x 50 ml Conc. TMB 1 x 15 ml Listos para usarse SUBS 1 x 15 ml Listos para usarse STOP 1 x 14 ml Listos para usarse M146.es Rev.5 10/2003 Pag. 2/13
3 ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO PARA LA DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE DEHIDROEPIANDROSTERONA SULFATO (DHEA-S) EN SUERO O PLASMA HUMANOS. PARA USO DIAGNÓSTICO IN VITRO APLICACIONES CLÍNICAS La dehidroepiandrosterona sulfato (dehydroepiandrosterone-sulphate, DHEA-S) es una hormona esteroidea (19 átomos de carbono) secretada principalmente por la capa reticular de la corteza suprarrenal. Su concentración en el plasma humano es extremadamente alta (aproximadamente 500 veces más que la DHEA) debido a su lenta metabolización. El DHEA-S circula unido a la albúmina sérica pero no a SHBG. El nivel de DHEA-S en suero carece de ritmo circadiano, y tampoco presenta fluctuaciones relacionadas con el ciclo menstrual. Se elimina a través de la orina, en donde representa la mayor fracción de 17-cetoesteroides. La actividad androgénica del DHEA-S es más bien débil, aunque se puede metabolizar a androstenediona y testosterona, ambas con un efecto virilizante mucho mayor. Las concentraciones séricas de DHEA-S son altas al momento del nacimiento, y disminuyen en el recién nacido durante las tres primeras semanas de vida hasta alcanzar los valores normales del niño prepúber. Aproximadamente a partir de los 6 años, los niveles de DHEA-S comienzan a aumentar gradualmente, para alcanzar, hacia los años, los valores de los adultos. En caso de pubertad retardada, los niveles de DHEA-S se mantienen más bajos que lo normal, mientras que en un cuadro clínico de pubertad precoz, el DHEA-S es elevado con respecto a la edad ósea y concuerda con el desarrollo pilífero del púber. Desde la pubertad, hasta los años, los niveles de DHEA-S se mantienen constantes; posteriormente se observa, en ambos sexos, una gradual disminución de este esteroide. Durante el embarazo los niveles séricos de DHEA-S sufren un decremento gradual hasta una reducción del 50% con respecto a los valores normales al término del embarazo. La medición de DHEA-S es una herramienta importante en el estudio de la función suprarrenal en varias patologías endocrinas, entre las que se encuentran: Hiperfunción suprarrenal: niveles elevados de DHEA-S se observan en el hirsutismo de origen suprarrenal, y dichos niveles son significativamente mayores en las formas de hirsutismo debidas a procesos heteroplásicos comparados con los del hirsutismo funcional. Las concentraciones de DHEA-S frecuentemente se encuentran elevadas en el síndrome de ovario poliquístico. La medición de DHEA-S también se recomienda durante las pruebas de supresión suprarrenal: a diferencia del cortisol, cuyos niveles retornan a valores previos 24 horas después de suspender la dexametasona, los niveles de DHEA-S permanecen suprimidos durante 30 a 90 días. Hipofunción suprarrenal: los valores de DHEA-S en el hipoadrenalismo primario o secundario se encuentran por debajo de lo normal. Infertilidad: en mujeres hirsutas con amenorrea, la supresión farmacológica del DHEA-S restaura tanto el ciclo menstrual como la fertilidad. Síndrome virilizante debido a hiperplasia suprarrenal congénita: en estos casos se encuentran niveles marcadamente elevados. PRINCIPIO DEL ENSAYO El presente kit se basa en un método inmunoenzimático competitivo que utiliza como fase sólida pocillos sensibilizados con anticuerpos específicos anti-dhea-s. Añadiendo en el pocillo el suero del paciente y el conjugato (DHEA-S conjugado con peroxidasa de rábano) hay una competencia entre el DHEA-S sérico y el conjugato para unirse a los sitios específicos de los anticuerpos en los pocillos. Al final de la incubación el material que no se haya unido se elimina mediante aspiración y lavado. M146.es Rev.5 10/2003 Pag. 3/13
