Enzimas: catalizadores biológicos

Transcripción

1 Enzimas: catalizadores biológicos Son capaces de aumentar la velocidad de reacciones químicas. Son muy eficientes, específicas y no se consumen en la reacción. PUEDEN AUMENTAR LA VELOCIDAD DE LA REACCION MAS DE UN MILLON DE VECES

2 Cinética enzimática Estudia cómo cambia la velocidad de reacción (v o ) en respuesta a la modificación de diferentes factores: concentración de ligandos (sustratos, inhibidores y activadores) concentración de enzima condiciones ambientales (ph, temperatura, fuerza iónica)

3 Qué es v o y cómo se determina experimentalmente? A tiempos muy cortos (iniciales) las graficas de [P] vs tiempo son lineales. A tiempos mayores se puede inactivar E, se da la reacción inversa, se consume S, puede haber inactivación por P.

4 V = velocidad de formación del producto CANTIDAD DE PRODUCTO FORMADO POR UNIDAD DE TIEMPO UTILIZANDO UNA CONCENTRACION DE ENZIMA FIJA PUEDO REALIZAR CINETICAS VARIANDO LA CONCENTRACION DE SUSTRATO Y DETERMINAR LAS VELOCIDADES INICIALES O Vo PARA CADA CONCENTRACION DE SUSTRATO. 4

5 Relación observada entre la velocidad inicial (v 0 ) y la concentración inicial de sustrato ([S] 0 ) Cada velocidad determinada experimentalmente Variando la concentración de sustrato Manteniendo constante la cantidad de enzima Velocidad V o Concentración de Sustrato

6 Los estudios cinéticos proporcionan información acerca: DEL MECANISMO DE REACCION LA ESPECIFICIDAD DE LA ENZIMA DE CUALES MOLECULAS INHIBEN O ACTIVAN DICHA ENZIMA

7 MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN Propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de NUMEROSAS ENZIMAS FORMACIÓN DEL COMPLEJO ENZIMA- SUSTRATO

8 Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: - Formación del complejo ES - Formación del producto P, liberando el enzima libre E k 1 k -1 k cat E + S ES P + E En este esquema, k 1, k -1 y k cat son las constantes cinéticas individuales de cada proceso y también reciben el nombre de constantes microscópicas de velocidad. v 1 = k 1 [E] [S] v 2 = k -1 [ES] v 3 = k cat [ES] Se asume que la reacción inversa de P+E, a EP y luego a ES se produce tan poco que la podemos ignorar

9 Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado estacionario, según la cual la concentración del complejo ES es pequeña y prácticamente constante a lo largo de la reacción. Por tanto, la velocidad de formación del complejo enzima-sustrato (v 1 ) es igual a la de su disociación (v 2 + v 3 ): v 1 = v 2 + v 3 k 1 k -1 k cat E + S ES P + E Además, como [ES] es constante, la velocidad de formación de los productos es constante: v = v 3 = k cat [ES]

10 En el estado estacionario [ES] es prácticamente constante: d[es]/dt=0 k 1 k -1 k cat E + S ES P + E Velocidad de disociación de ES = velocidad formación de ES Velocidad de disociación de ES = (K -1 + K cat )[ES] Velocidad de formación de ES =K 1 [E][S] (K -1 + K cat )[ES] - K 1 [E][S] = 0

11 (K -1 + K cat )[ES] - K 1 [E][S] = 0 Despejamos [ES] [ES] = k 1 [E][S] (K -1 + K cat ) Dado que la enzima libre [E] es igual a [Eo]-[ES] puedo reescribir la ecuación como: Reordenando y definiendo la constante K M como (K -1 +K cat ) [ES]=( K 1 ) ([Eo]-[ES]) [S] K-1 + Kcat ES K 1 E 0 K M S S

12 k 1 k -1 k cat E + S ES P + E Tenemos que Recordando que ES K M como (K -1 +K cat ) K 1 E 0 K M V = K cat [ES] S S V 0 k K E cat 2 0 M Ecuación de S S Michaelis-Menten Para cualquier reacción enzimática, [E o ], k cat y K M son constantes

