Licenciatura en Ciencia y Tecnología de Alimentos AAA Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Métodos Enzimáticos

Transcripción

1 1 Métodos Enzimáticos 1. Introducción Las enzimas son catalizadores complejos, constituidos por proteínas globulares, que a temperatura en torno a 37 C, aceleran las velocidades de las reacciones químicas por un factor de a respecto de las reacciones no catalizadas. Los catalizadores industriales no enzimáticos tienen eficiencias de órdenes de magnitud inferiores. Es la eficacia catalítica de las enzimas a baja temperatura lo que las hace importantes para el tecnólogo de los alimentos. Esto representa que los alimentos pueden ser procesados o modificados mediante enzimas a una temperatura moderada, C, a la que de otro modo los alimentos sufrirían cambio sólo lentamente. La tremenda capacidad catalítica de las enzimas es consecuencia de la reducción de la energía de activación de las reacciones en que intervienen. En la Tabla 1 se puede observar el aumento en la velocidad de reacción que producen las enzimas, en comparación con catalizadores químicos. En el caso de hidrólisis del grupo amida, por ejemplo, las velocidades de reacción son más de seis órdenes de magnitud en presencia de enzima que en sistemas catalizados por ácidos o bases. De la misma manera ocurre con la conversión de H 2 O 2 en H 2 O y O 2. En el caso de la urea, es aún más notoria la velocidad de actividad enzimática, ya que la diferencia es de 13 órdenes de magnitud. Tabla 1. Velocidades de reacción de reacciones enzimáticas, en comparación con las catalizadas químicamente. Sustrato Catalizador T/K K M -1.s -1 Amida (hidrólisis) H ,4 x 10-6 OH ,5 x 10-6 α-quimotripsina ,9 Urea (hidrólisis) H ,4 x 10-7 Ureasa 294 5,0 x 10 6 Peróxido de Fe hidrógeno (H 2 O 2 ) Catalasa 295 3,5 x 10 7 Las bajas energías de activación de las reacciones enzimáticas indican que la velocidad de reacción tiene poca dependencia con la temperatura, por lo tanto una reducción de la temperatura tiene relativamente poco efecto sobre la velocidad de la reacción. En consecuencia, las enzimas pueden ser bastante activas incluso a temperaturas de congelación y resultar, por ello, importantes estimulantes de las reacciones degradativas en los alimentos refrigerados o congelados. Uno de los fines del tratamiento térmico es desnaturalizar e inactivar de tal modo que los alimentos no se encuentren sujetos a su continua actividad. Otra característica importante de las enzimas, además de su poder catalítico, es su especificidad. Los catalizadores industriales no poseen esta especificidad de reacción. La especificidad de las enzimas permite a los expertos en la ciencia de alimentos modificar selectivamente determinados componentes individuales y no afectar a otros. Su especificidad también permite utilizar a las enzimas como reactivos analíticos sensibles. El análisis de los componentes de los alimentos puede, en muchos casos, simplificarse utilizando las técnicas enzimáticas.