4 La actividad enzimática que quede fijada a la fase sólida será inversamente proporcional a la concentración de DHEA-S presente en los calibradores y en las muestras, y se evidencia añadiendo una solución de cromógeno (tetrametilbencidina, TMB) y un tampón sustrato, a los pocillos. La intensidad del color desarrollado se mide mediante un espectrofotómetro a 450 y 405 nm. REACTIVOS SUMINISTRADOS CON EL KIT: PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD Reactivos suficientes para 96 tests. Conservar el kit a 2-8 C. La fecha de caducidad de cada reactivo se muestra en la etiqueta del vial. MTP Microplaca sensibilizada: una microplaca de 96 pocillos separables, sensibilizados con anticuerpos específicos anti-dhea-s (de conejo). Mantenga los pocillos que no se usen, adecuadamente sellados en la bolsa de plástico transparente proporcionada, a 2-8 C. CAL Calibradores: 6 viales de DHEA-S en PBS, BSA y estabilizadores, liofilizados, en las siguientes concentraciones: 0, 0.1, 0.3, 1, 3 y 10 µg/ml. Conservante: neomicina. Reconstituya los viales con 1 ml de H 2 O destilada. Tras reconstituir, conserve a 2-8 C durante 7-10 días; en caso de periodos más largos, congele a -20 C. NOTA: Verifique siempre las concentraciones exactas en la hoja de Control de calidad. CONJ Conjugado enzimático (concentrado): 1 vial (2.7 ml) de DHEA-S conjugado con peroxidasa de rábano (HRPO) en tampón TRIS con BSA y estabilizadores. Conservante: neomicina. Antes de usarse, añada 1.2 ml de conjugado al vial del diluyente del conjugado enzimático, mezclando cuidadosamente. El conjugado diluido es estable durante 8 semanas a 2-8 C. DIL CONJ Diluyente del conjugado enzimático: 2 viales (12 ml) de tampón TRIS con BSA y ANS. Conservante: neomicina. Listo para usarse. CTR Suero de control: 1 vial de DHEA-S en matriz sérica, liofilizado. Conservante: neomicina. Reconstituya con 1 ml de H 2 O destilada. Después de su reconstitución conserve a 2-8 C durante 7-10 días; en caso de periodos más largos, congele a - 20 C. NOTA: Verifique las concentraciones exactas en la hoja de Control de calidad. WASH Solución de lavado (concentrada): 1 vial (50 ml) de PBS-Tween 20. Conservante: timerosal (<0.05%). Lleve el contenido del vial a 500 ml con H 2 O destilada. En caso de cristales insolubles, resuspenda la solución colocando el vial a 37 C durante algunos minutos. La solución diluida permanece estable durante 1 mes a 2-8 C. TMB Cromógeno: 1 vial (15 ml) de tetrametilbencidina (TMB) en tampón citrato-fosfato y DMSO. Listo para usarse. SUBS Tampón sustrato: 1 vial (15 ml) tampón citrato-fosfato y H 2 O 2. Listo para usarse. STOP CPA NOTA: Para obtener la solución de sustrato, mezcle volúmenes iguales de cromógeno con tampón-sustrato utilizando un vial opaco perfectamente limpio. Evite la exposición directa a la luz y utilice dentro de una hora desde de su preparación. Reactivo de Parada: 1 vial (14 ml) de H 2 SO 4 1N. Listo para usarse. Cubreplaca adhesivo - Bolsa de plástico transparente con cierre minigrip. M146.es Rev.5 10/2003 Pag. 4/13