13 Qué ocurre cuando [S] >>> K m? A altas [S], el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]. En este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (V max ). cuando [S] >>> Km estamos en V max GRAFICO DE Michaelis-Menten v o = k cat [E o ][S] K m + [S] como la K m es muy baja respecto a [S], la k m despreciable, v o = k cat [E o ] [S] [S] v o = k cat [E o ] a V max todos los sitios activos están ocupados y no hay casi moléculas de enzima libre E por lo cual [ES]=[Eo] por lo tanto v = K cat [ES] puedo expresarla como v = K cat [Eo] = V max v o = V max [S] K M + [S]

14 k cat denominada constante catalítica o número de recambio cuando la [S] >>> Km por lo tanto v = K cat [ES] puedo expresarla como v = K cat [Eo] = V max Útil para reacciones donde entran en juego varias constantes de velocidad ya que esta constante de velocidad describe el pazo limitante en condiciones de saturación. Esta constante de denomina constante catalítica k cat o número de recambio. Es una constante de velocidad de primer orden igual al número de moléculas de S procesadas por sitio activo dela E en cada segundo cuando todos los sitios activos están ocupados. V MAX = k cat [E o ] k cat =V MAX /[E o ] Tiene unidades de tiempo -1 y es expresada en s -1 Entonces si sabemos la V MAX y la [E o ] podemos calcular k cat para cada enzima/sustrato 14

15 K cat (constante catalítica) número de moléculas de S procesadas por la molécula de E cada segundo COMPARACION DE K cat DE DIFERENTES ENZIMAS

16 Qué ocurre cuando [S] <<< K m? Cuando [S] es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden. v o = Vmáx [S] Km + [S] como la [S] es muy baja respecto al Km, [S] es despreciable, v o = Vmáx [S] Km En este caso v o tiene una dependencia lineal con la [S]. Qué ocurre cuando v o = ½ V máx? despejando queda que Km = [S] Km es la [S] a la cual v = ½ V max Km representa la cantidad de sustrato necesaria para fijarse a la mitad de la E disponible y producir la mitad de la V max

17 K m Es una constante que tiene unidades de concentración. Si para una E y S determinados contamos con el valor de km esto nos permitirá: - conocer la fracción de sitios activos que están ocupados a una [S] dada: - conocer la concentración celular de [S] aproximada -conocer la [S] necesaria para una catálisis significativa La Km como cociente de constantes de velocidad de la reacción K m = k -1 + k 2 k 1 y si k 2 <<< k -1 Km = k -1 k 1 y como la constante de disociación del complejo ES viene dado por: K ES = [E][S] = k -1 [ES] k 1 Solo en esta situación la km da idea de la afinidad 17 de la E por el S

18 K m = k -1 k 1 K M alto = asociación débil entre ES (k 1 pequeña) = baja afinidad de E por el sustrato K M bajo= asociación fuerte entre ES (k 1 grande) = alta afinidad de E por el sustrato.

19 cuando la [S] <<< Km v o = k cat [E o ] [S] Km La constante de especificidad k cat /K M La relación k cat /Km es equivalente a la constante de velocidad para la reacción entre E y S. -v o depende de [E o ] y [S] por lo tanto es una ecuación de segundo orden y la constante k cat /Km tiene unidades de Molar -1 segundos -1. Es una constante útil para comparar la eficiencia catalítica de diferentes enzimas, o una enzima respecto a dos sustratos diferentes. - En las células, las reacciones nunca se encuentran en condiciones de V MAX (pero in vitro la pueden alcanzar) - Los sustratos se encuentran generalmente en el orden de concentración μmolar, las enzimas en el orden de concentración nanomolar. El limite superior de k cat /K M es la constante de difusión (10 9 M -1 s -1 )