2 2 2. Aplicaciones analíticas de las enzimas. Los métodos analíticos enzimáticos juegan hoy día un rol muy importante en el análisis de alimentos. Ellos permiten la rápida y segura determinación de numerosos compuestos de los alimentos en el laboratorio, incluyendo problemas analíticos que son extremadamente difíciles, si no imposibles, para ser determinados por métodos convencionales. Los requerimientos básicos para el éxito y seguridad en los ensayos enzimáticos están en los reactivos y condiciones de trabajo. 2.a. Determinación de sustancias por medio de enzimas. 2.b. Determinación de actividad enzimática en un dado alimento. 2.a. Determinación de sustancias por medio de enzimas. En este caso las enzimas son usadas como reactivos para catálisis específicas de reacciones químicas. De manera que es una forma especial de análisis químico, en que se dosa el sustrato de una determinada enzima. Las determinaciones enzimáticas de sustratos se emplean en la actualidad como método de rutina, en laboratorios de investigación y desarrollo para la determinación precisa de ingredientes de los alimentos, Ejemplos son: a) la determinación de componentes normalmente presentes en alimentos: glucosa en la miel por su oxidación específica mediante la glucosa-oxidasa y la determinación de ácidos orgánicos como el láctico y el málico con enzimas específicas: la lactato- y la malatodehidrogenasa. También se han elaborado técnicas de análisis enzimáticos para la determinación analítica especifica de ácido cítrico, ácido glutámico, ácido pirúvico, ácido glucónico y glucono-deltalactona, colesterol, sorbitol y diferentes glúcidos en alimentos; b) para determinar la naturaleza y concentración de sustancias extrañas en los alimentos, como antisépticos, antibióticos, pesticidas u otros tóxicos. c) como así también en la evaluación de productos del metabolismo de microorganismos (como por ejemplo piruvato, lactato y amonio en leche, o succinato en huevo). Requerimientos: Disponibilidad de la enzima. Detección sencilla, usualmente por formación de un producto coloreado o con absorbancia al UV. Transformación cuantitativa del sustrato. Para ello es necesario estandarizar condiciones o parámetros de control tales como temperatura, tiempo de reacción, ph, concentración de enzima, etc. Ventajas de este tipo de método Rapidez (en general requiere pocos pasos de preparación de la muestra). Alta especificidad Sensibilidad Precisión. Instrumental sencillo. Pocas interferencias

3 3 Condiciones suaves de reacción. Limitaciones del método: * No todas las sustancias a analizar son posibles sustratos enzimáticos. * Disponibilidad de la enzima. 2.b. Medición de actividad enzimática. Desde el punto de vista analítico, la valoración de la actividad enzimática en los alimentos puede aplicarse para diferentes fines: a) Como indicador del estado higiénico y de conservación de un alimento al determinar la actividad dé alguna enzima producida por microorganismos, por ej., la prueba de la reductasa y catalasa en leche y jugos; b) para controlar tratamientos tecnológicos en alimentos que han sido sometidos a altas o bajas temperaturas, como en el caso de la fosfatasa, peroxidasa y aldehído-reductasa, que se usan para el control de pasteurización y esterilización de leche y de la prueba de la ureasa residual en soja, para demostrar la destrucción total de sus componentes antibiológicos. En el proceso de "blanching, blanqueado o escaldado", el test de peroxidasa es fundamental. c) Medidas continuas de actividades enzimáticas durante el tratamiento, el almacenamiento y en los procesos enzimáticos de maduración pueden suministrar importantes informaciones sobre fenómenos biodinámicos que ocurren en los alimentos; d) Evaluar aptitud para un fin dado. Ej: actividad diastásica (amilásica) en harinas. Límite de detección y sensibilidad Generalmente los términos límite de detección y sensibilidad se emplean indistintamente. Sin embargo, el límite de detección es la mínima cantidad de analito detectable, que es aquella cantidad necesaria para generar una señal que es de una magnitud de dos desvíos estándar por encima de la señal del blanco (solución que contiene todos los componentes excepto el analito). La pendiente de la curva de calibración (señal vs. concentración de analito) se define como la sensibilidad del ensayo; esta pendiente describe cuán de sensible es el ensayo a cambios de la concentración de analito. Si la curva de calibración es no lineal, la sensibilidad es función de la concentración.

4 4 3. Cinética de las Reacciones Enzimáticas 3.a. Cinética del estado estacionario La reacción puede interpretarse como la unión de la enzima con el sustrato a través del sitio activo, que es el responsable de la especificidad de la reacción. La teoría cinética de Michaelis-Menten de la acción enzimática propone la combinación reversible de la enzima (E) con el sustrato (S), formando un complejo intermediario ES, el cual se descompone irreversiblemente para producir productos (P) y la E libre. k 1 k 3 E + S ES P + E k 2 k 1, k 2, k 3. constantes de velocidad de cada una de las etapas de la reacción global. La velocidad de formación del producto está dada por: [ P] d dt [ ES] = v = k 3 (1) donde v es la velocidad de formación del producto. La concentración del complejo enzimasustrato es inicialmente cero pero rápidamente alcanza un nivel máximo, si la concentración inicial de sustrato es mucho mayor que la de la enzima y luego declina lentamente. Entonces en un instante dado la [ES] es aproximadamente constante, por lo que podemos aceptar que existen condiciones de estado estacionario (Fig. 1)