5 MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO Ensayo manual Micropipeta automática ajustable con puntas desechables y volumen variable. Incubadora regulable a 37 C. Probeta graduada. Bomba de aspiración o dispositivo de lavado de microplaca automático. Espectrofotómetro de precisión para microplaca, capaz de medir absorbancias dentro de un intervalo de A, a una longitud de onda de 450 y 405 nm. Papel milimétrico H 2 O destilada. Ensayo automático El kit puede utilizarse con instrumentación automática para kits ELISA en microplaca. Se garantiza la aplicabilidad en instrumentación RADIM y/o SEAC. En el caso se utilice instrumentación automática de otros fabricantes, es responsabilidad del usuario asegurarse de que el kit haya sido oportunamente validado. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Para conseguir resultados correctos y reproducibles, deberán seguirse las siguientes normas: No mezclar los reactivos de lotes diferentes. No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad. No exponer los reactivos y las muestras al calor intenso ni a fuentes importantes de contaminación. Utilizar material de vidrio perfectamente limpio y libre de contaminación por iones metálicos o sustancias oxidantes. Utilizar agua destilada o desionizada, conservada en recipientes perfectamente limpios. Evitar cuidadosamente la contaminación entre muestras; para ello es aconsejable utilizar pipetas con puntas desechables para cada muestra y reactivo. No modificar el Procedimiento Operativo de ejecución del ensayo. Eventuales alteraciones de: secuencia y cantidades al añadir los reactivos tiempos y temperatura de incubación pueden dar lugar a resultados clínicos erróneos. Reconstituir los reactivos liofilizados según la modalidad descrita en la etiqueta; la utilización de reactivos o volúmenes no adecuados puede provocar la obtención de datos clínicos incorrectos. En el caso de procedimiento manual es importante utilizar pipetas calibradas y tener una adecuada manualidad técnica. En particular es importante la precisión en la preparación y dispensación de los reactivos. Es necesario un adecuado mantenimiento (limpieza y calibración) de tales instrumentos. Asegurarse de que la bomba de aspiración o el sistema automático para el lavado de las microplacas funcione correctamente. El lavado inadecuado de las microplacas puede causar la clasificación incorrecta de las muestras. Es necesario un mantenimiento adecuado de tales sistemas. Asegurarse de que el espectrofotómetro funcione perfectamente. El uso de un espectrofotómetro no calibrado o con filtros no limpios puede causar una lectura errónea de las muestras, con consiguiente error en su clasificación. Es necesario un adecuado mantenimiento (limpieza y calibración) de tales instrumentos. M146.es Rev.5 10/2003 Pag. 5/13
6 Asegurarse de que el incubador (si es necesario) funcione perfectamente. La incubación a temperaturas distintas a los 37±2º puede causar una pérdida de sensibilidad y/o desnaturación biológica de los materiales (muestras y/o reactivos). Es necesario un adecuado mantenimiento de tales instrumentos y un control periódico de la temperatura registrada. Asegurarse de que el agitador de microplacas (si es necesario) funcione perfectamente. La agitación incorrecta puede causar la clasificación errónea de las muestras. Es necesario un adecuado mantenimiento de tales instrumentos. Asegurarse de que los sistemas utilizados para la conservación de las muestras y/o el dispositivo funcione perfectamente. La conservación a temperaturas diferentes de la indicada puede causar la desnaturación biológica de los materiales (muestras y/o reactivos). Es necesario un adecuado mantenimiento de tales sistemas y un control periódico de la temperatura registrada. Utilizar un método adecuado para la correcta identificación de las muestras de los pacientes. Una identificación incorrecta puede provocar pérdida de la especificidad del sistema y resultados clínicos