20 Comparar valores de eficiencia catalítica o Kcat/K m 20

21 21

22 vo (microm/min) Cómo determino experimentalmente V MAX y K M? Utilizando [E] fija puedo realizar varios ensayos cinéticos variando [S] y determinar v o para cada [S] ensayada. 5 4 vo Hyperbl Fit of vo 3 2 Equation y = P1*x/(P2 + x) Adj. R-Square 0,9967 Value Standard Error vo P1 6, ,28758 vo P2 1,2246 0, ,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 [S] (mm)

23 Curva de mejor ajuste a la ecuación de Michaelis-Menten Fosfatasa silvestre PtpA Fosfatasa mutada D126A PtpA D126A evita problemas asociados a las linearizaciones Referencia donde profundizar Tommasini, R., Endrenyi, L., Taylor, P. A., Mahuran, D. J., Lowden, J. A. (1985) A statistical comparison of parameter estimation for the Michaelis-Menten kinetics of human placental hexosaminidase. Can. J. Biochem. Cell Biol. 63,

24 V max k cat K m (mmol pnp min -1 m (sec -1 ) (mm) PtpA silvestre PtpA D126A

25 Linearización de la ecuación de M-M Gráfico de dobles recíprocos o de Lineweaver-Burk

26 Grafico de Hanes-Wolff

27 REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Una molécula de enzima no tiene por qué actuar siempre a la misma velocidad. Su actividad puede estar modulada por: cambios en el ph cambios en la temperatura presencia de cofactores las concentraciones del sustrato y de los productos finales presencia de inhibidores modulación alostérica modificación covalente 27

28

29 29

30 INHIBICION COMPETITIVA Al aumentar la [I] mayor [S] será necesaria para lograr una velocidad dada. Si aumento luyo la [S] puedo revertir la inhibición y llegar a Vmax Veré efecto en el Km, aumenta 30

31 V max no se altera, K m aumenta 31

32 INHIBICION NO COMPETITIVA El inhibidor puede unirse a la enzima libre y también al complejo ES. Aunque aumente la [S] no se logra llegar a valores de Vmax, El Km no cambia, hay menos enzima disponible, pero el S se une con la misma afinidad al sitio activo de la enzima. 32

33 K m no se alterad, V max disminuye 33

34 Ejemplo de inhibidores La penicilina, inhibe una transpeptidasa implicada en la síntesis de péptidogilcano, componente fundamental de la pared celular bacteriana. 34

35 MODULACIÓN ALOSTÉRICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Hay enzimas que pueden adoptar 2 conformaciones interconvertibles llamadas R (relajada) y T (tensa). R es la forma más activa porque se une al sustrato con más afinidad. Las formas R y T se encuentran en equilibrio R <==> T Ciertas sustancias tienden a estabilizar la forma R. Son los llamados moduladores positivos. El propio sustrato es a menudo un modulador positivo. Las moléculas que favorecen la forma R pero que actúan sobre una región del enzima distinta del centro activo son los activadores alostéricos 35

36 Enzimas alostéricas (del griego allos-otro y stero-tridimensional) Tienen dos o mas lugares de unión que interactúan entre si Se cree que la mayoría de las proteínas son alostéricas La enzima puede existir en una conformación activa e inactiva Proteína que cambia de una conformación a otra cuando se une a otra molécula o cuando es modificada covalentemente, el cambio de conformación altera la actividad de la proteína 36

37 LAS ENZIMAS ALOSTERICAS NO OBEDECEN LA CINETICA DE MICHAELIS-MENTEN ENZIMAS MULTIMERICAS, MAS DE UN SITIO ACTIVO EFECTO COOPERATIVO: La unión de la primera molécula de ligando incrementa la afinidad de la otra subunidad por la misma molécula de ligando 37

38 Las actividades catalíticas están reguladas para controlar la compleja red de vías metabólicas Se requieren elaborados controles para regular CUANDO y a que VELOCIDAD tiene lugar cada reacción. 38

39 LOS COMPLEJOS MULTIENZIMATICOS AYUDAN A INCREMENTAR LA VELOCIDAD DEL METABOLISMO CELULAR 39 Figure 3-54a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

40 Figure 3-54b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) 40