5 5 Por lo tanto [ ES] d dt [ E][ S] k [ ES] k [ ] 0 = k ES (2) Reordenando esta ecuación se obtiene: [ E][ S] k2 + k3 = = K M [ ES] k 1 (3) en donde K M es la constante de Michaelis-Menten. La concentración total de enzima [E 0 ] esta dada por: [ E ] = [ E] + [ ES] 0 (4) Combinando las ecuaciones (3) y (4), obtenemos [ ES] = [ Eo ][. S] + [ S] K M (5) La velocidad de formación de producto será- v = k 3 K [ Eo ][. S] + [ S] M (6) Puede calcularse experimentalmente de la pendiente de una curva de progreso, es decir, de la pendiente de una representación de [P] en función del tiempo de reacción (Fig. 2). A medida que transcurre una reacción enzimática, la línea de progreso va haciéndose curvilínea. Esto

6 6 significa que la velocidad de formación de producto desciende durante el curso de la reacción a causa de la depleción del sustrato. En la ecuación (6) se observa que v se hace cada vez más pequeña a medida que disminuye la [S]. Existen otras razones para que v disminuya a lo largo del tiempo. Si la reacción es reversible su funcionamiento en el sentido inverso va creciendo en importancia al progresar la reacción e irse acumulando el producto. Por otra parte, el producto de la reacción puede inhibir a la enzima. Se acostumbra a tomar como valor de v la pendiente inicial de la curva de progreso (Fig. 2). Si se obtienen valores de v o (velocidad inicial) a diferentes concentraciones de sustrato y se representan luego frente a [S], se obtiene una hipérbola rectangular, como predice la ecuación (6) y muestra la Fig. 3. A medida que aumenta [S] lo hace también v, significativamente a concentraciones de sustrato bajas y lentamente cuanto más altas sean éstas. Cuando [S] >> K m, la velocidad de formación de producto alcanza un valor máximo, al que se denomina V máx ; manteniendo constantes las condiciones de reacción (ph, temperatura, concentración de cofactores, de enzima, etc). Decimos entonces que E se encuentra saturado de S. Como norma general una concentración de 20 x K m de S se considera suficiente para obtener una aproximación válida de V máx. En estas condiciones: [ E ] Vmáx v = k3 0 = (7) Se comprueba en esta ecuación que V máx es independiente de [S], es decir, que la reacción es de orden cero con respecto al sustrato. Por otra parte, V máx es de primer orden con respecto a la enzima. Para un sistema enzimático dado puede lograrse aumentar V máx incrementando la [E 0 ], pero no aumentando [S 0 ].

7 7 Se observa también de la ecuación (6) que a bajas concentraciones de sustrato, la reacción es de orden 1, tanto [S] como para la [E]. La constante de Michaelis-Menten (K M ) constituye una medida de la afinidad de la enzima por el sustrato (a menor K M, mayor afinidad, mayor velocidad de reacción). Cuando la [S] es igual a K M, el término v se hace igual a V máx / 2. Esta constante expresa, por tanto, la concentración de sustrato necesaria para semisaturar a la enzima. Si K M es grande, se precisa una gran cantidad de S para saturar a la E; si K M es pequeña, basta una pequeña cantidad de S para saturarla. La mayoría de las reacciones enzimáticas que utilizan sustratos no muy complejos muestrean valores de K M entre 10-5 y 10-2 M. Los dos parámetros más importantes en la teoría de Michaelis-Menten son K M y V máx. Suelen determinarse por la representación de Lineweaver-Burk. Si tomamos la inversa de la ecuación (6), obtenemos- 1 v K V M = ( ). + (8) MÁX 1 1 [ S] VMÁX que, al representar 1/v en función de 1/[S], corresponde a la ecuación de una recta en la que el punto de intersección en el eje vertical vale 1/V máx, la intersección con el eje horizontal es - 1/K M. Las representaciones de Lineweaver-Burk permiten obtener fácilmente K M y V máx. Estos parámetros también pueden ser obtenidos representando v vs. [S] (Fig. 3), pero con menor precisión. Existen también otras expresiones matemáticas para el cálculo de K M. 4. Factores que influyen en la velocidad de la reacción 4.a. Influencia de la temperatura