erróneos. Para evitar contaminaciones personales y ambientales, deberán observarse las siguientes normas de seguridad: Utilizar guantes desechables durante la manipulación del material potencialmente infeccioso y durante el ensayo. No pipetear los reactivos con la boca. No fumar, comer, beber o aplicar cosméticos durante la ejecución del ensayo. Las soluciones de Cromógeno y el Reactivo de Parada deben manipularse con cuidado. Evitar el contacto con la piel, los ojos y las mucosas. En caso de contaco lavar con abundante agua. Todos los materiales humanos suministrados con el kit han sido sometidos a análisis resultando negativos a la presencia de HBsAg, anti-hiv y anti-hcv. Sin embargo, los ensayos mencionados no garantizan la total ausencia de los agentes vírales responsables del síndrome de inmunodeficiencia adquirida y de la hepatitis B y C. Por eso todos los reactivos contenentes material biológico y todas las muestras deben considerarse potencialmente infecciosos. Evitar salpicaduras y formación de aerosoles; en caso de que se presenten, limpiar cuidadosamente con hipoclorito sódico a una concentración final de 3%. Todo el material utilizado para la limpieza debe tratarse como residuo potencialmente infeccioso y desecharse según las oportunas modalidades. La azida sódica, contenida como conservante en algunos reactivos, puede reaccionar con el plomo y el cobre de los desagües formando azidas metálicas altamente explosivas. Para evitar la formación y la acumulación de dichos compuestos deje correr abundantemente el agua al eliminar los reactivos. Conforme al Decreto Italiano D.L. no. 22, del y conforme a las directivas de la CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE), todos los desechos originados por procesos manuales y/o automáticos se clasifican como material de deshecho peligroso, código de Clasificación CER : como tales, deben eliminarse delegando su recolección y desecho a empresas especiales autorizadas para ello. RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS El análisis se puede realizar en muestras de suero o plasma extraido sobre EDTA. Las muestras altamente lipémicas o hemolizadas deben descartarse. Las muestras pueden conservarse a 2-8 C durante 1-2 días; para períodos más largos conservar las muestras a - 20 C. Las muestras de plasma pueden presentar filamentos de fibrina que interfieren en el ensayo; asegúrese de que las muestras estén perfectamente limpias antes de dosificarlas. Se recomienda no congelar y descongelar repetidamente de las muestras. M146.es Rev.5 10/2003 Pag. 6/13
7 PROCEDIMIENTO DEL ANÁLISIS * Permita que los reactivos y las muestras se equilibren a temperatura ambiente. Antes de su uso, mezcle las muestras por inversión. 1 - Preparar los pocillos para: Blanco, Calibradores, Sueros de Control y Muestras. 2 - Dispensar 20 µl de cada Calibrador, Suero de Control y Muestra en los pocillos correspondientes. 3 - Dispensar 200 µl de Conjugado Enzimático en todos los pocillos, excepto el blanco. 4 - Cubrir la microplaca con la hoja adhesiva y agitarla delicadamente. 5 - Incubar durante 60 minutos a 37 C. 7 - Retirar la hoja adhesiva y aspirar cuidadosamente la mezcla de incubación de todos los pocillos. 8 - Lavar los pocillos 4 veces con 350 µl de solución de lavado diluida. Aspirar completamente el líquido de todos los pocillos. 