8 8 En toda reacción química al aumentar la temperatura se incremento la velocidad de la reacción. En las reacciones enzimáticas se debe tener en cuenta que al aumentar la temperatura se desnaturaliza la enzima, y por lo tanto se inactiva disminuyendo la velocidad. Por lo tanto existe una temperatura óptima de reacción que permite que la velocidad sea la máxima posible. La temperatura influye en forma directa sobre la velocidad de la reacción y a través de su influencia sobre otros factores (el ph de las soluciones buffer, las curvas de absorción, la concentración óptima de los reactivos y la constante K m dependen de la temperatura). Por ejemplo un aumento de temperatura en 1 C conduce a un incremento de aproximadamente el 20% de la actividad. Por lo tanto para comparar datos es fundamental la estandarización de las condiciones. 4.b. Influencia del ph y de la composición de las soluciones buffer. Análogamente debe establecerse una relación de compromiso entre el valor de ph óptimo y la inhibición de la enzima. Al modificar el ph se modifica el estado de ionización de la molécula de enzima, y por lo tanto se modifica la intensidad de las interacciones enzima-sustrato, pero también se modifican las interacciones de la cadena proteica cambiando la conformación de la enzima, lo que conduce a su inactivación. La concentración y la naturaleza del buffer también son importantes ya que éste puede inhibir a la enzima y la actividad enzimática puede modificarse con su concentración. 4.c. Activadores e inhibidores Se los denomina efectores. Las determinaciones deben realizarse en ausencia de inhibidores (detergentes, metales pesados) y deben contener concentraciones suficientes de los activadores que requiera la enzima (ATPasas requieren Mg ++, amilasas requieren Cl - ). 4.d. Coenzimas Las coenzimas son sustancias que cuando se unen con la enzima la transforman en una enzima activa. coenzima + enzima inactiva enzima activa Las coenzimas representan el centro activo o parte del centro activo de la enzima, de manera que participan directamente en la catálisis pero no se regeneran sino que se transforman estequiométricamente. Las más utilizadas son NADH, NADPH (en sus formas oxidadas o reducidas). NADP + nicotinamida adenina dinucleótido fosfato. NAD + nicotinamida adenina dinucleótido. 5. Determinación de la actividad enzimática

9 9 Cuando quiere determinarse el nivel enzimático en un alimento de una dada enzima, no se mide la concentración enzimática (masa de enzima por masa de producto) porque lo que interesa es la cantidad de enzima útil como catalizador, es decir interesa determinar la actividad catalítica o actividad enzimática. Además las enzimas se encuentran en concentraciones muy pequeñas, difíciles de determinar y a veces tampoco se conoce su masa molar. La actividad catalítica se mide en U/l o U/g o en mu/ml o mu/mg (unidades enzimáticas por litro o gramo, miliunidades enzimáticas por mililitro o miligramo). La unidad enzimática internacional (I.U.) es la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 μmol de sustrato por minuto (en las condiciones determinadas de la prueba: T, ph, concentración de sustrato, etc.) I.U. = μmol/min. La actividad específica se define como las I.U. por unidad de masa (bajo dadas condiciones de ph y T), generalmente se expresa en I.U. por mg de enzima sólida y es una medida de la pureza. En el sistema internacional S.I. la unidad es el Katal que es la cantidad de enzima que consume 1 mol de sustrato por segundo Determinación directa Este método presenta la medición del: - Descenso de la concentración de sustrato. - Aumento de uno de los productos - Cambio de concentración de coenzimas. Las determinaciones de actividad enzimática se realizan con una concentración de sustrato saturante, de esta manera la reacción es de orden cero, y la velocidad inicial de reacción es proporcional a la concentración enzimática. Cuando se consigue estar en esta zona de orden cero, la velocidad de aparición del producto es lineal con el tiempo. Es conveniente registrar la aparición de producto y no la disminución de sustrato, ya que éste se encuentra en altas concentraciones iniciales para asegurar saturación, y será menos sensible determinar la variación de su concentración que la del producto. Se trabajará a ph, T, y [buffer] óptimos. En la Fig. 4 se muestran las curvas de progreso a diferentes valores de [E 0 ] Tales curvas son lineales inicialmente, pero finalmente se tornan curvilíneas; por las razones que se explicaron anteriormente. La pendiente inicial de la curva de progreso, equivale a la V máx para cada [E 0 ] ya que se está trabajando siempre a saturación de la enzima ([S 0 ] >> K m ).

10 10 Las pendientes iniciales de cada curva de progreso pueden ser representadas frente a los correspondientes valores de [Eo] para obtener una curva patrón para la determinación de actividad enzimática, (Fig. 5). Las curvas que relacionan la velocidad de formación del producto con la concentración de enzima son especialmente útiles en su tramo lineal. En éste la pendiente es: dv de o o [ P] = cons tan te = (9) t 1 donde v o es la velocidad inicial de formación de producto. La ecuación (9) indica que v 0 es proporcional a [E 0 ]

11 11 Al determinarse la actividad catalítica de una enzima, deben observarse las siguientes normas: Es preferible medir las velocidades iniciales empleando técnicas de seguimiento contínuo. Las determinaciones de enzimas suelen efectuarse con [S] 20 veces K m. Esto asegura la máxima velocidad de reacción. Las condiciones de reacción deben ser constantes y han de ser descriptas al informar los resultados. Debe determinarse la velocidad de la reacción en ausencia de enzima, empleando una preparación enzimática inactivada por calentamiento. Debe determinarse también la cantidad de enzima utilizada, de forma que pueda calcularse la actividad específica, ya que la enzima puede constituir sólo una pequeña parte del total Análisis a tiempo fijo: Tiene la ventaja que ahorra tiempo y dinero. Pero se debe tener la precaución de tomar el tiempo fijo cuando se está seguro de que la curva de progreso es lineal durante cierto período de tiempo. Si dentro de ese período medimos [P] en un momento dado, t 1, el cociente [P]/t 1 = v o (velocidad inicial de formación de producto) Esto es lo que simplifica el análisis. No es necesario medir una serie de valores de [P] a lo largo del tiempo. Pero es preciso reiterar que la curva de progreso debe ser lineal durante el tiempo elegido, t 1. Si es curvilínea, [P]/t 1 no será igual a v o Análisis con enzimas acopladas A veces no es conveniente o resulta imposible determinar directamente el producto de una reacción enzimática. Sin embargo, el citado producto puede servir como sustrato para

12 12 una segunda enzima, de forma que se obtiene un segundo compuesto que puede ser medido convenientemente. En este caso, puede llevarse a cabo un análisis con enzimas acopladas. El sistema enzimático a ensayar se acopla con una segunda enzima, que sirve como indicadora para la primera. En esta situación tendremos: E 1 E 2 A B C Siendo A el sustrato para E 1, la enzima a ensayar, B el producto de la acción de E 1 sobre A y también sustrato de E 2, la enzima acoplada o indicadora. C es el producto de E 2. El objetivo es seguir la velocidad de formación de C para determinar la actividad enzimática de E 1. La velocidad de la reacción de la enzima indicadora debe ser, por lo menos, 100 veces mayor que la de aquella cuya actividad se quiere medir. La reacción indicadora puede ser también de naturaleza química en vez de enzimática, siempre que el producto de la primera se convierta cuantitativamente y rápidamente en una segunda especie. Para poder emplear una segunda reacción como indicadora es necesario que se cumplan dos condiciones básicas: La velocidad de desaparición de A debe ser de orden cero respecto de A y la reacción debe ser irreversible. La velocidad de formación de C debe ser de primer orden respecto de B y esta reacción también debe ser irreversible. Si la velocidad de desaparición de A es de orden cero respecto de A e irreversible, ésta es función solamente de [E 1 ]. Se cumplirá esta condición si [A 0 ] >> K MA o si durante el período de análisis sólo se consume una pequeña cantidad de A. Puede aceptarse que la reacción será irreversible, puesto que B es retirado del sistema por la actividad de la enzima acoplada. Podemos estar seguros que la velocidad de aparición de C es de primer orden con respecto a B si [B] en estado estacionario << K MB. Esto puede lograrse efectuando el análisis con un exceso de E 2. Podremos asegurar que esta segunda etapa será esencialmente irreversible si el análisis se efectúa en un corto período de tiempo, para evitar la acumulación de C. Si se cumplen todas éstas condiciones básicas, tras un corto período de latencia, la velocidad de aparición de C será constante y proporcional a [E 1 ]; dado que las reacciones ocurren en estado estacionario. 6. Determinación de sustrato Por su gran especificidad las enzimas pueden ser utilizadas para el análisis de componentes de los alimentos sin necesidad de purificarlos previamente. Además muchas de las reacciones enzimáticas son muy sensibles y permiten determinar incluso g de material.