9 - Dispensar 200 µl de solución de cromógeno-sustrato (ver párrafo de reactivos) en todos los pocillos Incubat durante15 minutos a 37 C. Evitar la exposición a la luz directa Dispensar 100 µl de reactivo de parada en todos los pocillos Leer la densidad óptica de las soluciones, con un espectrofotómetro bicromático, a 450 nm y a 405 nm, con longitud de onda de referencia de 620 nm (ajustando el instrumento a cero con el pocillo blanco). Leer en los primeros 20 minutos después de terminar el ensayo. * En caso de que se utilice en el procedimiento un sistema automático RADIM y/o SEAC para microplacas, ver el manual correspondiente. ESQUEMA DEL ENSAYO: ver pág. 12 CÁLCULO DE RESULTADOS Si para el procedimiento se utiliza un instrumento automático para microplacas RADIM y/o SEAC, la lectura espectrofotométrica se realiza automáticamente a 3 diferentes longitudes de onda: 450, 405 y 620 nm, permitiendo así la ampliación del rango de lectura. Para obtener una mejor sensibilidad, este método utiliza una lectura espectrofotométrica a dos longitudes de onda (450 y 405 nm). Para las muestras con concentraciones de DHEA-S entre 1 y 10 μg/ml, se debe leer a 450 nm; para muestras con niveles de DHEA-S menores de 1 μg/ml, leer a 405 nm. Trazar la curva de calibración sobre papel milimetrado, registrando sobre el eje de las abscisas las concentraciones de los calibradores, y en el eje de las ordenadas, la absorbancia obtenida para cada uno de los calibradores. Al interpolar sobre la curva de calibración las absorbancias relativas a cada muestra, se obtienen las concentraciones correspondientes de DHEA-S expresadas en μg/ml. EJEMPLO DE CÁLCULO Los valores que se indican a continuación son simplemente ilustrativos y no deben emplearse en lugar de los datos obtenidos. M146.es Rev.5 10/2003 Pag. 7/13
8 Descripción Absorbancia 450 nm DHEA-S Absorbancia 405 nm DHEA-S Calibrador 0 μg/ml > Calibrador 0.1 μg/ml > Calibrador 0.3 μg/ml Calibrador 1.0 μg/ml Calibrador 3.0 μg/ml Calibrador 10.0 μg/ml Muestra 1 > μg/ml Muestra μg/ml Valores normales Los valores registrados en la siguiente tabla son sólo indicativos. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de referencia. Sexo Mujer Hombre Edad µg/ml µg/ml Neonatos Pre-púberes Adultos Embarazo > 50 años Criterios de aceptación Antes de proceder al cálculo de resultados, verifique que la concentración del suero de control esté dentro del rango de aceptación descrito en la hoja de Control de calidad. CARACTERÍSTICAS METODOLÓGICAS ESPECIFICIDAD El antisuero anti-dhea-s utilizado ha mostrado las siguientes reacciones cruzadas: 100% con DHEA-S y DHEA, 19% con androstenediona, 9% con androsterona y menos de 0.01% con testosterona, DHT, 17-OH-progesterona, progesterona y estrona. SENSIBILIDAD La sensibilidad ha sido calculada sobre la curva de calibración y se expresa como la mínima dosis significativamente distinguible de la respuesta respecto al calibrador cero (valor medio: 3 D. E.). Tal dosis es de 0.08 μg/ml. PRECISIÓN La precisión ha sido evaluada midiendo la variabilidad intraensayo e interensayo de 3 sueros con diferentes concentraciones de DHEA-S. Intraensayo (repetibilidad) Suero Media ± D.E. C.V. Replicados (μg /ml) % no. A ± B 1.39 ± C 2.61 ± M146.es Rev.5 10/2003 Pag. 8/13
9 Interensayo (reproducibilidad) Suero Media ± D.E. C.V. Ensayos ( μg /ml) % no. A 0.52 ± B 1.25 ± C 2.48 ± EXACTITUD La exactitud del método ha sido evaluada mediante las pruebas de recuperación y paralelismo: Prueba de recuperación Cantidades conocidas de DHEA-S se añadieron a una muestra de suero y se analizó. Adición Previsto Medición Recuperación (μg/ml) (μg/ml) (μg/ml) % S S S S Prueba de paralelismo Un suero con elevada concentración de DHEA-S se analizó a diferentes diluciones efectuadas con el calibrador cero. Dilución Previsto Medición (μg/ml) (μg/ml) S2 sin diluir : : : LÍMITES DEL ANÁLISIS Los resultados del ensayo se deben interpretar cuidadosamente y confirmar mediante evaluaciones clínicas y otras pruebas diagnósticas. ÍNDICE DE SÍMBOLOS : ver pág. 10 M146.es Rev.5 10/2003 Pag. 9/13