13 13 Cuando se utilizan enzimas para la determinación de sustratos, es importante controlar estrictamente las condiciones en que tiene lugar la reacción. Dado que lo que se desea analizar es el sustrato, éste debe ser el componente limitante del sistema. Por lo tanto, los activadores y cofactores, por ejemplo deben encontrarse en cantidad suficiente para saturar a la enzima. La concentración de sustrato puede ser determinada de dos modos: Método de equilibrio o de conversión total. Se permite que la reacción se complete y se mide la cantidad de producto formado por métodos físicos o químicos específicos. Método cinético. Se basa en operar a concentración fija de enzima en condiciones tales que la velocidad de reacción sea proporcional a la concentración de sustrato (o de un activador o inhibidor, si es éste el que se desea determinar). Cuando [S] es muy baja ( [S 0 ] < 0.2 K m ) las curvas de progreso deben ser lineales. De la ecuación (6): [ E o ]. [ S] K3 v = (10) K M Para obtener una gráfica patrón que relacione la velocidad de formación de producto con la concentración de sustrato, se construyen curvas de progreso a diferentes valores de [S 0 ] y sus pendientes se representan en función de la concentración de sustrato correspondiente Seguimiento de las reacciones 6.1.a. Si el producto de la reacción es coloreado, su concentración puede determinarse por métodos colorimétricos, es decir, midiendo la absorbancia en el espectro visible. Ejemplos de éstos son: Las mediciones con oxidasas: se transfiere H desde el sustrato al 0 y se forma H como intermediario. Luego éste reacciona con una leucobase en presencia de peroxidasa y se forma un colorante que se mide en el visible. Alternativamente el H puede reaccionar con NADH en presencia de NADH:POD (por ejemplo en la determinación de sulfito). POD:peroxidasa. De esta manera, las reacciones indicadoras con la enzima peroxidasa puieden emplearse para el seguimiento de cualquier reacción que produzca peróxido de H. Ejemplos Determinación de glucosa: Medición de Sacarosa

14 14 La medición de sacarosa requiere tres enzimas: invertasa, mutarotasa y glucosa oxidasa. La invertasa convierte sacarosa a glucosa y fructosa. Mutarotasa permite la rápida conversion de alfa-d-glucosa a beta-d-glucosa hasta que se establece el equilibrio. Luego beta-d-glucosa se oxida en presencia de glucosaoxidasa, produciendo peróxido de hidrógeno, que en presencia de peroxidasa oxida a un reactivo cuyo producto absorbe en el visible. 6.1.b. Si en la reacción intervienen coenzimas puede determinarse la formación (o el consumo) de la especie reducida por espectrometría en el UV. La medición de analitos con deshidrogenasa o reductasas vía la formación o consumo de NAD(P)H es ventajosa, ya que los coeficientes de extinción que se usan para los cálculos son perfectamente conocidos y las reacciones están libres de interferencias. Las formas reducidas de las coenzimas NAD y NADP absorben a 334, 340 y 365 nm, por lo tanto se puede medir su formación o consumo. En la Fig.6 se muestra el espectro de absorción del NAD(P) y NAD(P)H. Por ejemplo, además de emplear una oxidasa para la determinación de glucosa, como se discutió previamente, alternativamente, se puede emplear una hexoquinasa como primera enzima, y glucosa 6P deshidrogenasa como 2da. enzima: Glucosa + ATP -- Glucosa 6P + ADP Glucosa 6P + NADP P glicérico + NADPH + H +

15 15 En base a la absortividad molar de los productos, el ensayo de glucosaoxidasa/peroxidasa se espera que tenga mayor sensibilidad y menor límite de detección.