10 SÍMBOLOS EN 980 EDMA REF Código de referencia o número de pedido LOT Lote Fecha de caducidad IVD Para uso diagnóstico in vitro Marcado CE según directiva de IVD 98/79 CE Conservar a 2-8 C Producido por Riesgo biológico Consultar las instrucciones de uso 96 Suficiente para 96 determinaciones RDATE Fecha de referencia RCNS Reconstituir con H 2 O Agua destilada o desionizada M146.es Rev.5 10/2003 Pag. 10/13
11 BIBLIOGRAFÍA 1 - Abraham GE, Manlimos FS: The role of adrenal cortex in hirsutism, The Endocrine Function of the Human Adrenal Cortex edited by VHT James, M. Serio, G. Giusti, L. Martini. New York, Academic Press, 1978, p Abraham GE, Stevenson GW, Chiamori NY: Clinical indications for serum DHEA-S measurements. Clinical Lab. Products 11: 38-42, May Abraham GE: The role of the adrenal cortex in female infertility, The Infertile Female, edited by R. Givens. Chicago, Yearbook Publishers, 1979, p Maroulis GB, Manlimos FS, Abraham GE: Comparison between urinary 17-ketosteroids and serum androgens in hirsute patients. Obstet. Gynec. 49: 454, Lobo RA, Paul WL, Goebelsmann U: Dehydroepiandrosterone sulfate as an indicator for adrenal androgen function. Obstet. Gynecol. 57: 69, Buster JE, Abraham GE: Radioimmunoassay of plasma dehydroepiandrosterone sulfate. Analyt Letters 5: 543, Abraham GE: Evaluation and treatment of the hyperandrogenized woman Endocrinology of the Ovary, edited by R Scholler. Paris, Editions SEPE, 1978 pp Chakmakjian ZH, Abraham GE: Peripheral steroid levels in a patient with virilizing adrenal adenoma. Obstet. Gynecol. 47: 544, Lobo RA, Goebelsmann U: Evidence for reduced 3-β-ol hydroxysteroid dehydrogenase activity in some hirsute women thought to have polycystic ovary syndrome. J Clin. Endocrinol. Metab. 53: 394, Abraham GE, Maroulis GB, Buster JE, Chang RJ, Marshall JR: The effect of dexamethasone on serum cortisol and androgen levels in hirsute patients. Obstet. Gynecol. 47: 395, Granoff AB, Abraham GE: Peripheral and adrenal venous levels of steroids in a patient with virilizing adrenal tumor. Obstet. Gynecol. 53: 111, Abraham GE: Androgens in women: Methodological and pathophysiological aspects, Radioimmunology 1979, edited by CA Bizollon. Elsevier/North Holland Biomedical Press, 1979, pp Abraham GE: Ovarian and adrenal contribution to peripheral steroids during the menstrual cycle in two hirsute women. Obstet. Gynec. 46: 29, Abraham GE: The application of steroid radioimmunoassay to gynecologic endocrinology, in Progress in Gynecology, Vol. VI, edited by Taymore, TH Green. New York, Grune and Stratton, 1975, pp Glass AR, Dahms WT, Abraham GE, Bray GA, Swerdloff RS: Secondary amenorrhea in obesity: Etiologic role of weight-related androgen excess. Fertil Steril 30: 243, Chang RJ, Abraham GE: Effect of dexamethasone and clomiphene citrate on peripheral steroid levels and ovarian function in a hirsute amenorrheic patient. Fertil Steril 27: 640, M146.es Rev.5 10/2003 Pag. 11/13
12 ESQUEMA DE ENSAYO Reac. Pocillos Blanco CAL (0-5) CTR Muestras CAL (0-5) µl CTR µl ---- Muestras µl CONJ µl 200 µl 200 µl Incubar: 37 C 60'. Aspirar y lavar: 4 x 350 µl. TMB SUBS 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl Incubar: 37 C 15'. STOP 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Leer: nm. RADIM S.p.A. - Via del Mare, Pomezia (Roma) Italia Tel.: Fax: National Order Entry: Export Department: Customer Care: info@radim.com -
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