16 16 Otros ejemplos: a) Ensayo para la determinación de ácido cítrico (y/o su sal citrato). El ácido cíítrico (o su sal, citrato) es convertido en oxaloacetato y en acetato en una reacción catalizada por la enzima citrato liasa (CL). (1) Citrato CL Oxaloacetato + acetato En la presencia de la enzimas L-malato deshidrogenasa (L-MDH) y lactato deshidrogenasa (L-LDH), el oxaloacetato y su producto descarboxilado: el piruvato, son reducidos a L- malato y L-lactato respectivamente por la nicotinamida dinucleótido adenina (NADH). (2,3). (2) Oxaloacetato + NADH + H + L-MDH L-malato + NAD + (3) Piruvato + NADH + H + L-LDH L-lactato + NAD + La cantidad de NADH oxidada en las reacciones (2) y (3) es estequiométricamente igual a la cantidad de citrato presente en la muestra. NADH se determina espectrofotométricamente por su absorbancia en las longitudes de onda 334, 340, 365 nm. b) Determinación de lactosa La lactosa se hidroliza a D-glucosa y D-galactosa a ph 6,6 en presencia de la enzima β- galactosidasa y aguar (1). (1) Lactosa + H 2 O D-glucosa + D-galactosa D-galactosa se oxida a ph 8,6 por (NAD) a ácido D-galactónico en presencia de la enzima β- galactosa deshidrogenasa (Gal -DH) (2). (2) D-galactosa + NAD+ ácido D-galactónico + NADH + H+ La cantidad de NADH formado en la reacción (2) está estequiométricamente relacionado con la cantidad de lactosa y D-galactosa respectivamente. El aumento de NADH se determina por la medida de absorbancia a 340 nm.

17 c Acoplamiento NADH-diaforasa: las reacciones de formación se acoplan a la reacción catalizada por diaforasa que transfiere H al iodonitrotetrazolio (INT). Se forma un colorante formazán que se mide en el visible. Sales de tetrazolio: amarillentas Formazán: rojizos Diformazanes: azules 7. Kits enzimátícos El primer paso en el desarrollo de los kits enzimáticos en alimentos fue adaptar los métodos enzimáticos de análisis clínicos al análisis de alimentos, y luego se desarrollaron métodos especiales. Estos kits contienen reactivos seleccionados y probados, y se encuentran en las calidades adecuadas. Las ventajas que proporcionan dichos métodos son: Considerable ahorro de tiempo. Seguridad analítica. Fácil chequeo. Por otro lado muchos de ellos han sido publicados como métodos de referencia o como parte de leyes nacionales, y fueron estandarizados por comités internacionales.

18 18 En el AOAC (Association of Analytical Communities, que publica los métodos oficiales de análisis) se introdujeron los métodos enzimáticos como métodos oficiales a partir de 1995, por ejemplo: L málico en jugo de manzana. glucosa / fructosa en vino. ácido cítrico en vino. CO 2 en vino. Almidón en cereales. 1-4 βd glucanos en cebada y avena, cereales listos para comer. Fibra Lactosa en leche Etanol en vinos En la actualidad hay otros más. 8. Consideraciones prácticas para los ensayos enzimáticos. Con cualquier ensayo que involucre enzimas, debe tenerse cuidado de que éstas no se desnaturalicen: evitar temperaturas por encima de 40 C, valores de ph por encima de 9 o por debajo de 5, presencia de solventes orgánicos, agentes surfactantes, metales. Siempre conservar en frío, aún las preparaciones liofilizadas (las suspensiones en heladera, las liofilizadas pueden almacenarse en freezer). Algunas enzimas se adsorben fuertemente al vidrio, por eso muchas veces las preparaciones enzimáticas tienen un exceso de proteína inerte, como albúmina, para evotar prérdida de actividad. Las formas reducidas de las coenzimas piridínicas NADH y NADPH son sensibles a la luz, humedad y altas temperaturas. Las formas oxidadas son más estables, pero igual requieren cuidado en su manipuleo. Debe cuidarse también la solución buffer, en lo posible prepararla en esterilidad.